細胞成熟を改善し、剛性と閉じ込めの影響を研究する3Dメチルセルロース系ヒドロゲルにおける巨核球培養

要約

細胞の立体環境は、その行動、成熟および/または分化において重要な役割を果たすことができることが認められています。このプロトコルは、巨大核球に対する物理的な封じ込めおよび機械的制約の影響を研究するために設計された3次元細胞培養モデルを記述する。

要約

閉じ込めと機械的な制約の両方につながる3D環境は、細胞の挙動の重要な決定要因としてますます認識されています。3D培養は、 インビボ の状況によりよく近づくために開発されました。巨核球は骨髄(BM)における造血幹細胞および前駆細胞(HSPCs)と区別する。BMは、骨の中に閉じ込められた身体の最も柔らかい組織の一つです。骨は細胞スケールで十分に拡張できないが、巨核球は弱い剛性と高い閉じ込めを受ける。このプロトコルは、メチルセルロースからなる3D培地における免疫磁気選別と成熟した巨核球への分化によるマウス系分(Lin-)HSPCsの回復方法を提示する。メチルセルロースは巨核球に対して非反応性であり、その剛性は正常な骨髄のそれに調節されるか、または病理学的線維性骨髄を模倣するように増加することができる。さらなる細胞分析のために巨核球を回収するプロセスもプロトコルで詳述されている。プロ血小板の伸長は3Dミリュー内で防止されるが、メガ核球を液体培地で再懸濁し、プロ血小板を拡張する能力を定量化する方法を以下に説明する。3Dヒドロゲルで成長した巨核球は、液体ミリューで増殖したものに比べてプロ血小板を形成する能力が高い。この3D培養により、i)より高い成熟状態に達する巨核球に対する前駆細胞を区別することができ、ii) 生体内で 観察されるかもしれないが古典的な液体培養では気付かれないフェノタイプを再現し、iii)3D環境によって提供される機械的手がかりによって誘発される伝達経路を研究する。

概要

体内の細胞は複雑な3D微小環境を経験し、隣接する細胞および周囲のマトリックス^1、2、3による組織からの剛性および閉じ込めを含む化学的およびメカノ物理的手掛かりとの相互作用を受ける。細胞行動の剛性と閉じ込めの重要性は、過去数十年でしか認識されていません。2006年、Englerら⁴の精力的な研究は、細胞分化のための機械的環境の重要性を強調した。その結果、細胞基質剛性のばらつきが、幹細胞の様々な分化系統に向かう方向を生じることを実証した。それ以来、機械的手掛かりが細胞の運命や行動に与える影響はますます認識され、研究されるようになった。それは生物の最も柔らかい組織の一つであるにもかかわらず、骨髄は骨の中に閉じ込められている3D構造組織を有する。骨髄の剛性は、技術的には正確に測定することは困難であるが、15と300 ^Pa5、6の間にあると推定される。間質の中で、細胞は互いにしっかりと閉じ込められている。さらに、それらのほとんどは血液循環に入るために、シヌサイド血管に向かって移動しています。これらの条件は、隣接する細胞に追加の機械的拘束を作成します, これらの力に適応する必要....

プロトコル

すべての実験は、実験動物のケアと使用のための制度的ガイドラインに従って行われるべきです。ビデオに表示されるすべてのプロトコルは、欧州の法律とエタブリシゼー・デュ・サン(EFS)の審査委員会の勧告に厳密に従って行われました。このプロトコルの最初のバージョンは、もともと分子生物学の方法で2018年に公開されました ⁸.

注: 図 1 は、プロセス全体の概略図を示しています。このプロセスには、1)骨髄解剖、骨髄検索、および骨髄細胞の機械的単離、2)リネージネガティブ(Lin-)細胞の磁気選別、3)液体またはメチルセルロースヒドロゲルへの播種、および4)液体培地中のプロ血小板形成を検討するために3Dゲルで増殖した巨核球の再懸濁が含まれる。

1. 成虫マウスからの骨採取

注: このセクションでは、微生物汚染を最小限に抑えることが重要です。

1. ペニシリン・レンサプトマイシン・グルタミン(PSG)抗生物質混合(ペニシリン10000 U/mL、ストレプトマイシン100000μg/mLおよびL-グルタミン29mg)の総量の1%を含むDulbeccoの修飾イーグル培地(DMEM)で骨採取用15mLチューブを調製します。
   注:使用されたすべてのマウスが同じ遺....

結果

このプロトコルを使用して取得したデータは、もともと2016⁹でブラッドに公開されました。

プロトコルによれば、細胞を液体またはメチルセルロースヒドロゲル培地に播種した。液体培地中の細胞は、硬いプラスチック表面に接触し、いつか他の細胞と接触して、ウェルの底部に沈積物を持っています。対照的に、メチルセルロースヒドロゲルに埋め込.......

ディスカッション

過去10年間で、メカノバイオロジーは生物学の多くの分野でますます関心を集めています。細胞を取り巻く機械的環境が行動に役割を果たしていることが一般的に認められ、巨核球が細胞外の機械的手がかりをどのように感知し、反応するかを研究することの重要性を強調しています。特に大型哺乳類の骨骨の中に位置する造血用赤い骨髄を考慮^{すると、糖尿病}からより容?.......

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
18-gauge needles	Sigma-Aldrich	1001735825
21-gauge needles	BD Microlance	301155
23-gauge needles	Terumo	AN*2332R1
25-gauge neeldes	BD Microlance	300400
4-well culture dishes	Thermo Scientific	144444
5 mL syringes	Terumo	SS+05S1
Cytoclips	Microm Microtech	F/CLIPSH
Cytofunnels equiped with filter cards	Microm Microtech	F/JC304
Cytospin centrifuge	Thermo Scientific		Cytospin 4
Dakopen	Dako
DMEM 1x	Gibco, Life Technologies	41 966-029
DPBS	Life Technologies	14190-094	Sterile Dulbecco’s phosphate-buffered saline
EasySep magnets	Stem Cell Technologies	18000
EasySep Mouse Hematopoietic Progenitor Cell isolation Kit	Stem Cell Technologies	19856A	biotinylated antibodies (CD5,CD11b, CD19, CD45R/B220, Ly6G/C(Gr-1), TER119,7–4) and streptavidin-coated magnetic beads
EDTA	Invitrogen	15575-020
Fetal Bovine Serum	Healthcare Life Science	SH30071.01
Luer lock 1 mL syringes	Sigma-Aldrich	Z551546-100EA	or 309628 syringes from BD MEDICAL
Luer lock syringes connectors	Fisher Scientific	11891120
MC 3%	R&D systems	HSC001
Polylysin coated slides	Thermo Scientific	J2800AMNZ
PSG 100x	Gibco, Life Technologies	1037-016	10,000 units/mL penicillin, 10,000 μg/mL streptomycin and 29.2 mg/mL glutamine
Rat serum	Stem Cell Technologies	13551
Recombinant hirudin	Transgène	rHV2-Lys47
Recombinant human trombopoietin (rhTPO)	Stem Cell Technologies	2822	10,000 units/mL
Round bottomed 10 mL plastique tubes	Falcon	352054
Round bottomed 5 mL polystyrene tubes