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Method Article
Reconhece-se agora que o ambiente tridimensional das células pode desempenhar um papel importante em seu comportamento, maturação e/ou diferenciação. Este protocolo descreve um modelo de cultura celular tridimensional projetado para estudar o impacto da contenção física e restrições mecânicas em megacaiócitos.
O ambiente 3D que leva tanto ao confinamento quanto às restrições mecânicas é cada vez mais reconhecido como um importante determinante do comportamento celular. Assim, a cultura 3D foi desenvolvida para melhor abordar a situação in vivo. Os megacariócitos diferenciam-se das células hematopoiéticas e progenitoras (HSPCs) na medula óssea (ML). O BM é um dos tecidos mais moles do corpo, confinado dentro do osso. O osso sendo pouco extensível na escala celular, megacariócitos são concomitantemente submetidos a uma rigidez fraca e alto confinamento. Este protocolo apresenta um método para a recuperação de HSPCs de linhagem de camundongos negativos (Lin-) por triagem imunomagnética e sua diferenciação em megacaiócitos maduros em um meio 3D composto de metilcelulose. A metilcelulose não é reativa em relação aos megacaiócitos e sua rigidez pode ser ajustada à da medula óssea normal ou aumentada para imitar uma medula fibrosa patológica. O processo de recuperação dos megacaitos para novas análises celulares também está detalhado no protocolo. Embora a extensão de proplato é impedida dentro do meio 3D, ela é descrita abaixo como resuspend os megacaitos em meio líquido e quantificar sua capacidade de estender proplatelets. Os megacariócitos cultivados em hidrogel 3D têm maior capacidade de formar proplatelets em comparação com aqueles cultivados em um meio líquido. Esta cultura 3D permite i) diferenciar progenitores em direção a megacaitos que atingem um estado de maturação mais elevado, ii) para recapitular fenótipos que podem ser observados in vivo, mas passam despercebidos nas culturas líquidas clássicas, e iii) para estudar vias de transdução induzidas pelas pistas mecânicas fornecidas por um ambiente 3D.
As células do corpo experimentam um complexo microambiente 3D e são submetidas à interação entre pistas químicas e mecanofísicas, incluindo rigidez do tecido e confinamento devido às células vizinhas e matriz circundante 1,2,3. A importância da rigidez e confinamento para o comportamento celular só foi reconhecida nas últimas décadas. Em 2006, o trabalho seminal da Engler et al. 4 destacou a importância do ambiente mecânico para a diferenciação celular. Os autores demonstraram que a variação da rigidez do substrato celular resultou na orientação das células-tronco para várias linhagens de diferenciação. Desde então, o impacto das pistas mecânicas sobre o destino e o comportamento celular tornou-se cada vez mais reconhecido eestudado. Apesar de ser um dos tecidos mais moles do organismo, a medula óssea tem uma organização estrutural 3D que está confinada dentro do osso. A rigidez da medula, embora tecnicamente difícil de medir com precisão, é estimada entre 15 e 300 Pa 5,6. Dentro do estroma, as células estão bem confinadas umas às outras. Além disso, a maioria deles está migrando em direção aos vasos sinusoides para entrar na circulação sanguínea. Essas condições criam restrições mecânicas adicionais em células adjacentes, que têm que se adaptar a essas forças. As pistas mecânicas representam um parâmetro importante cujas consequências sobre a diferenciação de megacariote e a formação de proplatelets foram recentemente exploradas. Embora os megacaiócitos possam diferenciar in vitro na cultura líquida tradicional, eles não atingem o grau de maturação observado in vivo,em parte devido à ausência das pistas mecânicas do ambiente 3D 7. Progenitores em crescimento embutidos em hidrogel traz pistas mecânicas 3D que estão faltando em meio líquido.
Hidrogéis têm sido amplamente utilizados por várias décadas no campo hematológico, notadamente para cultivar células em colônias formando ensaios para quantificar progenitores hematopoiéticos. No entanto, esses hidrogéis raramente têm sido usados para explorar o impacto biológico do ambiente mecânico 3D na maturação e diferenciação das células hematopoiéticas. Nos últimos anos, nosso laboratório desenvolveu um modelo de cultura 3D usando um hidrogel à base de metilcelulose 8. Este gel físico não reativo é uma ferramenta útil para imitar as restrições físicas do ambiente de megacaiócito nativo. É derivado da celulose pela substituição de resíduos de hidroxílico (-OH) por grupos de metoóxido (-OCH3). Tanto o grau de substituição de metila quanto a concentração de metilcelulose determinam a rigidez do hidrogel uma vez que tenha gelatinado. Durante a fase de desenvolvimento desta técnica, foi demonstrado que o módulo de um Young na faixa de 30 a 60 Pa é a rigidez de gel ideal para o crescimento de megacariocíte 9.
O protocolo a seguir descreve um método para cultivar progenitores megacariocíticos de camundongos em um hidrogel de metilcelulose 3D. Foi demonstrado anteriormente que, em comparação com a cultura líquida padrão, essa cultura de hidrogel aumenta o grau de poliploidização de megacaitos, melhora a maturação e organização intracelular, e aumenta a capacidade de megacaiócitos para estender proplatelets uma vez resuspended em um meio líquido 9. Este manuscrito descreve em detalhes o protocolo para o isolamento das células lin- da medula óssea do rato e sua incorporação em um hidrogel de metilcelulose para cultura 3D, bem como a quantificação de sua capacidade de produzir proplatas e a recuperação das células para análises posteriores.
Todos os experimentos devem ser realizados em conformidade com as diretrizes institucionais para o cuidado e uso de animais de laboratório. Todos os protocolos exibidos no vídeo foram realizados em estrita conformidade com a lei europeia e as recomendações do Conselho de Revisão do Etablissement Français du Sang (EFS). Uma primeira versão deste protocolo foi originalmente publicada em 2018 em Métodos em Biologia Molecular 8.
NOTA: A Figura 1 apresenta uma visão esquemática de todo o processo. Este processo inclui 1) dissecção óssea, recuperação de medula e isolamento mecânico de células de medula, 2) classificação magnética de células negativas de linhagem (Lin-) células, 3) semeadura em hidrogel líquido ou metilcelulose, e 4) resuspensão de megacaitos cultivados em gel 3D para exame da formação de propetato em meio líquido.
1. Coleta óssea de ratos adultos
NOTA: Nesta seção, é importante minimizar a contaminação microbiana.
2. Dissociação de medula e isolamento de células Lin
NOTA: Esta parte do protocolo é realizada sob um capô de fluxo laminar. Para uma cultura, todos os poços fazem parte do mesmo experimento e não podem ser considerados como réplicas biológicas independentes. As células de todos os camundongos são agrupadas para garantir a homogeneidade de todos os poços e para serem capazes de compará-los uns com os outros, eliminando uma possível variabilidade inter-individual. Para réplicas biológicas independentes, a cultura deve ser repetida.
3. Incorporação celular em hidrogel de metilcelulose
NOTA: Observe que o protocolo a seguir descreve o método para obter um único poço de cultura de células hidrogel, adaptar-se ao número de poços necessários.
4. Ressuspensão celular para análise de proplatelet
NOTA: A análise da capacidade de formação de proplatelets deve ser realizada em condições comparáveis entre megacariócitos cultivados líquidos e metilcelulose. As restrições físicas exercidas pelo hidrogel de metilcelulose inibem a extensão proplatelet. Portanto, as células cultivadas com metilcelulose são resuspengiadas em meio líquido fresco no terceiro dia de cultura para permitir que elas ampliem proplatelets. O hidrogel de metilcelulose é um hidrogel físico que é facilmente diluído em cima da adição líquida. É importante ressaltar que, para evitar artefatos de ressuspensão e centrifugação, as células no meio líquido de controle devem ser tratadas simultaneamente da mesma forma que as células cultivadas com metilcelulose. Consulte a representação esquemática do experimento(Figura 1).
5. Fixação celular e recuperação para análises futuras
ATENÇÃO: Este protocolo utiliza fixações que devem ser manuseadas sob um capô de fumaça, usando equipamentos de proteção.
NOTA: O objetivo é manter intactas as restrições de gel aplicadas nas células até que estejam totalmente fixas. Portanto, e independentemente do fixador utilizado, deve ser adicionado no poço em cima do metilcelulose, sem perturbar o gel. O mesmo protocolo é aplicado às culturas líquidas.
Os dados obtidos por este protocolo foram originalmente publicados no Blood em 20169.
De acordo com o protocolo, as células foram semeadas em meio de hidrogel líquido ou metilcelulose. As células em meio líquido têm todos sedimentados na parte inferior do poço, em contato com a superfície plástica rígida e em algum momento com outras células. Em contraste, as células embutidas no hidrogel de metilcelulose são distribuídas de forma homogênea no gel e são i...
Na década anterior, a mecanobiologia tem levantado cada vez mais interesse em muitas áreas da biologia. É comumente reconhecido que o ambiente mecânico ao redor das células desempenha um papel em seu comportamento, enfatizando a importância de estudar como os megacaiócitos sentem e respondem a sinais mecânicos extracelulares. É desafiador medir com precisão a rigidez do tecido da medula óssea no situ11, especialmente se considerarmos a medula vermelha hematopoiética, pois est?...
Os autores não têm nada a revelar.
Os autores gostariam de agradecer a Fabien Pertuy e Alicia Aguilar que inicialmente desenvolveram essa técnica no laboratório, bem como Dominique Collin (Institut Charles Sadron - Estrasburgo) que caracterizaram as propriedades viscoelasticas do hidrogel de metilcelulose. Este trabalho foi apoiado pela ARMESA (Association de Recherche et Développement en Médecine et Santé Publique) e por uma bolsa ARN (ANR-18-CE14-0037 PlatForMechanics). Julie Boscher é beneficiária da Fondation pour la Recherche Médicale (número de subvenção da FRM FDT202012010422).
Name | Company | Catalog Number | Comments |
18-gauge needles | Sigma-Aldrich | 1001735825 | |
21-gauge needles | BD Microlance | 301155 | |
23-gauge needles | Terumo | AN*2332R1 | |
25-gauge neeldes | BD Microlance | 300400 | |
4-well culture dishes | Thermo Scientific | 144444 | |
5 mL syringes | Terumo | SS+05S1 | |
Cytoclips | Microm Microtech | F/CLIPSH | |
Cytofunnels equiped with filter cards | Microm Microtech | F/JC304 | |
Cytospin centrifuge | Thermo Scientific | Cytospin 4 | |
Dakopen | Dako | ||
DMEM 1x | Gibco, Life Technologies | 41 966-029 | |
DPBS | Life Technologies | 14190-094 | Sterile Dulbecco’s phosphate-buffered saline |
EasySep magnets | Stem Cell Technologies | 18000 | |
EasySep Mouse Hematopoietic Progenitor Cell isolation Kit | Stem Cell Technologies | 19856A | biotinylated antibodies (CD5,CD11b, CD19, CD45R/B220, Ly6G/C(Gr-1), TER119,7–4) and streptavidin-coated magnetic beads |
EDTA | Invitrogen | 15575-020 | |
Fetal Bovine Serum | Healthcare Life Science | SH30071.01 | |
Luer lock 1 mL syringes | Sigma-Aldrich | Z551546-100EA | or 309628 syringes from BD MEDICAL |
Luer lock syringes connectors | Fisher Scientific | 11891120 | |
MC 3% | R&D systems | HSC001 | |
Polylysin coated slides | Thermo Scientific | J2800AMNZ | |
PSG 100x | Gibco, Life Technologies | 1037-016 | 10,000 units/mL penicillin, 10,000 μg/mL streptomycin and 29.2 mg/mL glutamine |
Rat serum | Stem Cell Technologies | 13551 | |
Recombinant hirudin | Transgène | rHV2-Lys47 | |
Recombinant human trombopoietin (rhTPO) | Stem Cell Technologies | 2822 | 10,000 units/mL |
Round bottomed 10 mL plastique tubes | Falcon | 352054 | |
Round bottomed 5 mL polystyrene tubes |
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