תרבות Megakaryocyte בהידרוג'ל מבוסס מתילצלולוז תלת מימדי לשיפור התבגרות התאים וחקר ההשפעה של נוקשות וכליאה

Summary

כיום ידוע כי הסביבה התלת ממדית של התאים יכולה למלא תפקיד חשוב בהתנהגותם, בהבשלתם ו/או בבידולם. פרוטוקול זה מתאר מודל תרבית תאים תלת מימדי שנועד לחקור את ההשפעה של בלימה פיזית ואילוצים מכניים על megakaryocytes.

Abstract

הסביבה 3D המוביל הן כליאה ואילוצים מכניים מזוהה יותר ויותר כגורם מכריע חשוב של התנהגות התא. לפיכך, פותחה תרבות תלת-ממד כדי לגשת טוב יותר למצב ה-in vivo. Megakaryocytes להבדיל גזע hematopoietic ותאי אבות (HSPCs) במח העצם (BM). BM היא אחת הרקמות הרכות ביותר של הגוף, מרותק בתוך העצם. העצם להיות מתרחב בצורה גרועה בסולם התא, megakaryocytes כפופים במקביל נוקשות חלשה וכליאה גבוהה. פרוטוקול זה מציג שיטה לשחזור של שושלת העכבר שלילית (Lin-) HSPCs על ידי מיון אימונו-מגנטי ואת הבידול שלהם לתוך megakaryocytes בוגר במדיום 3D המורכב methylcellulose. Methylcellulose אינו מגיב כלפי megakaryocytes ואת נוקשותו ניתן להתאים לזה של מח עצם נורמלי או מוגבר כדי לחקות מח פירוטי פתולוגי. התהליך לשחזור megakaryocytes עבור ניתוחי תאים נוספים מפורט גם בפרוטוקול. למרות הרחבת proplatelet נמנע בתוך המילייה 3D, הוא מתואר להלן כיצד resuspend megakaryocytes במדיום נוזלי לכמת את יכולתם להרחיב את הנפצים. Megakaryocytes גדל הידרוג'ל 3D יש יכולת גבוהה יותר ליצור מפיץ לעומת אלה גדלו milieu נוזלי. תרבות תלת-ממדית זו מאפשרת i) להבדיל בין אבות לכיוון megakaryocytes להגיע למצב התבגרות גבוה יותר, ii) כדי לשחזר פנוטיפים שניתן לראות ב vivo אבל ללכת מעיניו בתרבויות נוזליות קלאסיות, ו - iii) כדי ללמוד מסלולי טרנסאדוקציה המושרה על ידי רמזים מכניים המסופקים על ידי סביבה 3D.

Introduction

תאים בגוף חווים מיקרו-סביבה תלת-ממדית מורכבת והם נתונים ליחסי הגומלין בין רמזים כימיים ומכנופיזיים כולל נוקשות מהרקמה וכליאה עקב תאים שכנים ומטריצת ^1,2,3. החשיבות של נוקשות וכליאה להתנהגות התא הוכרה רק בעשורים האחרונים. בשנת 2006, העבודה המכוננת של אנגלר ואח ^{'4 הדגישה} את החשיבות של הסביבה המכנית לבידול תאים. המחברים הדגימו כי וריאציה נוקשות מצע התא הביאה לכיוון של תאי גזע לכיוון שושלות בידול שונות. מאז, ההשפעה של רמזים מכניים על גורל התא והתנהגות הפך מוכר יותר ויותר ונלמד. למרות היותו אחד הרקמות הרכות ביותר של האורגניזם, מוח העצם יש ארגון מבני 3D כי הוא מוגבל בתוך העצם. נוקשות מח העצם, אם כי מבחינה טכנית קשה למדוד במדויק, מוערך לשקר בין 15 ל 300 Pa ^5,6. בתוך הסטרומה, התאים מוגבלים זה לזה. בנוסף, רובם נודדים לכיוון כלי הסינוסואידים כדי להיכנס למחזור הדם. תנאים אלה יוצרים אילוצים מכניים נוספים על תאים סמוכים, אשר צריכים להסתגל לכוחות אלה. רמזים מכניים מייצגים פרמטר חשוב שהשלכותיו על בידול מגה-קריוציטים ויצירת פרופלטלטים נחקרו רק לאחרונה. למרות megakaryocytes יכול להבדיל במבחנה בתרבות נוזלית מסורתית, הם לא מגיעים את מידת ההתבגרות שנצפו ב vivo, בין היתר בשל היעדר רמזים מכניים מסביבה 3D ⁷. גידול אבות המוטמעים הידרוג'ל מביא רמזים מכניים 3D כי הם חסרים מילייה נוזלי.

הידרוג'לים היו בשימוש נרחב במשך כמה עשורים בתחום ההמטולוגי, במיוחד כדי לגדל תאים במושבה ויוצרים התקפות כדי לכמת אבות hematopoietic. עם זאת, הידרוג'לים כאלה שימשו לעתים רחוקות כדי לחקור את ההשפעה הביולוגית של הסביבה המכנית 3D על התבגרות ובידול של תאים hematopoietic. במהלך השנים האחרונות המעבדה שלנו פיתחה מודל תרבות תלת מימד באמצעות הידרוג'ל מבוסס מתיל צלולוז ^8. ג'ל פיזי לא פעיל זה הוא כלי שימושי כדי לחקות את האילוצים הפיזיים של הסביבה megakaryocyte המקומית. הוא נגזר תאית על ידי החלפת שאריות הידרוקסיל (-OH) על ידי קבוצות מתאוקסיד (-OCH_3). הן מידת החלפת המתיל והן ריכוז המתיל צלולוז קובעים את נוקשות ההידרוגל ברגע שהוא מתמזג. במהלך שלב הפיתוח של טכניקה זו, הוכח כי מודולוס של יאנג בטווח של 30 עד 60 Pa הוא נוקשות הג'ל האופטימלית לצמיחת megakaryocyte ⁹.

הפרוטוקול הבא מתאר שיטה לגדל אבות מקרוציטים עכבר בהידרוג'ל מתיל צלולוז תלת-ממדי. הוכח בעבר כי בהשוואה לתרבות נוזלית סטנדרטית, תרבות הידרוג'ל זו מגדילה את מידת הפוליטואידיזציה של מגהקריוציטים, משפרת את ההבשלה ואת הארגון התאי, ומגבירה את הקיבולת של מגהקריוציטים להרחיב את ההפצפות לאחר תפירה מחדש במדיום נוזלי ⁹. כתב יד זה מתאר בפירוט את הפרוטוקול לבידוד של תאי לין עצם העכבר והטבעתם בהידרוג'ל מתילצלולוז לתרבות תלת-ממדית, כמו גם לכימות יכולתם לייצר פרופלטלטים והתאוששות התאים עבור ניתוחים נוספים.

Protocol

כל הניסויים צריכים להתבצע בהתאם להנחיות המוסדיות לטיפול ושימוש בחיות מעבדה. כל הפרוטוקולים המוצגים בסרטון בוצעו בהתאם לחוק האירופי ולהמלצות ועדת הבדיקה של פרנסאיס דו סאנג (EFS). גרסה ראשונה של פרוטוקול זה פורסמה במקור בשנת 2018 בשיטות בביולוגיה ^{מולקולרית 8}.

הערה: איור 1 מציג תצוגה סכמטית של כל התהליך. תהליך זה כולל 1) ניתוח עצם, אחזור מח עצם, ובידוד מכני של תאי מח עצם, 2) מיון מגנטי של תאים שליליים שושלת (Lin-), 3) זריעה הידרוג'ל נוזלי או methylcellulose, ו 4) resuspension של megakaryocytes גדל ג'ל 3D לבדיקת היווצרות proplatelet במדיום נוזלי.

1. אוסף עצמות מעכברים בוגרים

הערה: בסעיף זה, חשוב למזער זיהום מיקרוביאלי.

1. הכן צינור 15 מ"ל לאיסוף עצמות עם המדיום של הנשר המותאם של Dulbecco (DMEM) המכיל 1% מהנפח הכולל של תערובת אנטיביוטית פניצילין-סטרפטומיצין-גלוטמין (PSG) (פניצילין 10000 U/mL, סטרפטומיצין 100000 מיקרוגרם/מ"ל ו-L-גלוטמין 29.2 מ"ג/מ"ל).
   הערה: אם כל העכברים המשמשים יש את אותו genotype, לאגור את כל העצמות באותו צינור המכיל 1 מ"ל של DMEM - PSG 1% לכל מספר עכברים. אנטיביוטיקה חשובה כדי למנוע התפשטות חיידקים אפשרית בזמן דגימת העצם.
2. מלא צינור 50 מ"ל עם אתנול 70% לחיטוי עצם ועוד אחד עבור מכשירי שטיפה במהלך ההליך. השתמש בכלי ניתוח מעוקרים.
3. להרדים את העכברים באמצעות שאיפת איזופלוראן (4%) ולהמשיך במהירות אל פריקת צוואר הרחם כדי להרדים את העכברים. לטבול במהירות את הגוף ב 70% אתנול כדי לחטא ולהימנע זיהום מיקרוביאלי.
4. לנתח במהירות את השוקה ואת עצם הירך.
5. באמצעות אזמל, לחתוך את epiphyses של קצה הצד הקרסול עבור השוקה ואת קצה הצד הירך עבור עצם הירך.
6. לטבול את העצמות לשנייה אחת ב 70% אתנול לפני טבילת אותם במדיום DMEM המכיל 1% PSG.

2. דיסוציאציה של מח עצם ובידוד תאי לין

הערה: חלק זה של הפרוטוקול מבוצע תחת מכסה המנוע של זרימה למינארית. עבור תרבות אחת, כל בארות הן חלק מאותו ניסוי ולא ניתן לראותן כמשכפלות ביולוגיות עצמאיות. התאים מכל העכברים מאוחדים יחד כדי להבטיח את ההומוגניות של כל בארות ולהיות מסוגלים להשוות אותם זה לזה תוך ביטול שונות בין-אישית אפשרית. עבור שכפולים ביולוגיים עצמאיים, יש לחזור על התרבות.

1. מניחים את העצמות בצלחת פטרי ומעלים אותן פעמיים בתמיסת מלח סטרילית של דולבק עם חוצץ פוספט (DPBS) כדי להסיר מזהמים פוטנציאליים.
2. הכן DMEM - 1% PSG בצינור 50 מ"ל.
   הערה: ספק 2 מ"ל של DMEM - 1% PSG לעכברים המשמשים לניסוי.
3. מלא מזרק 5 מ"ל מצויד במחט 21 מד עם DMEM - 1% PSG.
4. מחזיק את העצם עם מלקחיים, להציג רק את שיפוע המחט בקצה הצד הברך.
   הערה: האפיפיזה בצד הברך צריכה להישאר שלמה מהנתח, ומשאירה חלל קטן במרכזו שדרכו יש להכניס את המחט. האפיפיזה הנותרת תשמור על העצם המחוברת למחט במהלך השטיפה. היזהר לא להציג יותר מאשר שיכול העצם כפי שהוא עלול למעוך ולפגוע במח העצם.
5. לחץ במהירות על בוכנה המזרק כדי לשטוף את מוח העצם לתוך צינור 50 מ"ל.
   הערה: כדי למנוע התזות ולהקל על שטיפה מח ושחרור למקם את הקצה החופשי של העצם על קיר הצינור, שקוע DMEM - 1% PSG. בפועל, נפח בין 500 μL ו 1 מ"ל הוא בדרך כלל מספיק כדי לגרש את המח מן העצם. כאשר מוח ההשחת גורש לחלוטין, העצם הפכה ללבינה. במקרה מח העצם לא גורש לחלוטין מן הדיאפיזה כפי שנשפט על ידי כמה צבע אדום שנותר, ניתן לחזור על סומק עם מדיום טרי.
6. חזור על שלבים 2.4. ו-2.5. עבור כל העצמות, מילוי מזרק 5 מ"ל עם DMEM - 1% PSG במידת הצורך.
7. השתמש באותו מזרק 5 מ"ל עם מחט 21-מד להעביר את הנפח הכולל של בינוני המכיל מח סומק לתוך צינורות 10 מ"ל עגולים.
   הערה: אין צורך בהחלט לעבור לצינור עגול עם תחתית 10 מ"ל, אך זה מקל על המשך לשלבי הניתוק הבאים. אל תהססו להחליף מזרק ו/או מחט אם קיים חשד לזיהום.
8. המשך לניתוק התא על ידי שאיפה וסילוק תאי בינוני ומח עצם ברציפות פעמיים באמצעות מחט 21-מד, שלוש פעמים דרך מד 23 ופעם דרך מחט 25-מד.
   הערה: הימנע בועות אוויר כפי שהוא עלול להיות מזיק עבור התאים.
9. העבר את ההשעיה לצינורות 15 מ"ל.
10. מדוד את מספר התא ובדוק את הכדאיות באמצעות מונה תאים אוטומטי או תא תא לספירה ידנית בנוכחות כחול טריפן כדי לא לכלול תאים מתים.
11. צנטריפוגה צינורות 15 מ"ל במשך 7 דקות ב 300 x g. באמצעות פיפטה העברה 1 מ"ל, בזהירות pipette החוצה להשליך את supernatant.
12. לבודד תאי גזע ואבות על ידי מיון אימונומי שלילי באמצעות ערכת בידוד תאים hematopoietic עכבר.
    הערה: מטרת מיון תאים זה היא לאחזר את התאים השליליים עבור כל נוגדני הבחירה (CD5, CD11b, CD19, CD45R/B220, Ly6G/C(Gr-1), TER119, 7-4) ולכן לחסל את התאים שכבר עוסקים בשושלת בידול שאינה זו המגקריוציטית.
13. בעקבות הוראות הערכה, resuspend הכדור התאי בינוני M מוכן טרי (PBS עם 2% של הנפח הסופי של סרום בקר עוברי (FBS), EDTA 1 mM) לריכוז של 1 × 10⁸ תאים / מ"ל ולהפיץ את המתלה בצינורות פוליסטירן 5 מ"ל עגול לנפח מרבי של 2 מ"ל.
14. הוסף צינורות פוליסטירן: סרום חולדה רגיל בריכוז של 50 μL / mL, כמו גם תערובת נוגדנים ביוטינילציה (CD5, CD11b, CD19, CD45R / B220, Ly6G / C (Gr-1), TER119, 7-4) בריכוז של 50 μL של תערובת לכל mL הומוגניזציה על ידי הבהוב עדין של הצינורות.
    הערה: נוגדנים אלה ייקשרו לתאים שכבר עוסקים במסלול בידול למעט המסלול המגקריוציטי.
15. לדגור על הצינורות על קרח במשך 15 דקות.
16. מוסיפים חרוזים מגנטיים מצופים סטרפטאבידין בריכוז של 75 μL/mL ומותגנים על ידי הבהוב עדין של הצינורות.
17. לדגור שוב על קרח במשך 10 דקות.
18. במידת הצורך, הסתגל לנפח סופי של 2.5 מ"ל לכל צינור עם בינוני M.
19. הומוגניזציה המתלה על ידי לחיצה עדינה על הצינור ממש לפני הצבתם, ללא כובעיהם, בתוך מגנט ולחכות שלוש דקות.
    הערה: התאים שכבר עוסקים במסלול בידול ומצופה חרוזים מגנטיים יישמרו על קיר הצינור בתוך המגנט.
20. הפוך מגנט וצינור כדי להעביר את תוכן הצינור לתוך צינור פוליסטירן 5 מ"ל עגול חדש.
    הערה: אל תוציא את הצינור מהמגנט להעברה; זה נעשה על ידי היפוך המגנט עם הצינור עדיין ב. השתמש בתנועה יציבה ולא לנער את הצינור.
21. השליכו את הצינור הראשוני המכיל תאים בעלי תווית מגנטית לא רצויים והכניסו את החדש, ללא המכסה שלו, למגנט למשך שלוש דקות נוספות.
22. ממשיכים כמו בשלב 2.20, להעביר את תאי לין− מבודדים לתוך צינור חדש 15 מ"ל.
    הערה: אם כמה צינורות פוליסטירן 5 מ"ל שימשו עבור השלבים הקודמים, לאגד את כל התאים באותו צינור 15 מ"ל. התאים שנמצאו לאחר מיון התאים הם תאי גזע hematopoietic אבות. נוכחותו של תרומבואיטין (TPO), הרגולטור הפיזיולוגי העיקרי של megakaryopoiesis ¹⁰, יכוון את בידול התא לכיוון קו התא המגקריוציטי.
23. מדוד את מספר התא Lin− ואת הכדאיות כמו בשלב 2.10.
24. חשב את הנפח הנדרש של השעיית תאים לצנטריפוגה כדי שיהיו 1 x 10⁶ תאים בני קיימא x מספר באר, מספר ובכן הוא מספר בארות לזרע לכל תנאי.
25. הכן שפופרת אחת לכל תנאי עם הנפח המתאים של השעיית תאים וצנטריפוגה ב 300 x g במשך 7 דקות.
26. עבור תרביות נוזליות, להשליך את supernatant ו resuspend גלולה התא במדיום תרבית מלאה (DMEM, PSG 1% של הנפח הסופי, FBS 10% של הנפח הסופי, hirudin 100 U / mL, TPO 50 ng / mL) כדי להשיג את הריכוז הסופי של 2 × 10⁶ תאים קיימא / מ"ל (שווה ל 1 × 10⁶ תאים לכל 500 μL טוב). לדגור על התאים ב 37 °C (5% CO2). (= יום 0 של תרבות)
    הערה: עיין בפסקה הבאה עבור תרבויות methylcellulose כדוגמה, כדי להכין מדיום תרבות מלאה עבור באר אחת, להשתמש 435 μL של DMEM, 50 μL של 100% FBS עבור 10% סופי, 5 μL של 100% PSG עבור 1% סופי, 5 μL של 10 000 U / mL עבור 100 U / mL סופי ו 5 μL של 5 מיקרוגרם / mL TPO עבור 50 ng / mL סופי. 4 - טוב או 24- צלחות תרבות משמשים בדרך כלל כמו קוטר הבאר שלהם הוא התאמה טובה עבור 500 μL הדרושים לבאר.

3. הטמעת תאים בהידרוג'ל מתילצלולוז

הערה: שים לב כי הפרוטוקול הבא מתאר את השיטה להשגת באר אחת של תרבית תאים הידרוג'ל, להתאים את מספר הבארות הדרושות.

1. הפשר 1 מ"ל aliquots של 3% פתרון מלאי methylcellulose בטמפרטורת החדר. הכן אליקוט נוסף נפרד של מתיל צלולוז לציפוי מזרק.
   הערה: בריכוז של 3%, מתיל צלולוז נשאר נוזלי בטמפרטורת החדר (20-25 מעלות צלזיוס).
2. מעיל מזרק מנעול Luer 1 מ"ל מצויד במחט 18 מד עם methylcellulose על ידי ציור 1 מ"ל של methylcellulose מן aliquot נוסף. לגרש לחלוטין את המתילסלוז.
   הערה: שלב ציפוי זה מבטיח כי נפח מתיל צלולוז שנאסף בשלב 3.3 הוא מדויק.
3. עם אותו מזרק ומחט, אבל באמצעות עליקוט מתילקולוז חדש, צייר את הנפח המתאים של מתילצלולוז(איור 2A).
   הערה: כדי להשיג ריכוז סופי של 2% methylcellulose בנפח סופי של 500 μL לכל טוב, 333 μL של 3% methylcellulose נדרש.
4. הסר בזהירות את המחט. באמצעות מלקחיים מעוקרים, בורג מחבר מנעול Luer על קצה המזרק(איור 2B-C).
5. חבר מזרק מנעול לולר שני, שאינו מצופה, 1 מ"ל למחבר מנעול Luer כדי לחבר את שני המזרקים יחד(איור 2D).
   הערה: אין צורך לצפות את המזרק השני.
6. חלקו באותה מידה את נפח המתיל צלולוז בין שני המזרקים(איור 2E)ושימו אותם בצד עד לשלב 3.11.
7. הכן את המדיום המרוכז של תרבות ה- DMEM כדי להשיג בנפח המתיל צלולוז הסופי (שלב 3.11) ריכוז זהה לזה של המדיום של התרבות הנוזלית עבור כל תרכובת (PSG 1% מהנפח הסופי, FBS 10% מהנפח הסופי, hirudin 100 U / mL, TPO 50 ננוגרם / מ"ל).
   1. הכן 167 μL של מדיום תרבות מרוכזת לבאר סופית של 1 × 10⁶ תאים. נפח זה של בינוני מחושב כדי להשיג ריכוז מתיל צלולוז סופי של 2%. הנפח הכולל בבאר יהיה 500 μL (167 μL של השעיית תאים במדיום תרבות מרוכז + 333 μL של methylcellulose) וכל הרכיבים יהיה ריכוז זהה לזה בבארות נוזליות.
   2. לדוגמה, כדי להכין מדיום תרבות מלא עבור באר אחת, להשתמש 102 μL של DMEM, 50 μL של 100% FBS עבור 10% סופי, 5 μL של 100% PSG עבור 1% סופי, 5 μL של 10 000 U / mL עבור 100 U / mL סופי ו 5 μL של 5 מיקרוגרם / mL TPO עבור 50 ng / mL סופי. זה נותן נפח של 167 μL המשמש כדי resuspend התאים ועם תוספת של 333 μL של methylcellulose הנפח הסופי יהיה 500 μL.
8. לאחר השלמת שלב הצנטריפוגה 2.26, להשליך את supernatant ולחזק מחדש את גלולה התא במדיום התרבות המרוכז ביחס של 1 × 10⁶ תאים לכל 167 μL.
9. קח בחזרה את המזרקים ותנתק אחד מהם מהמחבר.
10. פיפטה 167 μL של השעיית התא.
11. הוסף את מתלה התא ישירות למחבר המזרק (איור 2F), והקפידו לא להציג בועות אוויר.
    הערה: בעת הוספת מתלה התא, לאט לצייר את הבוכנה מזרק בו זמנית כדי לפנות קצת מקום עבור השעיית התא.
12. התחברו מחדש בזהירות בין שני המזרקים (איור 2G) מבלי לאבד כל השעיה בחוט הבורג.
    הערה: לפני החיבור מחדש, צייר את הבוכנה על מנת להשאיר את המחבר חצי ריק ולתת מספיק מקום למזרק השני להתחבר ללא ההשעיה עולה על גדותיו.
13. לאט לאט הנדסי את המדיום המתילצלולוז עם מתלה התא עם עשר תנועות בוכנה הלוך ושוב בין שני המזרקים(איור 2H).
14. צייר את אמצעי האחסון הכולל למזרק אחד וניתק את שני המזרקים, והשאר את המחבר על המזרק הריק.
15. רוקנו את תכולת המזרק לבאר של צלחת בעלת 4 בארות(איור 2I).
16. לדגור את התאים ב 37 °C (5% CO₂₎ (= יום 0 של תרבות).
    הערה: ניתן להכין שתי בארות מתיל צלולוז עם זוג מזרקים אחד. הגדל בשניים את נפח המתילצלולוז ואת נפח השעיית התא יש 2 x10⁶ תאים. לאחר השלמת שלב 3.13. להפיץ את אמצעי האחסון באופן שווה בין שני המזרקים כדי לקבל 500 μL בכל אחד מהם. נתק אותם ורוקן את זה ללא המחבר בבאר תרבות. צור מחדש את המזרקים כדי להעביר את אמצעי האחסון מזה שהחזיק את המחבר לשני. נתק את המזרקים, אחד עם 500 μL לא צריך להיות המחבר מחובר, ולזרוע את התאים היטב תרבית שנייה. המתיל צלולוז 3% נרכש כפתרון מניות במדיום (IMDM) של Iscove, בעוד תאים מרוכזים מושעים ב- DMEM. בדיקות השוואתיות נעשו בתחילה כדי לוודא כי למדיום מעורב זה לא הייתה השפעה על תוצאות הניסוי, במיוחד בהשוואה לתרבות הנוזלית ב- 100% DMEM.

4. חידוש תאים לניתוח פרופלטלט

הערה: ניתוח היכולת ליצור מפיץ צריך להתבצע בתנאים דומים בין נוזל מתילצלולוז גדל megakaryocytes. האילוצים הפיזיים המופעלים על ידי הידרוג'ל methylcellulose לעכב הרחבת proplatelet. לכן, תאים שגדלו methylcellulose הם resuspended במדיום נוזלי טרי ביום 3 של תרבות כדי לאפשר להם להרחיב את הנפצים. Methylcellulose הידרוג'ל הוא הידרוג'ל פיזי כי הוא מדולל בקלות על תוספת בינונית נוזלית. חשוב לציין, כדי למנוע חפצים מן resuspension ו centrifugation, תאים במצב בינוני נוזלי שליטה יש לטפל בו זמנית באותו אופן כמו תאים שגדלו methylcellulose. עיין בייצוג הסכמטי של הניסוי (איור 1).

1. הכן 10 מ"ל של DMEM - 1% PSG מחומם מראש ב 37 °C בצינור 15 מ"ל עבור כל באר כדי resuspend.
2. בזהירות respend התאים מכל באר ב 10 מ"ל של DMEM - 1% PSG.
   הערה: בצע בעדינות מספר תנועות למעלה ולמטה כדי לדלל את המתיל צלולוז לחלוטין. עבור בארות נוזליות הקפד לאסוף את כל התאים שהופקדו בתחתית הבאר.
3. צנטריפוגות הצינורות 5 דקות ב 300 × גרם.
4. בינתיים להכין בינוני תרבות מלאה (DMEM, PSG 1% של הנפח הסופי, FBS 10% של הנפח הסופי, hirudin 100 U / mL, TPO 50 ng / mL).
   הערה: בשלב זה כל באר מאוחזרת להיות מדוללת בחצי, ולכן להכין 1 מ"ל של מדיום תרבות מלאה לכל טוב.
5. להשליך את supernatant ו resuspend גלולה התא ב 1 מ"ל של מדיום תרבות עבור כל צינור.
6. תוסיפו 500 מיקרו-אל של השעיית תאים לבאר בצלחת של 4 או 24 בארות ודגרה ב-37 מעלות צלזיוס מתחת ל-5% CO_2.
   הערה: מבאר ראשונית אחת, להשיג 2 בארות עבור הדמיה proplatelet כפול. שים לב כי מכיוון שכפילויות אלה מקורן באותה דגימה, לא ניתן לראות בהן שכפולים עצמאיים.
7. 24 שעות לאחר ההסתה מחדש, ביום הרביעי של התרבות, לרכוש באופן אקראי 10 תמונות לבאר באמצעות מיקרוסקופיית שדה בהירה ואת המטרה 20×.
   הערה: התאים נוטים להתקבץ במרכז הבאר, הקפד לא להיות יותר מדי תאים על השדה כפי שהוא עלול להפוך הדמיה וכימות התפשטות קשה. הקפד ללכוד לפחות 5 מגה-קריוציטים לכל שדה.
8. לספור את המספר הכולל של megakaryocytes ושל megakaryocytes הרחבת proplatelets בכל תמונה ולחשב את החלק היחסי של megakaryocytes הרחבת פרופלטלטים.
   הערה: הכימות אינו אוטומטי; לבצע ספירת תאים באופן ידני. ספירה יכולה להיות הקלה על ידי השימוש תוסף מונה התא של ImageJ ללחוץ על התאים כדי לסמן אותם כפי שהם נספרים. 10 שדות שנרכשו לבאר ובארות כפולות מייצגים כ-150-300 מגה-קריוציטים לכל תנאי.

5. קיבוע ואחזור תאים עבור ניתוחים עתידיים

זהירות: פרוטוקול זה משתמש במתקנים אשר חייב להיות מטופל תחת מכסה המנוע אדים, לובש ציוד מגן.

הערה: המטרה היא לשמור על שלמות אילוצי הג'ל החלים על התאים עד שהם קבועים במלואם. לכן, וללא קשר קיבעון בשימוש, זה חייב להיות נוסף בבאר על גבי methylcellulose, מבלי להפריע ג'ל. אותו פרוטוקול חל על תרביות נוזליות.

1. הוסף נפח של פתרון קיבועי השווה לנפח הזרעים (500 μL בפרוטוקול זה), על גבי מתילצלולוז מבלי לשבש את הג'ל. המתן לזמן המתאים בהתאם לקיבוע המשמש (לפחות 10 דקות).
   הערה: דיפוזיה הקיבויעה לאורך הג'ל צריכה להיות מהירה מאוד כפי שנחשף על ידי שינוי מהיר בצבע הג'ל (מוורוד לגוון צהוב-כתום). Paraformaldehyde (8% ב DPBS, 500 μL לבאר) משמש בדרך כלל עבור אימונולבלינג, בעוד glutaraldhehyde (5% במאגר קקודילאט, 500 μL לבאר) משמש לניתוח מיקרוסקופיה אלקטרונית.
2. באמצעות פיפטה P1000 בעדינות לעשות כמה צינורות למעלה ולמטה עם הקיבוע ואת הג'ל כדי לדלל הומוגנית את methylcellulose.
3. באמצעות אותו פיפטה וטיפ, להעביר את כל הנפח מן הבאר לתוך צינור 15 מ"ל המכיל 10 מ"ל של DPBS הומוגניזציה.
4. צנטריפוגות התערובת ב 300 × גרם במשך 7 דקות.
   הערה: ייתכן שיהיה צורך בשלב שטיפה שני כדי לחסל את כל המתיל צלולוז
5. להשליך את supernatant ו resuspend גלולה megakaryocyte במדיום המתאים על פי הניתוח הרצוי (אימונולבבלינג, ציטומטריה^{זרימה 9}, מיקרוסקופיית אלקטרונים ...) (עבור מיקרוסקופיית אלקטרונים ראה גם את שיטת הנייר "בחקר במקום של השלבים העיקריים של megakaryopoiesis באמצעות מיקרוסקופיית אלקטרונים שידור" בגיליון זה JoVE).

תוצאות

נתונים שהושגו באמצעות פרוטוקול זה פורסמו במקור בדם בשנת 2016⁹.

על פי הפרוטוקול, התאים נזרעו במדיום הידרוג'ל נוזלי או מתיל צלולוז. תאים במדיום נוזלי יש כל משקעים בתחתית הבאר, במגע עם משטח פלסטיק נוקשה מתישהו עם תאים אחרים. לעומת זאת, תאים המוטמעים בהידרוג'ל מתילסלול...

Discussion

בעשור הקודם, המכנוביולוגיה עוררו יותר ויותר עניין בתחומים רבים של ביולוגיה. כיום מקובל להכיר בכך שהסביבה המכנית המקיפה את התאים ממלאת תפקיד בהתנהגותם, תוך הדגשת החשיבות ללמוד כיצד מגהקריוציטים חשים ומגיבים לרמזים מכניים חוץ-תאיים. זה מאתגר למדוד במדויק את נוקשות רקמת מח העצם במקום

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
18-gauge needles	Sigma-Aldrich	1001735825
21-gauge needles	BD Microlance	301155
23-gauge needles	Terumo	AN*2332R1
25-gauge neeldes	BD Microlance	300400
4-well culture dishes	Thermo Scientific	144444
5 mL syringes	Terumo	SS+05S1
Cytoclips	Microm Microtech	F/CLIPSH
Cytofunnels equiped with filter cards	Microm Microtech	F/JC304
Cytospin centrifuge	Thermo Scientific		Cytospin 4
Dakopen	Dako
DMEM 1x	Gibco, Life Technologies	41 966-029
DPBS	Life Technologies	14190-094	Sterile Dulbecco’s phosphate-buffered saline
EasySep magnets	Stem Cell Technologies	18000
EasySep Mouse Hematopoietic Progenitor Cell isolation Kit	Stem Cell Technologies	19856A	biotinylated antibodies (CD5,CD11b, CD19, CD45R/B220, Ly6G/C(Gr-1), TER119,7–4) and streptavidin-coated magnetic beads
EDTA	Invitrogen	15575-020
Fetal Bovine Serum	Healthcare Life Science	SH30071.01
Luer lock 1 mL syringes	Sigma-Aldrich	Z551546-100EA	or 309628 syringes from BD MEDICAL
Luer lock syringes connectors	Fisher Scientific	11891120
MC 3%	R&D systems	HSC001
Polylysin coated slides	Thermo Scientific	J2800AMNZ
PSG 100x	Gibco, Life Technologies	1037-016	10,000 units/mL penicillin, 10,000 μg/mL streptomycin and 29.2 mg/mL glutamine
Rat serum	Stem Cell Technologies	13551
Recombinant hirudin	Transgène	rHV2-Lys47
Recombinant human trombopoietin (rhTPO)	Stem Cell Technologies	2822	10,000 units/mL
Round bottomed 10 mL plastique tubes	Falcon	352054
Round bottomed 5 mL polystyrene tubes