Hücre Olgunlaşmasını Geliştirmek ve Sertlik ve Hapsetmenin Etkisini İncelemek için 3D Metilselüloz Bazlı Hidrojelde Megakaryosit Kültürü

Özet

Hücrelerin üç boyutlu ortamının davranışlarında, olgunlaşmalarında ve/veya farklılaşmalarında önemli bir rol oynayabileceği artık kabul ediliyor. Bu protokol, fiziksel çevreleme ve mekanik kısıtlamaların megakaryositler üzerindeki etkisini incelemek için tasarlanmış üç boyutlu bir hücre kültürü modelini açıklar.

Özet

Hem hapsetmeye hem de mekanik kısıtlamalara yol açan 3D ortam, hücre davranışının önemli bir belirleyicisi olarak giderek daha fazla tanınmaktadır. 3D kültürü böylece in vivo durumuna daha iyi yaklaşmak için geliştirilmiştir. Megakaryositler kemik iliğindeki (BM) hematopoetik kök ve progenitör hücrelerden (HSPC) farklılık sağlar. BM, kemiğin içinde kapalı olarak vücudun en yumuşak dokularından biridir. Kemik hücre ölçeğinde zayıf genişletilebilir, megakaryositler birlikte zayıf bir sertliğe ve yüksek hapsetmeye maruz kalır. Bu protokol, fare soyu negatif (Lin-) HSPC'lerin immün manyetik sıralama ile kurtarılması ve metilselülozdan oluşan bir 3D ortamda olgun megakaryositlere farklılaşması için bir yöntem sunar. Metilselüloz megakaryositlere karşı reaktif değildir ve sertliği normal kemik iliğine ayarlanabilir veya patolojik fibrotik iliği taklit etmek için arttırılabilir. Daha fazla hücre analizi için megakaryositleri kurtarma işlemi de protokolde ayrıntılı olarak yer uzamaktadır. Proplatelet uzantısı 3D milieu içinde önlenmiş olsa da, megakaryositlerin sıvı ortamda nasıl yeniden sulandırılacağı ve proplateletleri uzatma kapasitelerinin nasıl ölçülmesi aşağıda açıklanmıştır. 3D hidrojelde yetişen megakaryositler, sıvı bir milieu'da yetişenlere kıyasla proplatlet oluşturma kapasitesi daha yüksektir. Bu 3B kültür, i) ataları daha yüksek olgunlaşma durumuna ulaşan megakaryositlere doğru ayırt etmeye, ii) in vivo olarak gözlemlenebilen ancak klasik sıvı kültürlerinde fark edilmeyen fenotipleri yeniden toplamaya ve iii) 3D bir ortamın sağladığı mekanik ipuçlarının neden olduğu transdüksiyon yollarını incelemeye izin verir.

Giriş

Vücuttaki hücreler karmaşık bir 3D mikroçevrimi yaşarlar ve komşu hücreler ve çevresindeki matris ^1,2,3nedeniyle dokudan sertlik ve hapsetme de dahil olmak üzere kimyasal ve mekanofizik ipuçları arasındaki etkileşime tabi tutulurlar. Sertlik ve hapsetmenin hücre davranışı için önemi sadece son yıllarda kabul edilmiştir. 2006 yılında, Engler ve ark. ^4'ün ufuk açıcı çalışması, mekanik ortamın hücre farklılaşması için önemini vurgulamıştır. Yazarlar, hücre substrat sertliğindeki varyasyonun kök hücrelerin çeşitli farklılaşma soylarına doğru yönlendirilmesinde neden olduğunu göstermiştir. O zamandan beri, mekanik ipuçlarının hücre kaderi ve davranışı üzerindeki etkisi giderek daha fazla tanındı ve incelendi. Organizmanın en yumuşak dokularından biri olmasına rağmen, kemik iliği kemiğin içinde sınırlı olan 3D yapısal bir organizasyona sahiptir. İlik sertliği, teknik olarak tam olarak ölçülmek zor olsa da, 15 ila 300 Pa ^5,6arasında olduğu tahmin edilmektedir. Stroma içinde, hücreler birbirine sıkıca hapsedilir. Ek olarak, çoğu kan dolaşımına girmek için sinüzoid damarlara doğru göç ediyor. Bu koşullar, bu kuvvetlere uyum sağlamak zorunda olan bitişik hücreler üzerinde ek mekanik kısıtlamalar oluşturur. Mekanik ipuçları, megakaryosit farklılaşması ve proplatlet oluşumu üzerindeki sonuçları yeni araştırılmış önemli bir parametreyi temsil eder. Megakaryositler geleneksel sıvı kültüründe in vitroyu ayırt edebilse de, kısmen3D ortamdan mekanik ipuçlarının olmaması nedeniyle vivo olarak gözlenen olgunlaşma derecesine ulaşmazlar ⁷. Hidrojel gömülü büyüyen progenitors sıvı milieu eksik 3D mekanik ipuçları getiriyor.

Hidrojeller, hematolojik alanda birkaç on yıldır yaygın olarak kullanılmaktadır, özellikle hematolojik progenitörleri ölçmek için kolonide test oluşturan hücreleri yetiştirmek için. Bununla birlikte, bu tür hidrojeller, 3D mekanik ortamın hematopoetik hücrelerin olgunlaşması ve farklılaşması üzerindeki biyolojik etkisini araştırmak için nadiren kullanılmıştır. Son birkaç yıldır laboratuvarımız metilselüloz bazlı bir hidrojel kullanarak bir 3D kültür modeli ^{geliştirmiştir 8.} Bu tepkisel olmayan fiziksel jel, yerel megakaryosit ortamının fiziksel kısıtlamalarını taklit etmek için yararlı bir araçtır. Selülozdan hidroksil kalıntılarının (-OH) metoksit grupları (-OCH₃₎ile değiştirilmesi ile elde edilir. Hem metil ikame derecesi hem de metilselüloz konsantrasyonu, jöle olduktan sonra hidrojel sertliğini belirler. Bu tekniğin gelişim aşamasında, 30 ila 60 Pa aralığındaki bir Young modülünün megakaryosit büyümesi için en uygun jel sertliği olduğu gösterilmiştir ⁹.

Aşağıdaki protokol, 3D metilselüloz hidrojelde fare megakaryositik atalarını yetiştirme yöntemini açıklar. Standart sıvı kültürü ile karşılaştırıldığında, bu hidrojel kültürün megakaryosit poliploidizasyon derecesini artırdığı, olgunlaşmayı ve hücre içi organizasyonu iyileştirdiği ve sıvı bir ortamda yeniden yaşamdan geçirildikten sonra yayılımları uzatmak için megakaryositlerin kapasitesini artırdığı gösterilmiştir ⁹. Bu makale, fare kemik iliği Lin− hücrelerinin izolasyonu ve 3D kültür için metilselüloz hidrojel içine gömülmesi protokolünü ve ayrıca proplatlet üretme kapasitelerinin nicelleştirilmesini ve daha fazla analiz için hücrelerin geri kazanımını ayrıntılı olarak açıklamaktadır.

Protokol

Tüm deneyler, laboratuvar hayvanlarının bakımı ve kullanımı için kurumsal yönergelere uygun olarak yapılmalıdır. Videoda görüntülenen tüm protokoller, Avrupa yasalarına ve Etablissement Français du Sang (EFS) İnceleme Kurulu'nun tavsiyelerine uygun olarak gerçekleştirildi. Bu protokolün ilk sürümü ilk olarak 2018 yılında Moleküler Biyoloji yöntemleri ⁸.

NOT: Şekil 1, tüm sürecin şematik bir görünümünü sunar. Bu işlem 1) kemik diseksiyonu, ilik alımı ve ilik hücrelerinin mekanik izolasyonu, 2) soyu negatif (Lin-) hücrelerin manyetik olarak sıralanması, 3) sıvı veya metilselüloz hidrojelde tohumlama ve 4) sıvı ortamda proplatelet oluşumunun incelenmesi için 3D jelde yetiştirilen megakaryositlerin yeniden tohumlanmasıdır.

1. Yetişkin farelerden kemik toplama

NOT: Bu bölümde mikrobiyal kontaminasyonun en aza indirilmesi önemlidir.

1. Toplam penisilin-streptomisin-glutamin (PSG) antibiyotik karışımının %1'ini içeren Dulbecco Modifiye Eagle's Medium (DMEM) ile kemik toplama için 15 mL'lik bir tüp hazırlayın (penisilin 10000 U/mL, streptomisin 100000 μg/mL ve L-glutamin 29.2 mg/mL).
   NOT: Kullanılan tüm fareler aynı genotipe sahipse, tüm kemikleri aynı tüpte 1 mL DMEM - PSG% 1 fare sayısı içeren bir havuza edin. Antibiyotikler, kemik örneklemesi sırasında olası bakterilerin çoğalmasını önlemek için önemlidir.
2. 50 mL'lik bir tüpü kemik dezenfeksiyonu için% 70 etanol ve işlem sırasında durulama aletleri için bir tane daha doldurun. Sterilize diseksiyon aletleri kullanın.
3. İsofluran inhalasyonunu (%4) kullanarak fareleri uyuşturun ve fareleri ötenazi yapmak için hızla servikal çıkık işlemine geçin. Mikrobiyal kontaminasyonu dezenfekte etmek ve önlemek için vücudu hızla% 70 etanol içine daldırın.
4. Kaval kemiğini ve uyluk kemiğini hızla parçalara ayrıştırın.
5. Neşter kullanarak, tibia için ayak bileği yan ucunun ve uyluk kemiği için kalça yan ucunun epifizlerini kesin.
6. Kemikleri %1 PSG içeren DMEM ortamına batırmadan önce %70 etanolde bir saniye için daldır.

2. İlik ayrışması ve Lin hücrelerinin izolasyonu

NOT: Protokolün bu kısmı laminer akış başlığı altında gerçekleştirilir. Bir kültür için, tüm kuyular aynı deneyin bir parçasıdır ve bağımsız biyolojik kopyalar olarak kabul edilemez. Tüm farelerden gelen hücreler, tüm kuyuların homojenliğini sağlamak ve olası bireyler arası değişkenliği ortadan kaldırırken birbirleriyle karşılaştırabilmek için bir araya getirilir. Bağımsız biyolojik çoğalmalar için kültür tekrarlanmalıdır.

1. Kemikleri bir Petri kabına yerleştirin ve potansiyel kirleticileri gidermek için steril Dulbecco'nun fosfat tamponlu salininde (DPBS) iki kez yükseltin.
2. DMEM - 50 mL tüpte % 1 PSG hazırlayın.
   NOT: Deney için kullanılan fare başına 2 mL DMEM - %1 PSG sağlayın.
3. 21 kalibrelik bir iğne ile donatılmış 5 mL şırıngayı DMEM - % 1 PSG ile doldurun.
4. Kemiği perip uçlarıyla tutarak, diz yan ucunda sadece iğnenin eğimini tanıtın.
   NOT: Diz tarafı epifizi diseksiyondan bozulmadan kalmalı ve merkezinde iğnenin sokulması için küçük bir boşluk bırakılmalıdır. Kalan epifiz, yıkama sırasında iğneye bağlı kemiği koruyacaktır. İliği ezebileceği ve zarar verebileceği için kemikteki eğimden daha fazlasını tanıtmamaya dikkat edin.
5. İliği 50 mL'lik bir tüpe boşaltmak için şırınna pistonuna hızlı bir şekilde bastırın.
   NOT: Sıçramaları önlemek ve iliğin yıkanmasını ve serbestleşmesini kolaylaştırmak için kemiğin serbest ucunu DMEM-% 1 PSG'ye batırılmış tüp duvarına yerleştirin. Pratikte, iliği kemikten çıkarmak için genellikle 500 μL ile 1 mL arasında bir hacim yeterlidir. İlik tamamen dışarı atıldığında kemik beyazlaşmıştır. İliğin kalan bazı kırmızı renklerle değerlendirildiği gibi diyofizden tamamen atılmamış olması durumunda, floşun taze ortamla tekrarlanması mümkündür.
6. 2.4. ve 2.5. tüm kemikler için, 5 mL şırıncı DMEM ile yeniden doldurulması - gerekirse% 1 PSG.
7. Yıkanmış ilik içeren ortamın toplam hacmini yuvarlak tabanlı 10 mL tüplere aktarmak için 21-gauge iğne ile aynı 5 mL şırıngayı kullanın.
   NOT: Yuvarlak tabanlı 10 mL'lik bir tüpe geçmek kesinlikle gerekli değildir, ancak aşağıdaki ayrışma adımlarına devam etmeyi kolaylaştırır. Bulaşma riskinden şüphelenilirse şırınga ve/veya iğneyi değiştirmekten çekinmeyin.
8. Orta ve ilik hücrelerini 21 kalibrelik bir iğneden art arda iki kez, 23 kalibrelik bir iğneden üç kez ve bir kez de 25 kalibrelik bir iğneden aspirasyon yaparak ve dışarı atarak hücre ayrışması işlemine devam edin.
   NOT: Hücreler için zararlı olabileceğinden hava kabarcıklarından kaçının.
9. Süspansiyonu 15 mL tüplere aktarın.
10. Ölü hücreleri dışlamak için trypan mavisi varlığında otomatik bir hücre sayacı veya hücre odası kullanarak hücre numarasını ölçün ve uygulanabilirliği kontrol edin.
11. 15 mL tüpleri 300 x g'da 7 dakika santrifüj edin. 1 mL transfer pipet kullanarak, dikkatlice pipet dışarı ve süpernatant atın.
12. Fare hematopoetik hücre izolasyon kiti kullanarak negatif immünmanyetik sıralama ile kök ve progenitör hücreleri izole edin.
    NOT: Bu hücre sıralamanın amacı, tüm seçim antikorları (CD5, CD11b, CD19, CD45R/B220, Ly6G/C(Gr-1), TER119, 7-4) için negatif olan hücreleri almak ve bu nedenle megakaryositik olandan başka bir farklılaşma soyunda olan hücreleri ortadan kaldırmaktır.
13. Kit talimatlarını izleyerek, hücresel peleti taze hazırlanmış M ortamına (fetal sığır serumunun (FBS) son hacminin % 2'sine sahip PBS), EDTA 1 mM) 1 ×^{10 8} hücre/mL konsantrasyona yeniden uygulayın ve süspansiyonu yuvarlak tabanlı 5 mL polistiren tüplerde maksimum 2 mL hacme dağıtın.
14. Polistiren tüplere ekleyin: 50 μL/ mL konsantrasyonda normal sıçan serumu ve biyotinillenmiş antikor karışımı (CD5, CD11b, CD19, CD45R/B220, Ly6G/C(Gr-1), TER119, 7-4) konsantrasyonda mL başına 50 μL karışım ve tüpleri hafifçe sallayarak homojenize edin.
    NOT: Bu antikorlar, megakaryositik yol dışında zaten bir farklılaşma yoluna girmiş hücrelere bağlanır.
15. Tüpleri 15 dakika boyunca buzda kuluçkaya yatır.
16. 75 μL/mL konsantrasyonda streptavidin kaplı manyetik boncuklar ekleyin ve tüpleri hafifçe sallayarak homojenize edin.
17. 10 dakika boyunca buzda tekrar kuluçkaya yaslanın.
18. Gerekirse, M m orta ile tüp başına 2,5 mL'lik son hacme ayarlayın.
19. Kapağı olmadan, bir mıknatısın içine yerleştirmeden hemen önce tüpü hafifçe sallayarak süspansiyonu homojenize edin ve üç dakika bekleyin.
    NOT: Zaten bir farklılaşma yoluna girmiş ve manyetik boncuklarla kaplanmış hücreler mıknatısın içindeki tüpün duvarında tutulacaktır.
20. Tüp içeriğini yeni bir yuvarlak tabanlı 5 mL polistiren tüpe aktarmak için mıknatısı ve tüpü ters çevirin.
    NOT: Aktarma için tüpü mıknatıstan almayın; mıknatısı hala tüp içindeyken ters çevirerek yapılır. Sabit bir hareket kullanın ve tüpü sallamayın.
21. istenmeyen manyetik etiketli hücreler içeren ilk tüpü atın ve yenisini kapağı olmadan üç dakika daha mıknatısa yerleştirin.
22. Adım 2.20'de olduğu gibi, izole edilmiş Lin− hücrelerini yeni bir 15 mL tüpe aktarın.
    NOT: Önceki adımlar için birkaç adet 5 mL polistiren tüp kullanılmışsa, tüm hücreleri aynı 15 mL tüpte biriktirin. Hücre tasnif edildikten sonra kurtarılan hücreler hematopoetik kök hücreler ve progenitörlerdir. Megakaryopoezis ^10'unana fizyolojik regülatörü olan trombopoietin (TPO) varlığı, hücre farklılığını megakaryositik hücre hattına yönlendirecektir.
23. Adım 2.10'daki gibi Lin− hücre sayısını ve canlılığını ölçün.
24. 1 x 10⁶ uygulanabilir hücreye sahip olmak için santrifüje gerekli hücre süspansiyon hacmini hesaplayın x Kuyu Sayısı, Kuyu Sayısı durum başına tohumlanan kuyu sayısıdır.
25. 7 dakika boyunca 300 x g'da uygun hücre süspansiyonu ve santrifüj hacmi ile her koşula bir tüp hazırlayın.
26. Sıvı kültürler için, süpernatantı atın ve hücre peletini tam kültür ortamında yeniden biriktirin (DMEM, PSG son hacmin % 1'i, FBS son hacmin% 10'u, hirudin 100 U / mL, TPO 50 ng / mL) 2 × 10⁶ uygulanabilir hücre / mL 'nin son konsantrasyonuna ulaşmak için (500 μL kuyusu başına 1 ×^{10 6} hücreye eşittir). Hücreleri %5 CO2'nin altında 37 °C'de kuluçkaya yatırın. (= kültürün 0. günü)
    NOT: Metilselüloz kültürleri için bir sonraki paragrafa bakın Örnek olarak, bir kuyu için tam kültür ortamı hazırlamak, 435 μL DMEM, %10 final için 50 μL %100 FBS, %1 final için %100 PSG 5 μL, 100 U/mL finali için 10 000 U/mL'nin 5 μL'si ve 50 ng/mL finali için 5 μL 5 μg/mL TPO kullanın. 4 kuyulu veya 24 kuyulu kültür plakaları tipik olarak kullanılır, çünkü kuyu çapları kuyu başına gereken 500 μL için uygundur.

3. Metilselüloz hidrojel içine hücre gömme

NOT: Aşağıdaki protokolde, hidrojel hücre kültürünün tek bir kuyuyu elde etme, ihtiyaç duyulan kuyu sayısına uyum sağlama yönteminin açıklanmış olduğunu lütfen unutmayın.

1. Oda sıcaklığında% 3 metilselüloz stok çözeltisinin 1 mL aliquots'unu çözün. Şırınna kaplama için bir ayrı ekstra metilselüloz aliquot hazırlayın.
   NOT: %3 konsantrasyonda, metilselüloz oda sıcaklığında (20-25 °C) sıvı kalır.
2. Ekstra aliquot'tan 1 mL metilselüloz çekerek metilselüloz ile 18 kalibrelik bir iğne ile donatılmış 1 mL Luer kilit şırıngasını kapleyin. Metilselülozu tamamen at.
   NOT: Bu kaplama adımı, 3.3.
3. Aynı şırınga ve iğne ile ancak yeni bir metilselüloz aliquot kullanarak, uygun metilselüloz hacmini çizin (Şekil 2A).
   NOT: Kuyu başına 500 μL'lik son hacimde%2 metilselülozun son konsantrasyonuna ulaşmak için% 3 metilselülozun 333 μL'si gereklidir.
4. İğneyi dikkatlice çıkarın. Sterilize edilmiş önseçimler kullanarak, şırınd ucuna bir Luer kilit konektörü vidalayın (Şekil 2B-C).
5. İki şırınnayı birbirine bağlamak için Luer kilit konektörüne ikinci, kaplamasız, 1 mL Luer kilit şırıngını takın (Şekil 2D).
   NOT: Bu ikinci şırınnayı kaplamaya gerek yoktur.
6. Metilselüloz hacmini iki şırınna ( Şekil2E) arasında eşit olarak dağıtın ve 3.11.
7. Konsantre DMEM kültür ortamını, her bileşik için sıvı kültür ortamından biriyle aynı konsantrasyonu elde etmek için son metilselüloz hacminde (adım 3.11) elde etmek üzere hazırlayın (PSG son hacmin% 1'i, FBS son hacmin% 10'u, hirudin 100 U / mL, TPO 50 ng / mL).
   1. 1 × 10 6 hücreli son kuyu başına¹⁶⁷ μL konsantre kültür ortamı hazırlayın. Bu ortam hacmi,% 2'lik nihai bir metilselüloz konsantrasyonu elde etmek için hesaplanır. Kuyudaki toplam hacim 500 μL (konsantre kültür ortamında 167 μL hücre süspansiyonu + 333 μL metilselüloz) olacak ve tüm bileşenler sıvı kuyularındakiyle aynı konsantrasyona sahip olacaktır.
   2. Örnek olarak, bir kuyu için tam kültür ortamı hazırlamak, 102 μL DMEM, %10 final için 50 μL %100 FBS, %1 final için %100 PSG 5 μL, 100 U/mL finali için 10 000 U/mL 5 μL ve 50 ng/mL final için 5 μL 5 μg/mL TPO kullanın. Hücreleri yeniden kullanmak için kullanılan 167 μL'lik bir hacim verir ve 333 μL metilselüloz ilavesiyle son hacim 500 μL olacaktır.
8. Santrifüjleme adımı 2.26'yı tamamladıktan sonra, süpernatantı atın ve hücre peletini konsantre kültür ortamında 167 μL başına 1 ×^{10 6} hücre oranında yeniden biriktirin.
9. Şırınnaları geri alın ve birini konektörden çıkarın.
10. Hücre süspansiyonunun pipet 167 μL'si.
11. Hücre süspansiyonunu doğrudan şırınna konektörüne ekleyin (Şekil 2F), hava kabarcıklarını tanıtmamaya dikkat edin.
    NOT: Hücre süspansiyonu eklerken, hücre süspansiyonu için biraz yer kazanmak için şırınna pistonu aynı anda yavaşça çekin.
12. Vida ipliğinde herhangi bir süspansiyon kaybetmeden iki şırınnayı(Şekil 2G)dikkatlice yeniden bağlayın.
    NOT: Yeniden bağlanmadan önce, konektörü yarı boş bırakmak için pistonu çizin ve süspansiyon taşmadan ikinci şırınnanın bağlanması için yeterli alan bırakın.
13. Metilselüloz ortamını hücre süspansiyonu ile iki şırıng arasında on ileri geri piston hareketi ile yavaşça homojenize edin (Şekil 2H).
14. Toplam ses seviyesini bir şırınna çizin ve iki şırınnanın bağlantısını kesin ve bağlayıcıyı boş olanda bırakın.
15. Şırındının içeriğini 4 kuyulu bir tabağa boşaltın (Şekil 2I).
16. Hücreleri %5 CO₂ altında 37 °C'de kuluçkaya yatırın (= kültürün 0. günü).
    NOT: Bir çift şırınna ile iki metilselüloz kuyusu hazırlamak mümkündür. 2 x10⁶ hücreye sahip olmak için metilselüloz hacmini ve hücre süspansiyonunun hacmini iki artırın. 3.13. adım tamamlandıktan sonra. her birinde 500 μL olması için hacmi iki şırınna arasında eşit olarak dağıtın. Bunların bağlantısını kesin ve bir kültür kuyusunda bağlayıcı olmadan olanı boşaltın. Birimi bağlayıcıyı tutandan diğerine aktarmak için şırınnaları yeniden bağlayın. Şırınnaları çıkarın, 500 μL'ye sahip olan konektör takılı olmamalıdır ve hücreleri ikinci bir kültür kuyusunda tohumlamamalıdır. %3 metilselüloz, Iscove'un Modifiye Dulbecco's Medium'unda (IMDM) stok çözümü olarak satın alınırken, konsantre hücreler DMEM'de askıya alınır. Karşılaştırmalı testler başlangıçta, bu karışık ortamın, özellikle% 100 DMEM'deki sıvı kültürüne kıyasla, deneyin sonucu üzerinde hiçbir etkisi olmadığından emin olmak için yapılmıştır.

4. Proplatelet Analizi için Hücre Resüspensyonu

NOT: Proplatelet oluşturma kapasitesinin analizi, sıvı ve metilselüloz yetiştirilen megakaryositler arasında karşılaştırılabilir koşullar altında yapılmalıdır. Metilselüloz hidrojel tarafından uygulanan fiziksel kısıtlamalar proplatelet uzantısını inhibe eder. Bu nedenle, metilselülozla yetiştirilen hücreler, proplateletleri uzatmalarına izin vermek için kültürün 3. Metilselüloz hidrojel, sıvı ortam ilavesi üzerine kolayca seyreltilen fiziksel bir hidrojeldir. Daha da önemlisi, resüspenzyon ve santrifüjlenmeden kaynaklanan eserlerden kaçınmak için, kontrol sıvısı orta durumundaki hücrelerin metilselüloz tarafından yetiştirilen hücrelerle aynı anda tedavi edilmesi gerekir. Deneyin şematik gösterimine bakın (Şekil 1).

1. Her kuyunun yeniden dürtülmesi için 15 mL'lik bir tüpte 37 °C'de önceden ısıtılmış 10 mL DMEM - %1 PSG hazırlayın.
2. DMEM'in 10 mL'sinde her kuyudaki hücreleri dikkatlice yeniden biriktirin - % 1 PSG.
   NOT: Metilselülozu tamamen seyreltmek için birkaç yukarı ve aşağı hareketi hafifçe yapın. Sıvı kuyular için kuyunun dibinde biriken tüm hücreleri topladığından emin olun.
3. Tüpleri 300 × g'da 5 dakika santrifüj edin.
4. Bu arada tam kültür ortamı hazırlayın (DMEM, PSG son hacmin% 1'i, FBS son hacmin% 10'u, hirudin 100 U / mL, TPO 50 ng / mL).
   NOT: Bu adımda her kuyu yarı yarıya seyreltilmek üzere alınır, bu nedenle kuyu başına 1 mL tam kültür ortamı hazırlayın.
5. Süpernatant atın ve hücre peletini her tüp için 1 mL kültür ortamında yeniden dirildi.
6. 4 veya 24 kuyulu bir plakada kuyu başına 500 μL hücre süspansiyonu yeniden sıralandı ve % 5 CO_2'ninaltında 37 °C'de kuluçkaya yatırıldı.
   NOT: Bir ilk kuyudan, yinelenen proplatelet görselleştirme için 2 kuyu elde edin. Bu yinelemeler aynı örnekten kaynaklandığından, bağımsız yinelemeler olarak kabul edilemeyeceklerini lütfen unutmayın.
7. Yeniden yapılanmadan 24 saat sonra,× kültürün 4.
   NOT: Hücreler kuyunun merkezinde gruplanma eğilimindedir, proplatelet görselleştirme ve nicelemeyi zorlaştırabileceğinden sahada çok fazla hücre olmadığından emin olun. Alan başına en az 5 megakaryosit yakaladığından emin olun.
8. Her görüntüde proplateletleri genişleten megakaryositlerin ve megakaryositlerin toplam sayısını sayın ve proplateletleri genişleten megakaryositlerin oranını hesaplayın.
   NOT: Nicelik otomatik değildir; hücre sayımının el ile gerçekleştiriliyor. Sayım, sayıldıkları gibi işaretlemek için hücrelere tıklamak için ImageJ'in hücre sayma eklentisinin kullanılmasıyla kolaylaştırılabilir. Kuyu başına elde edilen 10 alan ve yinelenen kuyular, durum başına yaklaşık 150-300 megakaryosit temsil eder.

5. Gelecekteki analizler için hücre sabitleme ve alma

DİkKAT: Bu protokol, koruyucu ekipman giyerek duman kaputu altında ele alınması gereken fiksatifler kullanır.

NOT: Amaç, hücrelere uygulanan jel kısıtlamalarını tamamen sabitlenine kadar sağlam tutmaktır. Bu nedenle ve kullanılan fiksatif ne olursa olsun, jeli bozmadan metilselülozun üstündeki kuyuya eklenmelidir. Aynı protokol sıvı kültürlere de uygulanır.

1. Jeli bozmadan metilselülozun üzerine tohumlu hacme eşit bir fiksatif çözelti hacmi (bu protokolde 500 μL) ekleyin. Kullanılan fiksatife göre uygun süreyi bekleyin (en az 10 dk).
   NOT: Jel rengindeki hızlı bir değişiklikle ortaya çıkan jel boyunca sabit difüzyon çok hızlı olmalıdır (pembeden sarı-turuncu tona). Elektron mikroskopi analizi için glutaraldhehit (cacodylate tamponunda %5, kuyu başına 500 μL) kullanılırken, paraformaldehit (DPBS'de %8, kuyu başına 500 μL) genellikle immünoplabeling için kullanılır.
2. Bir P1000 pipet kullanarak, metilselülozu homojen bir şekilde seyreltmek için fiksatif ve jel ile birkaç yukarı ve aşağı pipetleme yapın.
3. Aynı pipet ve ucu kullanarak, kuyudaki tüm hacmi 10 mL DPBS içeren 15 mL'lik bir tüpe aktarın ve homojenize edin.
4. Karışımı 7 dakika boyunca 300 × g'da santrifüjleyin.
   NOT: Tüm metilselülozu ortadan kaldırmak için ikinci bir yıkama adımı gerekebilir
5. Süpernatantı atın ve megakaryosit peletini istenen analize göre uygun ortamda yeniden atın (immünoplabeling, akış sitometrisi^9,elektron mikroskopisi ...) (elektron mikroskopisi için ayrıca bu JoVE sayısında "İletim elektron mikroskopisi kullanılarak megakaryopoezin ana adımlarınınyerinde araştırılması" kağıt yöntemine bakın).

Sonuçlar

Bu protokol kullanılarak elde edilen veriler ilk olarak 2016 yılında^{Blood'da yayınlanmıştır 9}.

Protokole göre, hücreler sıvı veya metilselüloz hidrojel ortamda tohumlandı. Sıvı ortamdaki hücrelerin tümü kuyunun dibinde, sert plastik yüzeyle temas halinde ve bazen diğer hücrelerle çökeltilmiştir. Buna karşılık, metilselüloz hidrojel içine gömülü hücreler jelde homojen bir şekilde dağıtılır ve komşu hücrelerden izole edilir (

Tartışmalar

Önceki on yılda, mekanobiyoloji biyolojinin birçok alanına giderek daha fazla ilgi uyandırmıştır. Hücreleri çevreleyen mekanik ortamın davranışlarında rol oynadığı yaygın olarak kabul edilir ve megakaryositlerin hücre dışı mekanik ipuçlarını nasıl algıladığını ve yanıt verdiğini incelemenin önemini vurgular. Kemik iliği dokusunun sertliğini doğru bir şekilde ölçmek zordur in situ¹¹, özellikle hematopoetik kırmızı iliği büyük memelilerde trabe...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
18-gauge needles	Sigma-Aldrich	1001735825
21-gauge needles	BD Microlance	301155
23-gauge needles	Terumo	AN*2332R1
25-gauge neeldes	BD Microlance	300400
4-well culture dishes	Thermo Scientific	144444
5 mL syringes	Terumo	SS+05S1
Cytoclips	Microm Microtech	F/CLIPSH
Cytofunnels equiped with filter cards	Microm Microtech	F/JC304
Cytospin centrifuge	Thermo Scientific		Cytospin 4
Dakopen	Dako
DMEM 1x	Gibco, Life Technologies	41 966-029
DPBS	Life Technologies	14190-094	Sterile Dulbecco’s phosphate-buffered saline
EasySep magnets	Stem Cell Technologies	18000
EasySep Mouse Hematopoietic Progenitor Cell isolation Kit	Stem Cell Technologies	19856A	biotinylated antibodies (CD5,CD11b, CD19, CD45R/B220, Ly6G/C(Gr-1), TER119,7–4) and streptavidin-coated magnetic beads
EDTA	Invitrogen	15575-020
Fetal Bovine Serum	Healthcare Life Science	SH30071.01
Luer lock 1 mL syringes	Sigma-Aldrich	Z551546-100EA	or 309628 syringes from BD MEDICAL
Luer lock syringes connectors	Fisher Scientific	11891120
MC 3%	R&D systems	HSC001
Polylysin coated slides	Thermo Scientific	J2800AMNZ
PSG 100x	Gibco, Life Technologies	1037-016	10,000 units/mL penicillin, 10,000 μg/mL streptomycin and 29.2 mg/mL glutamine
Rat serum	Stem Cell Technologies	13551
Recombinant hirudin	Transgène	rHV2-Lys47
Recombinant human trombopoietin (rhTPO)	Stem Cell Technologies	2822	10,000 units/mL
Round bottomed 10 mL plastique tubes	Falcon	352054
Round bottomed 5 mL polystyrene tubes