在3D甲基纤维素基水凝胶中培养巨核细胞，以改善细胞成熟并研究僵硬和禁闭的影响

摘要

现在人们承认，细胞的三维环境可以在它们的行为，成熟和/或分化中发挥重要作用。该协议描述了一个三维细胞培养模型，旨在研究物理遏制和机械约束对巨核细胞的影响。

摘要

导致限制和机械约束的3D环境越来越被认为是细胞行为的重要决定因素。因此，3D培养已被开发出来，以更好地处理 体内 情况。巨核细胞与骨髓中的造血干和祖细胞（HSPCs）（BM）分化。BM是身体最柔软的组织之一，局限于骨骼内。骨骼在细胞尺度上伸展性差，巨核细胞同时受到弱僵硬和高限制。该协议提出了一种通过免疫磁性分选回收小鼠谱系阴性（Lin-）HSPCs的方法，并在由甲基纤维素组成的3D培养基中将其分化为成熟的巨核细胞。甲基纤维素对巨核细胞无反应，其硬度可调整至正常骨髓的硬度或增加以模仿病理性纤维化骨髓。方案中还详细介绍了回收巨核细胞以进行进一步细胞分析的过程。虽然在3D环境中阻止了丙酸盐的延伸，但下面描述了如何在液体培养基中重悬巨核细胞并量化它们延伸丙酸盐的能力。与在液体环境中生长的巨核细胞相比，在3D水凝胶中生长的巨核细胞具有更高的形成丙酸盐的能力。这种3D培养允许i）区分祖细胞，使其达到更高的成熟状态，ii）概括可能在体内观察到但在经典液体培养 物中 未被注意的表型，以及iii）研究由3D环境提供的机械线索诱导的转导途径。

引言

体内的细胞经历复杂的3D微环境，并受到化学和机械生理线索之间的相互作用，包括组织的僵硬和由于邻近细胞和周围基质^1，2，3而导致的限制。 僵硬和限制对细胞行为的重要性直到最近几十年才得到认可。2006年，Engler等人⁴的开创性工作强调了机械环境对细胞分化的重要性。作者证明，细胞底物刚度的变异导致干细胞朝向各种分化谱系的方向。从那时起，机械线索对细胞命运和行为的影响越来越得到认可和研究。尽管它是生物体中最柔软的组织之一，但骨髓具有限制在骨骼内的3D结构组织。骨髓刚度虽然在技术上难以精确测量，但估计在15和300 Pa ^5，6之间。在基质中，细胞彼此紧密地限制。此外，它们中的大多数正在向正弦血管迁移以进入血液循环。这些条件对相邻单元产生了额外的机械约束，这些单元必须适应这些力。机械线索代表了一个重要的参数，其对巨核细胞分化和丙酸盐形成的影响最近刚刚被探索出来。尽管巨核细胞可以在体外区分传统的液体培养物，但它们没有达到在体内观察到的成熟度，部分原因是缺乏来自3D环境的机械线索⁷。嵌入水凝胶中的不断增长的祖细胞带来了液体环境中缺乏的3D机械线索。

水凝胶在血液学领域已被广泛使用了几十年，特别是在集落形成测定中生长细胞以量化造血祖细胞。然而，这种水凝胶很少用于探索3D机械环境对造血细胞成熟和分化的生物学影响。在过去的几年中，我们的实验室使用基于甲基纤维素的水凝胶 ⁸开发了3D培养模型。这种非反应性物理凝胶是模拟天然巨核细胞环境的物理约束的有用工具。它通过用甲醇基团（-OCH_3）取代羟基残基（-OH）从纤维素中提取。甲基取代度和甲基纤维素浓度决定了水凝胶在果冻后的刚度。在该技术的开发阶段，证明30至60 Pa范围内的杨氏模量是巨核细胞生长的最佳凝胶刚度 ⁹。

以下方案描述了在3D甲基纤维素水凝胶中培养小鼠巨核细胞祖体的方法。先前已经表明，与标准液体培养物相比，该水凝胶培养物增加了巨核细胞多倍化的程度，改善了成熟和细胞内组织，并增加了巨核细胞在液体培养基中重悬后延长丙酸盐的能力 ⁹。本手稿详细描述了分离小鼠骨髓Lin−细胞的方案，并将其嵌入甲基纤维素水凝胶中进行3D培养，以及量化其产生丙烯酸盐的能力和回收细胞以进行进一步分析。

研究方案

所有实验都应符合照管和使用实验动物的机构指南。视频中显示的所有协议均严格按照欧洲法律和法国桑省议会（EFS）审查委员会的建议执行。该协议的第一个版本最初于2018年发表在《 ^{分子生物学方法}8》上。

注: 图1 显示了整个过程的示意图。该过程包括1）骨髓细胞的骨解剖，骨髓检索和机械分离，2）谱系阴性（Lin-）细胞的磁选，3）在液体或甲基纤维素水凝胶中接种，以及4）重悬在3D凝胶中生长的巨核细胞以检查液体培养基中的丙酸盐形成。

1. 从成年小鼠收集骨骼

注意:在本节中，尽量减少微生物污染非常重要。

1. 用Dulbecco的改良鹰培养基（DMEM）准备15毫升的骨收集管，其中含有青霉素 - 链霉素 - 谷氨酸（PSG）抗生素混合物（青霉素10000 U / mL，链霉素100000μg/ mL和L-谷氨酰胺29.2mg / mL）总体积的1%。
   注意:如果使用的所有小鼠具有相同的基因型，请将所有骨骼汇集在同一管中，每只小鼠含有1 mL DMEM - PSG 1%。抗生素对于防止在骨采样期间可能的细菌增殖非常重要。
2. 在50 mL管中加入70%乙醇进行骨骼消毒，另一个用于在手术过程中冲洗器械。使用灭菌的解剖器械。
3. 使用异氟醚吸入（4%）麻醉小鼠，并迅速进行宫颈脱位以安乐死小鼠。快速将身体浸入70%乙醇中，以消毒并避免微生物污染。
4. 快速解剖胫骨和股骨。
5. 使用手术刀切除胫骨踝侧端和股骨髋侧端的骨骺。
6. 将骨头浸入70%乙醇中一秒钟，然后将其浸入含有1%PSG的DMEM培养基中。

2. 骨髓解离和林细胞分离

注:该协议的这一部分是在层流罩下执行的。对于一种培养物，所有孔都是同一实验的一部分，不能被视为独立的生物重复。来自所有小鼠的细胞汇集在一起，以确保所有孔的均匀性，并能够将它们相互比较，同时消除可能的个体间变异性。对于独立的生物重复，必须重复培养。

1. 将骨头放入培养皿中，并在无菌的Dulbecco磷酸盐缓冲盐水（DPBS）中将其升高两次，以去除潜在的污染物。
2. 在50 mL管中制备DMEM - 1%PSG。
   注意:为实验提供2 mL DMEM - 每只小鼠1%PSG。
3. 填充装有DMEM - 1%PSG的21号针头的5 mL注射器。
4. 用镊子固定骨头，只在膝盖侧端引入针的斜面。
   注意:膝关节侧骨骺应从夹层中保持完整，在其中心留下一个小腔，通过该腔插入针头。剩余的骨骺将在冲洗过程中保持附着在针头上的骨。注意不要在骨头中引入超过斜面的斜面，因为它可能会压扁并损坏骨髓。
5. 快速按下注射器柱塞，将骨髓冲洗到50 mL管中。
   注意:为避免飞溅并促进骨髓冲洗和解放，将骨头的自由端放在管壁上，浸入DMEM - 1%PSG中。在实践中，500μL至1mL之间的体积通常足以从骨骼中排出骨髓。当骨髓完全被排出时，骨头就变白了。如果骨髓没有像一些剩余的红色判断的那样完全从骨赘中排出，则可以用新鲜的介质重复冲洗。
6. 重复步骤 2.4。和 2.5.对于所有骨骼，如有必要，用DMEM - 1%PSG重新填充5 mL注射器。
7. 使用与21号针头相同的5 mL注射器将含有冲洗骨髓的培养基的总体积转移到圆底的10 mL管中。
   注意:并非绝对有必要切换到圆底10 mL管，但它可以更容易地进行以下解离步骤。如果怀疑有污染风险，请不要犹豫，更换注射器和/或针头。
8. 通过21号针头连续吸出和排出培养基和骨髓细胞两次，通过23号针吸出和排出三次，通过25号针刺一次，进行细胞解离。
   注意:避免气泡，因为它可能对细胞有害。
9. 将悬浮液转移到15 mL管中。
10. 测量细胞数量并使用自动细胞计数器或细胞室在台盼蓝存在下进行手动计数以排除死细胞的活力。
11. 将15 mL管在300 x g下离心7分钟。使用 1 mL 转印移液器，小心地移出并丢弃上清液。
12. 使用小鼠造血细胞分离试剂盒通过阴性免疫磁性分选分离干细胞和祖细胞。
    注意:该细胞分选的目的是检索所有选择抗体（CD5，CD11b，CD19，CD45R / B220，Ly6G / C（Gr-1），TER119，7-4）阴性的细胞，从而消除已经参与巨核细胞以外的分化谱系的细胞。
13. 按照试剂盒说明，将细胞沉淀重悬于新鲜制备的M培养基（PBS，胎儿牛血清（FBS）最终体积的2%，EDTA 1mM）至10×10⁸ 个细胞/ mL的浓度，并将悬浮液分布在圆底5 mL聚苯乙烯管中，最大体积为2 mL。
14. 加入聚苯乙烯管中:浓度为50μL / mL的正常大鼠血清以及生物素化抗体混合物（CD5，CD11b，CD19，CD45R / B220，Ly6G / C（Gr-1），TER119，7-4），浓度为每mL50μL混合物，并通过轻轻轻地轻拂管来均质化。
    注意:这些抗体将与已经参与分化途径的细胞结合，但巨核细胞途径除外。
15. 将管子在冰上孵育15分钟。
16. 加入链霉亲和素包被的磁珠，浓度为75μL/mL，并通过轻轻轻拂管进行均质化。
17. 在冰上再次孵育10分钟。
18. 如有必要，用M培养基调节至每管2.5 mL的最终体积。
19. 在将没有盖子的管子放入磁铁中之前，轻轻轻地轻拂管子，使悬浮液均质化，并等待三分钟。
    注意:已经进入分化途径并涂有磁珠的细胞将保留在磁铁内的管壁上。
20. 反转磁铁和管将管内含物转移到新的圆底5 mL聚苯乙烯管中。
    注意:请勿将管子从磁铁中取出以进行转移;它是通过反转磁铁而使管子仍在其中来完成的。使用稳定的运动，不要摇晃管子。
21. 丢弃含有不需要的磁性标记细胞的初始管，并将没有盖子的新管放入磁铁中三分钟。
22. 如步骤2.20所示，将分离的Lin−细胞转移到新的15 mL管中。
    注意:如果在前面的步骤中使用了多个5 mL聚苯乙烯管，请将所有细胞汇集在同一个15 mL管中。细胞分选后回收的细胞是造血干细胞和祖细胞。血小板生成素（TPO）的存在，巨核生成的主要生理调节因子 ^10，将引导细胞分化朝向巨核细胞系。
23. 测量Lin−细胞数和活力，如步骤2.10所示。
24. 计算离心所需的细胞悬浮液体积，以便具有1 x 10⁶ 个活细胞x孔数，孔数是每个条件要播种的孔数。
25. 每种情况准备一管，具有适当体积的细胞悬浮液，并以300×g离心7分钟。
26. 对于液体培养物，弃去上清液并将细胞沉淀重悬于完全培养基（DMEM，PSG为最终体积的1%，FBS为最终体积的10%，海芋素100 U / mL，TPO 50 ng / mL）中以达到2×10⁶ 个活细胞/ mL（等于1×每500μL孔10⁶ 个细胞）的最终浓度。将细胞在37°C下在5%CO 2下孵育。（= 培养物的第 0 天）
    注意:参见甲基纤维素培养的下一段 例如，要制备一个孔的完整培养基，使用435μLDMEM，50μL100%FBS用于10%最终，5μL100%PSG用于1%最终，5μL1000 U / mL用于100 U / mL最终和5μL5μg/ mL TPO用于50ng / mL最终。通常使用4孔或24孔培养板，因为它们的孔径非常适合每孔所需的500μL。

3. 甲基纤维素水凝胶中的细胞包埋

注意:请注意，以下方案描述了获得单孔水凝胶细胞培养物的方法，以适应所需的孔数。

1. 在室温下解冻1mL等分试样的3%甲基纤维素储备溶液。准备一个单独的额外等分试样的甲基纤维素用于注射器包衣。
   注意:在3%的浓度下，甲基纤维素在室温（20-25°C）下保持液态。
2. 通过从额外的等分试样中吸取1 mL甲基纤维素，涂上1 mL装有18号针头的鲁尔锁定注射器。完全排出甲基纤维素。
   注:该包衣步骤确保步骤3.3中收集的甲基纤维素的体积是精确的。
3. 用相同的注射器和针头，但使用新的甲基纤维素等分试样，吸取适当体积的甲基纤维素（图2A）。
   注意:为了在最终体积为每孔500μL的最终体积中达到2%甲基纤维素的最终浓度，需要333μL的3%甲基纤维素。
4. 小心取出针头。使用灭菌的镊子，将Luer锁连接器拧到注射器的末端（图2B-C）。
5. 将第二个未涂层的1 mL鲁尔锁定注射器连接到鲁尔锁定连接器，以便将两个注射器连接在一起（图2D）。
   注意:无需涂覆第二个注射器。
6. 将甲基纤维素体积均匀地分布在两个注射器之间（图2E），并将它们放在一边，直到步骤3.11。
7. 制备浓缩的DMEM培养基，以便在最终甲基纤维素体积（步骤3.11）中获得与每种化合物的液体培养基之一相同的浓度（PSG为最终体积的1%，FBS为最终体积的10%，海芋素100 U / mL，TPO 50 ng / mL）。
   1. 每孔1×10⁶ 个细胞制备167μL浓缩培养基。计算该培养基的体积，以便得到2%的最终甲基纤维素浓度。孔中的总体积将为500μL（浓缩培养基中的167μL细胞悬浮液+ 333μL甲基纤维素），并且所有组分的浓度将与液孔中的浓度相同。
   2. 例如，要制备一个孔的完整培养基，使用102μLDMEM，50μL100%FBS用于10%最终，5μL100%PSG用于1%最终，5μL10000 U / mL用于100 U / mL最终和5μL5μg/ mL TPO用于50ng / mL最终。它提供167μL的体积用于重悬细胞，加入333μL甲基纤维素，最终体积将为500μL。
8. 完成离心步骤2.26后，弃去上清液并以1×10⁶ 个细胞/ 167μL的比例重悬细胞沉淀在浓缩培养基中。
9. 取回注射器，然后断开其中一个注射器与接头的连接。
10. 移液167μL细胞悬浮液。
11. 将细胞悬浮液直接加入注射器连接器（图2F），确保不引入气泡。
    注意:在添加细胞悬浮液的同时，同时慢慢拉动注射器柱塞，为细胞悬浮液腾出一些空间。
12. 小心地重新连接两个注射器（图2G），而不会失去螺纹中的任何悬浮液。
    注意:在重新连接之前，请拉动柱塞，以使连接器保持半空，并留出足够的空间让第二个注射器连接而不会溢出悬浮液。
13. 用细胞悬浮液缓慢匀浆甲基纤维素培养基，在两个注射器之间来回移动十个柱塞（图2H）。
14. 将总体积吸入一个注射器中，然后断开两个注射器，将连接器留在空的注射器上。
15. 将注射器的内容物倒入4孔板的孔中（图2I）。
16. 将细胞在37°C下在5%CO_2（= 培养物的第0天）下孵育。
    注意:可以用一对注射器制备两个甲基纤维素孔。增加两倍的甲基纤维素体积和细胞悬浮液的体积，以具有2×10⁶ 个细胞。完成步骤 3.13 后。在两个注射器之间平均分配体积，每个注射器中都有500μL。断开它们，并清空文化井中没有连接器的那个。重新连接注射器，将卷从保持接头的卷转移到另一个。断开注射器，具有500μL的注射器不应连接连接器，并将细胞接种在第二个培养孔中。3%甲基纤维素作为Iscove的改性Dulbecco培养基（IMDM）中的储备溶液购买，而浓缩的细胞悬浮在DMEM中。最初进行了比较测试，以确保这种混合培养基对实验结果没有影响，特别是与100%DMEM中的液体培养物相比。

4. 用于丙酸盐分析的细胞重悬

注:形成丙酸盐的能力分析必须在液体和甲基纤维素生长的巨核细胞之间的可比条件下进行。甲基纤维素水凝胶施加的物理约束抑制了丙酸盐的延伸。因此，在培养的第3天，将甲基纤维素生长的细胞重悬于新鲜的液体培养基中，以允许它们延长丙酸盐。甲基纤维素水凝胶是一种物理水凝胶，在液体介质添加时很容易稀释。重要的是，为了避免重悬和离心产生的伪影，在对照液体培养基条件下的细胞必须以与甲基纤维素生长细胞相同的方式同时处理。请参阅实验的示意图（图1）。

1. 准备10 mL DMEM - 1%PSG在37°C下预热到15 mL管中，每个孔重悬。
2. 小心地将每个孔中的细胞重悬于10 mL DMEM - 1%PSG中。
   注意:轻轻地做几个上下运动，以完全稀释甲基纤维素。对于液孔，请确保收集沉积在孔底部的所有细胞。
3. 在300×g下离心管5分钟。
4. 同时制备完整的培养基（DMEM，PSG为最终体积的1%，FBS为最终体积的10%，海芋素100 U / mL，TPO为50 ng / mL）。
   注意:在此步骤中，取回每个孔以稀释一半，因此每孔准备1mL完整培养基。
5. 弃去上清液并将细胞沉淀重悬于每个管的1mL培养基中。
6. 在4或24孔板中每孔重新接种500μL细胞悬浮液，并在37°C下在5%CO₂下孵育。
   注意:从一个初始孔中，获得2个孔，用于丙酸盐可视化，一式两份。请注意，由于这些重复项源自同一样本，因此不能将其视为独立重复项。
7. 重新播种后24小时，在培养的第4天，使用明场显微镜和20×物镜随机获取每孔10张图像。
   注意:细胞倾向于聚集在孔的中心，确保场上没有太多的细胞，因为它可能会使丙烯酸盐可视化和定量变得困难。确保每个场至少捕获5个巨核细胞。
8. 计算每张图像中巨核细胞和延伸丙酸盐的巨核细胞的总数，并计算延伸丙酸盐的巨核细胞的比例。
   注:定量不是自动的;手动执行细胞计数。通过使用ImageJ的细胞计数器插件单击细胞，以便在计数时标记它们，可以促进计数。每孔采集的10个油田和一两个两叉的孔代表每个条件大约150-300个巨核细胞。

5. 细胞固定和检索，以备将来分析

注意:本规程使用固定剂，必须在通风橱下处理，并穿戴防护装备。

注意:目的是保持应用于细胞的凝胶约束完好无损，直到它们完全固定。因此，无论使用哪种固定剂，都必须将其添加到甲基纤维素顶部的孔中，而不会干扰凝胶。相同的方案适用于液体培养物。

1. 在甲基纤维素上加入等于接种体积（本方案中为500μL）的固定溶液，而不会破坏凝胶。根据使用的固定剂等待适当的时间（至少10分钟）。
   注意:整个凝胶中的固定剂扩散应该非常快，因为凝胶颜色的快速变化（从粉红色到黄橙色阴影）会显现出来。多聚甲醛（DPBS中8%，每孔500μL）通常用于免疫标记，而戊二醛（5%在卡可二酸缓冲液中，每孔500μL）用于电子显微镜分析。
2. 使用P1000移液器，用固定剂和凝胶轻轻地上下移液几次，以均匀稀释甲基纤维素。
3. 使用相同的移液器和吸头，将孔中的所有体积转移到含有10 mL DPBS的15 mL管中并均质化。
4. 将混合物以300×g离心7分钟。
   注意:可能需要第二个洗涤步骤来消除所有甲基纤维素
5. 丢弃上清液并根据所需的分析（免疫标记，流式细胞术^9，电子显微镜等）将巨核细胞沉淀重悬于适当的培养基中。（有关电子显微镜，另请参阅本JoVE期刊中的论文方法"使用透射电子显微镜原位 探索巨核生成的主要步骤"）。

结果

使用该协议获得的数据最初发表在2016年的Blood上⁹。

根据该协议，将细胞接种在液体或甲基纤维素水凝胶培养基中。液体培养基中的细胞全部沉淀在孔的底部，与坚硬的塑料表面接触，有时与其他细胞接触。相反，嵌入在甲基纤维素水凝胶中的细胞均匀分布在凝胶中，并从相邻细胞中分离出来（图3A）。与液体培养物相比，终浓度为2%的...

讨论

在过去的十年中，机械生物学在生物学的许多领域引起了越来越多的兴趣。现在人们普遍认为，细胞周围的机械环境确实在其行为中起作用，强调了研究巨核细胞如何感知和响应细胞外机械线索的重要性。在 原位¹¹准确测量骨髓组织的硬度是具有挑战性的，特别是如果我们考虑造血红骨髓，因为它位于大型哺乳动物的小梁骨内，而从骨骺中更容易获得的骨髓主要由脂肪细?...

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
18-gauge needles	Sigma-Aldrich	1001735825
21-gauge needles	BD Microlance	301155
23-gauge needles	Terumo	AN*2332R1
25-gauge neeldes	BD Microlance	300400
4-well culture dishes	Thermo Scientific	144444
5 mL syringes	Terumo	SS+05S1
Cytoclips	Microm Microtech	F/CLIPSH
Cytofunnels equiped with filter cards	Microm Microtech	F/JC304
Cytospin centrifuge	Thermo Scientific		Cytospin 4
Dakopen	Dako
DMEM 1x	Gibco, Life Technologies	41 966-029
DPBS	Life Technologies	14190-094	Sterile Dulbecco’s phosphate-buffered saline
EasySep magnets	Stem Cell Technologies	18000
EasySep Mouse Hematopoietic Progenitor Cell isolation Kit	Stem Cell Technologies	19856A	biotinylated antibodies (CD5,CD11b, CD19, CD45R/B220, Ly6G/C(Gr-1), TER119,7–4) and streptavidin-coated magnetic beads
EDTA	Invitrogen	15575-020
Fetal Bovine Serum	Healthcare Life Science	SH30071.01
Luer lock 1 mL syringes	Sigma-Aldrich	Z551546-100EA	or 309628 syringes from BD MEDICAL
Luer lock syringes connectors	Fisher Scientific	11891120
MC 3%	R&D systems	HSC001
Polylysin coated slides	Thermo Scientific	J2800AMNZ
PSG 100x	Gibco, Life Technologies	1037-016	10,000 units/mL penicillin, 10,000 μg/mL streptomycin and 29.2 mg/mL glutamine
Rat serum	Stem Cell Technologies	13551
Recombinant hirudin	Transgène	rHV2-Lys47
Recombinant human trombopoietin (rhTPO)	Stem Cell Technologies	2822	10,000 units/mL
Round bottomed 10 mL plastique tubes	Falcon	352054
Round bottomed 5 mL polystyrene tubes