Культура мегакариоцитов в 3D-гидрогеле на основе метилцеллюлозы для улучшения созревания клеток и изучения влияния жесткости и удержания

Резюме

В настоящее время признано, что трехмерная среда клеток может играть важную роль в их поведении, созревании и / или дифференцировки. Этот протокол описывает трехмерную модель клеточной культуры, предназначенную для изучения влияния физической локализации и механических ограничений на мегакариоциты.

Аннотация

3D-среда, приводящая как к ограничению, так и к механическим ограничениям, все чаще признается в качестве важного детерминанта поведения клеток. Таким образом, 3D-культура была разработана для лучшего подхода к ситуации in vivo. Мегакариоциты дифференцируются от гемопоэтических стволовых и прогениторных клеток (HSPC) в костном мозге (BM). БМ является одной из самых мягких тканей тела, заключенной внутри кости. Поскольку кость плохо растяжима в клеточном масштабе, мегакариоциты одновременно подвергаются слабой жесткости и высокой конфайнментности. В этом протоколе представлен метод восстановления отрицательных (Lin-) HSPC линии мыши путем иммуномагнитной сортировки и их дифференцировки в зрелые мегакариоциты в 3D-среде, состоящей из метилцеллюлозы. Метилцеллюлоза не реагирует по отношению к мегакариоцитам, и ее жесткость может быть скорректирована до нормального костного мозга или увеличена, чтобы имитировать патологический фиброзный костный мозг. Процесс восстановления мегакариоцитов для дальнейших клеточных анализов также подробно описан в протоколе. Хотя расширение проплатлетов предотвращается в 3D-среде, ниже описано, как повторно суспендировать мегакариоциты в жидкой среде и количественно оценить их способность расширять проplatelets. Мегакариоциты, выращенные в 3D-гидрогеле, обладают более высокой способностью к образованию проплацетов по сравнению с теми, которые выращиваются в жидкой среде. Эта 3D-культура позволяет i) дифференцировать прародителей в сторону мегакариоцитов, достигающих более высокого состояния созревания, ii) рекапитулировать фенотипы, которые могут наблюдаться in vivo, но оставить незамеченными в классических жидких культурах, и iii) изучать пути трансдукции, индуцированные механическими сигналами, предоставляемыми 3D-средой.

Введение

Клетки в организме испытывают сложную 3D-микросреду и подвергаются взаимодействию между химическими и механофизическими сигналами, включая жесткость из ткани и ограничение из-за соседних клеток и окружающих матриц ^1,2,3. Важность жесткости и удержания для поведения клеток была признана только в последние десятилетия. В 2006 году основополагающая работа Engler et al. ⁴ подчеркнула важность механической среды для дифференцировки клеток. Авторы продемонстрировали, что изменение жесткости клеточного субстрата привело к ориентации стволовых клеток на различные линии дифференцировки. С тех пор влияние механических сигналов на судьбу и поведение клеток становится все более признанным иизученным. Несмотря на то, что это одна из самых мягких тканей организма, костный мозг имеет 3D-структурную организацию, которая ограничена внутри кости. Жесткость костного мозга, хотя технически трудно измерить точно, по оценкам, лежит между 15 и 300 Па ^5,6. Внутри стромы клетки плотно ограничены друг другом. Кроме того, большинство из них мигрируют в сторону синусоидальных сосудов, чтобы войти в кровообращение. Эти условия создают дополнительные механические ограничения на соседние клетки, которые должны приспосабливаться к этим силам. Механические сигналы представляют собой важный параметр, последствия которого для дифференцировки мегакариоцитов и образования проплатлетов были изучены совсем недавно. Хотя мегакариоциты могут дифференцироваться in vitro в традиционной жидкой культуре, они не достигают степени созревания, наблюдаемой in vivo,отчасти из-за отсутствия механических сигналов из 3D-среды ^7. Выращивание прародителей, встроенных в гидрогель, приносит 3D-механические сигналы, которых не хватает в жидкой среде.

Гидрогели широко используются в течение нескольких десятилетий в гематологической области, в частности, для выращивания клеток в колониеобразующих анализах для количественной оценки гемопоэтических прародителей. Однако такие гидрогели редко использовались для изучения биологического воздействия 3D-механической среды на созревание и дифференцировку кроветворных клеток. За последние несколько лет наша лаборатория разработала 3D-модель культуры с использованием гидрогеля 8 на ^основеметилцеллюлозы. Этот нереактивный физический гель является полезным инструментом для имитации физических ограничений нативной среды мегакариоцитов. Его получают из целлюлозы путем замены гидроксильных остатков (-OH) метоксидными группами (-OCH_3). Как степень метилозамещения, так и концентрация метилцеллюлозы определяют жесткость гидрогеля после его желляции. На этапе разработки данной методики было продемонстрировано, что модуль Юнга в диапазоне от 30 до 60 Па является оптимальной жесткостью геля для роста мегакариоцитов ^9.

Следующий протокол описывает метод выращивания мышиных мегакариоцитарных прародителей в 3D-гидрогеле метилцеллюлозы. Ранее было показано, что по сравнению со стандартной жидкой культурой эта гидрогелевая культура повышает степень полиплоидизации мегакариоцитов, улучшает созревание и внутриклеточную организацию, а также увеличивает способность мегакариоцитов к продлению проплацирования после повторного суспендирования в жидкой среде ^9. В данной рукописи подробно описан протокол выделения Lin− клеток костного мозга мыши и их встраивания в гидрогель метилцеллюлозы для 3D-культуры, а также количественная оценка их способности производить проплацелеты и восстановление клеток для дальнейших анализов.

протокол

Все эксперименты должны проводиться в соответствии с институциональными руководящими принципами по уходу и использованию лабораторных животных. Все протоколы, показанные на видео, были выполнены в строгом соответствии с европейским законодательством и рекомендациями Наблюдательного совета Etablissement Français du Sang (EFS). Первая версия этого протокола была первоначально опубликована в 2018 году в Журнале Methods in Molecular Biology ^8.

ПРИМЕЧАНИЕ: На рисунке 1 представлено схематическое представление всего процесса. Этот процесс включает в себя 1) рассечение кости, извлечение костного мозга и механическую изоляцию клеток костного мозга, 2) магнитную сортировку отрицательных (Lin-) клеток линии, 3) посев в жидкий или метилцеллюлозный гидрогель и 4) ресуспензию мегакариоцитов, выращенных в 3D-геле, для исследования образования проплатлетов в жидкой среде.

1. Сбор костей у взрослых мышей

ПРИМЕЧАНИЕ: В этом разделе важно свести к минимуму микробное загрязнение.

1. Подготовьте трубку объемом 15 мл для сбора костной ткани с помощью модифицированной среды Dulbecco's Eagle's Medium (DMEM), содержащей 1% от общего объема смеси антибиотиков пенициллин-стрептомицин-глутамин (PSG) (пенициллин 10000 Ед/мл, стрептомицин 100000 мкг/мл и L-глутамин 29,2 мг/мл).
   ПРИМЕЧАНИЕ: Если все используемые мыши имеют одинаковый генотип, объедините все кости в одну трубку, содержащую 1 мл DMEM - PSG 1% на количество мышей. Антибиотики важны для предотвращения возможного размножения бактерий во время отбора проб костей.
2. Заполните пробирку 50 мл этанолом 70% для дезинфекции костей и еще одну для промывки инструментов во время процедуры. Используйте стерилизованные инструменты для рассечения.
3. Обезболивают мышей с помощью ингаляции изофлурана (4%) и быстро приступают к вывиху шейки матки, чтобы усыпить мышей. Быстро погружайте организм в 70% этанол для дезинфекции и предотвращения микробного загрязнения.
4. Быстро рассекает большеберцовую и бедренную кости.
5. С помощью скальпеля отрежьте эпифизы бокового конца лодыжки для большеберцовой кости и бокового конца бедра для бедренной кости.
6. Погрузите кости на одну секунду в 70% этанол, прежде чем погружать их в среду DMEM, содержащую 1% PSG.

2. Диссоциация костного мозга и выделение lin-клеток

ПРИМЕЧАНИЕ: Эта часть протокола выполняется под ламинарной вытяжкой. Для одной культуры все колодцы являются частью одного эксперимента и не могут рассматриваться как независимые биологические реплики. Клетки всех мышей объединяются вместе, чтобы обеспечить однородность всех скважин и иметь возможность сравнивать их друг с другом, устраняя возможную межиндовую изменчивость. Для независимых биологических реплик культуру необходимо повторить.

1. Поместите кости в чашку Петри и дважды поднимите их в стерильном фосфатно-буферном физиологическом растворе Dulbecco (DPBS), чтобы удалить потенциальные загрязняющие вещества.
2. Готовят ДМЭМ - 1% ПСЖ в тубах 50 мл.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Обеспечьте 2 мл DMEM - 1% PSG на мышей, используемых для эксперимента.
3. Наполните шприц 5 мл, оснащенный иглой 21-го калибра с DMEM - 1% PSG.
4. Удерживая кость щипцами, вводят только скос иглы на коленном боковом конце.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Эпифиз коленной стороны должен оставаться нетронутым от рассечения, оставляя небольшую полость в его центре, через которую вставляется игла. Оставшийся эпифиз будет поддерживать кость, прикрепленную к игле во время промывки. Будьте осторожны, чтобы не вводить больше, чем скос в кости, так как это может раздавиться и повредить костный мозг.
5. Быстро нажмите на шприц-поршень, чтобы смыть костный мозг в трубку 50 мл.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Во избежание брызг и облегчения промывки костного мозга и освобождения поместите свободный конец кости на стенку трубки, погруженной в ДМЭМ - 1% ПСГ. На практике объем от 500 мкл до 1 мл обычно достаточен для изгнания костного мозга из кости. Когда костный мозг был полностью изгнан, кость стала белой. В случае, если костный мозг не был полностью изгнан из диафиза, о чем судят по некоторому оставшемуся красному цвету, можно повторить прилив со свежей средой.
6. Повторите шаги 2.4. и 2.5. для всех костей, заправляя шприц 5 мл DMEM - 1% PSG при необходимости.
7. Используйте тот же шприц объемом 5 мл с иглой 21 калибра для переноса общего объема среды, содержащей промытый костный мозг, в трубки с круглым дном по 10 мл.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Нет абсолютной необходимости переходить на трубку с круглым дном 10 мл, но это облегчает переход к следующим шагам диссоциации. Не стесняйтесь менять шприц и / или иглу, если подозревается риск загрязнения.
8. Приступайте к диссоциации клеток путем аспирации и изгнания клеток среды и костного мозга последовательно два раза через иглу 21-го калибра, три раза через 23-й калибр и один раз через иглу 25-го калибра.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Избегайте пузырьков воздуха, так как это может быть вредно для клеток.
9. Переложите суспензию в пробирки по 15 мл.
10. Измерьте количество ячеек и проверьте жизнеспособность с помощью автоматизированного счетчика клеток или камеры клеток для ручного подсчета в присутствии трипан-синего цвета, чтобы исключить мертвые клетки.
11. Центрифугировать 15 мл в пробирках в течение 7 мин при 300 х г. Используя передаточную пипетку 1 мл, осторожно вытаскивайте пипетку и выбрасывайте супернатант.
12. Изолируйте стволовые и прогениторные клетки методом отрицательной иммуномагнитной сортировки с помощью набора для изоляции гемопоэтических клеток мыши.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Целью этой сортировки клеток является извлечение клеток, которые являются отрицательными для всех селекционных антител (CD5, CD11b, CD19, CD45R / B220, Ly6G / C (Gr-1), TER119, 7-4) и, следовательно, устранение клеток, которые уже участвуют в линии дифференцировки, отличных от мегакариоцитарной.
13. Следуя инструкциям набора, повторно суспендируют клеточную гранулу в свежеприготовленной М-среде (PBS с 2% от конечного объема фетальной бычий сыворотки (FBS), ЭДТА 1 мМ) до концентрации 1 × 10⁸ клеток/мл и распределяют суспензию в круглодонных полистирольных трубках по 5 мл до максимального объема 2 мл.
14. Добавляют в полистирольные пробирки: обычную крысиную сыворотку в концентрации 50 мкл/мл, а также смесь биотинилированных антител (CD5, CD11b, CD19, CD45R/B220, Ly6G/C(Gr-1), TER119, 7-4) в концентрации 50 мкл смеси на мл и гомогенизируют, осторожно щелкая пробирками.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Эти антитела будут связываться с клетками, уже участвующими в пути дифференцировки, за исключением мегакариоцитарного пути.
15. Высиживать трубки на льду в течение 15 мин.
16. Добавьте магнитные шарики со стрептавидиновым покрытием в концентрации 75 мкл/мл и гомогенизируйте, осторожно щелкнув трубками.
17. Снова высиживают на льду в течение 10 мин.
18. При необходимости отрегулируйте до конечного объема 2,5 мл на тюбик со средой M.
19. Гомогенизируйте суспензию, осторожно щелкнув трубкой непосредственно перед тем, как поместить ее, без колпачков, внутрь магнита и подождите три минуты.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Клетки, уже участвующие в пути дифференцировки и покрытые магнитными шариками, будут удерживаться на стенке трубки внутри магнита.
20. Инвертировать магнит и трубку для переноса содержимого трубки в новую круглодонную полистирольную трубку 5 мл.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Не вынимайте трубку из магнита для передачи; это делается путем инвертирования магнита с трубкой, все еще включенной. Используйте устойчивое движение и не встряхивайте трубку.
21. Отбросьте первоначальную трубку, содержащую нежелательные магнитно-меченые ячейки, и поместите новую, без колпачка, в магнит еще на три минуты.
22. Продолжая, как на шаге 2.20, перенесите изолированные Lin− клетки в новую трубку 15 мл.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Если на предыдущих этапах было использовано несколько полистирольных трубок по 5 мл, объедините все ячейки в одну и ту же трубку 15 мл. Клетки, восстановленные после сортировки клеток, являются гемопоэтическими стволовыми клетками и прародителями. Наличие тромбопоэтина (ТПО), основного физиологического регулятора мегакариопоезиса ^10,направит дифференцировку клеток в сторону мегакариоцитарной клеточной линии.
23. Измерьте число ячеек Lin− и жизнеспособность, как на шаге 2.10.
24. Рассчитайте требуемый объем клеточной суспензии для центрифуги, чтобы иметь 1 x 10⁶ жизнеспособных ячеек x номер скважины, число скважин - количество скважин для посева в условии.
25. Готовят по одной пробирке для каждого состояния с соответствующим объемом клеточной суспензии и центрифуги при 300 х г в течение 7 мин.
26. Для жидких культур отбросьте супернатант и повторно суспендируют клеточную гранулу в полной культуральную среду (ДМЭМ, ПСГ 1% от конечного объема, FBS 10% от конечного объема, гирудин 100 Ед/мл, ТПО 50 нг/мл) для достижения конечной концентрации 2 × 10⁶ жизнеспособных клеток/мл (равной 1 × 10⁶ клеток на 500 мкл в лунке). Инкубировать клетки при 37 °C при 5% CO2. (= день 0 культуры)
    ПРИМЕЧАНИЕ: См. следующий абзац для культур метилцеллюлозы В качестве примера для приготовления полной питательной среды для одной скважины используйте 435 мкл DMEM, 50 мкл 100% FBS для 10% финала, 5 мкл 100% PSG для 1% финала, 5 мкл 10 000 Ед/мл для 100 Ед/мл финала и 5 мкл 5 мкг/мл TPO для 50 нг/мл финала. Обычно используются 4-скважинные или 24-скважинные культурные пластины, поскольку их диаметр скважины хорошо подходит для 500 мкл, необходимых для каждой скважины.

3. Встраивание клеток в гидрогель метилцеллюлозы

ПРИМЕЧАНИЕ: Обратите внимание, что следующий протокол описывает способ получения одной скважины из гидрогеля клеточной культуры, адаптированной к количеству необходимых скважин.

1. Разморозить 1 мл аликвоты 3% раствора метилцеллюлозы при комнатной температуре. Подготовьте одну отдельную дополнительную аликвоту метилцеллюлозы для покрытия шприца.
   ПРИМЕЧАНИЕ: При концентрации 3% метилцеллюлоза остается жидкой при комнатной температуре (20-25 °C).
2. Обложить шприц Luer lock 1 мл, оснащенный иглой 18-го калибра с метилцеллюлозой, извлекая 1 мл метилцеллюлозы из дополнительной аликвоты. Полностью изгнать метилцеллюлозу.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Эта ступень покрытия гарантирует, что объем метилцеллюлозы, собранной на этапе 3.3, является точным.
3. С помощью того же шприца и иглы, но используя новую метилцеллюлозную аликвоту, нарисуйте соответствующий объем метилцеллюлозы(рисунок 2А).
   ПРИМЕЧАНИЕ: Для достижения конечной концентрации 2% метилцеллюлозы в конечном объеме 500 мкл на скважину требуется 333 мкл 3% метилцеллюлозы.
4. Осторожно извлеките иглу. Используя стерилизованные щипцы, привинтите на конец шприца разъем замка Luer(рисунок 2B-C).
5. Прикрепите второй, без покрытия, шприц замка Luer 1 мл к разъему замка Luer, чтобы соединить два шприца вместе(рисунок 2D).
   ПРИМЕЧАНИЕ: Нет необходимости покрывать этот второй шприц.
6. Равномерно распределите объем метилцеллюлозы между двумя шприцевами(рисунок 2Е)и отложите их в сторону до этапа 3.11.
7. Готовят концентрированную культуральную среду DMEM таким образом, чтобы получить в конечном объеме метилцеллюлозы (этап 3.11) концентрацию, идентичную концентрации жидкой питательной среды для каждого соединения (PSG 1% от конечного объема, FBS 10% от конечного объема, гирудин 100 Ед/мл, TPO 50 нг/мл).
   1. Готовят 167 мкл концентрированной питательной среды на конечную скважину 1 × 10⁶ клеток. Этот объем среды рассчитывают таким образом, чтобы получить конечную концентрацию метилцеллюлозы 2%. Общий объем в скважине составит 500 мкл (167 мкл клеточной суспензии в концентрированной культуральной среде + 333 мкл метилцеллюлозы) и все компоненты будут иметь концентрацию, идентичную таковой в жидких скважинах.
   2. В качестве примера, чтобы подготовить полную культуральную среду для одной скважины, используют 102 мкл DMEM, 50 мкл 100% FBS для 10% финала, 5 мкл 100% PSG для 1% финала, 5 мкл 10 000 Ед/мл для 100 Ед/мл финала и 5 мкл 5 мкг/мл TPO для 50 нг/мл финала. Он дает объем 167 мкл, используемый для повторного суспендирования клеток, а при добавлении 333 мкл метилцеллюлозы конечный объем составит 500 мкл.
8. После завершения этапа центрифугирования 2.26 отбросьте супернатант и повторно суспендируем клеточную гранулу в концентрированной культуральная среда в соотношении 1 × 10⁶ клеток на 167 мкл.
9. Возьмите обратно шприцы и отсоедините один из них от разъема.
10. Пипетка 167 мкл клеточной суспензии.
11. Добавьте суспензию ячейки непосредственно в разъем шприца(рисунок 2F),следя за тем, чтобы не вводить пузырьки воздуха.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Добавляя суспензию ячейки, медленно одновременно вытягивайте плунжер шприца, чтобы освободить место для суспензии ячейки.
12. Осторожно соедините два шприца(рисунок 2G)без потери подвески в резьбе винта.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Перед повторным подключением нарисуйте плунжер, чтобы оставить разъем наполовину пустым и дать достаточно места для подключения второго шприца без переполнения подвески.
13. Медленно гомогенизируют метилцеллюлозную среду клеточной суспензией с десятью плунжерными движениями между двумя шприцевыми(рисунок 2H).
14. Стяните общий объем в один шприц и отсоедините два шприца, оставив разъем на пустом.
15. Опорожняют содержимое шприца в колодец из 4-х скважинной пластины(рисунок 2I).
16. Инкубировать клетки при 37 °C при 5% CO₂ (= день 0 культуры).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Можно подготовить две метилцеллюлозные скважины с одной парой шприцев. Увеличьте на два объем метилцеллюлозы и объем клеточной суспензии, чтобы иметь 2 х10⁶ клеток. После завершения шага 3.13. распределите объем поровну между двумя шприцами, чтобы в каждом из них было 500 мкл. Отключите их и опорожняйте тот, который не является разъемом в колодец культуры. Снова подключите шприцы, чтобы перенести громкость с того, который удерживал разъем, на другой. Отсоедините шприцы, у которых 500 мкл, не должен иметь прикрепленный соединитель, и засейте клетки во вторую культуру хорошо. 3% метилцеллюлоза приобретается в качестве запасного раствора в модифицированной среде Dulbecco (IMDM) Iscove, в то время как концентрированные клетки суспендируются в DMEM. Первоначально были проведены сравнительные тесты, чтобы убедиться, что эта смешанная среда не повлияла на результат эксперимента, особенно по сравнению с жидкой культурой в 100% DMEM.

4. Ресуспенсия клеток для анализа проплатлетов

ПРИМЕЧАНИЕ: Анализ способности образовывать проплацелеты должен проводиться в сопоставимых условиях между жидкими и метилцеллюлозными мегакариоцитами. Физические ограничения, оказываемые гидрогелем метилцеллюлозы, ингибируют расширение проплатлета. Поэтому клетки, выращенные на метилцеллюлозе, повторно суспендируют в свежей жидкой среде на 3-й день культуры, чтобы позволить им расширить проплацелеты. Метилцеллюлозный гидрогель представляет собой физический гидрогель, который легко разбавляется при добавлении в жидкую среду. Важно отметить, что во избежание артефактов от повторного суспензии и центрифугирования клетки в состоянии контрольной жидкой среды должны обрабатываться одновременно так же, как клетки, выращенные метилцеллюлозой. См. схематическое представление эксперимента(рисунок 1).

1. Приготовьте 10 мл DMEM - 1% PSG, предварительно нагретого при 37 °C в 15 мл пробирке для каждой скважины для повторного суспендации.
2. Осторожно повторно суспендировать клетки из каждой скважины в 10 мл ДМЭМ – 1% ПСГ.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Осторожно сделайте несколько движений вверх и вниз, чтобы полностью разбавить метилцеллюлозу. Для жидких колодцев обязательно соберите все ячейки, отложенные на дне колодца.
3. Центрифуг в тубах 5 мин при 300 × г.
4. Тем временем готовят полную питательную среду (ДМЭМ, ПСГ 1% от конечного объема, ФБС 10% от конечного объема, гирудин 100 Ед/мл, ТПО 50 нг/мл).
   ПРИМЕЧАНИЕ: На этом этапе каждую скважину извлекают для разбавления наполовину, поэтому готовят 1 мл полной культурной среды на скважину.
5. Выбросьте супернатант и повторно суспендьте гранулу клетки в 1 мл питательной среды для каждой пробирки.
6. Пересеять 500 мкл клеточной суспензии на скважину в пластину с 4 или 24 скважинами и инкубировать при 37 °C при 5% CO_2.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Из одной начальной скважины получите 2 скважины для визуализации проплатлетов в двух экземплярах. Обратите внимание, что, поскольку эти дубликаты происходят из одного и того же образца, они не могут рассматриваться как независимые реплики.
7. Через 24 часа после пересевки, на 4-й день посева, случайным образом получить по 10 изображений на скважину с помощью яркой полевой микроскопии и 20× объектива.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Ячейки, как правило, группируются в центре скважины, убедитесь, что на поле не слишком много ячеек, так как это может затруднить визуализацию и количественную оценку проплатлетов. Убедитесь, что вы захватили не менее 5 мегакариоцитов на поле.
8. Подсчитайте общее количество мегакариоцитов и мегакариоцитов, распространяющих проplatelets на каждом изображении, и рассчитайте долю мегакариоцитов, расширяющих проплацелеты.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Количественная оценка не автоматизирована; выполните подсчет ячеек вручную. Подсчет может быть облегчен с помощью плагина счетчика ячеек ImageJ для нажатия на ячейки, чтобы отметить их по мере их подсчета. 10 месторождений, приобретенных на скважину, и скважины в двух экземплярах представляют собой примерно 150-300 мегакариоцитов на состояние.

5. Фиксация и извлечение клеток для будущих анализов

ВНИМАНИЕ: Этот протокол использует фиксаторы, которые должны обрабатываться под вытяжным капюшоном, с защитным снаряжением.

ПРИМЕЧАНИЕ: Цель состоит в том, чтобы сохранить нетронутыми гелевые ограничения, наложенные на клетки, до тех пор, пока они не будут полностью зафиксированы. Поэтому, независимо от используемого фиксатора, его необходимо добавлять в колодец поверх метилцеллюлозы, не нарушая гель. Тот же протокол применяется к жидким культурам.

1. Добавьте объем фиксаторного раствора, равный посеянному объему (500 мкл в этом протоколе), поверх метилцеллюлозы, не нарушая работу геля. Подождите соответствующее время в соответствии с используемым фиксатором (не менее 10 минут).
   ПРИМЕЧАНИЕ: Фиксаторная диффузия по всему гелю должна быть очень быстрой, о чем свидетельствует быстрое изменение цвета геля (от розового до желто-оранжевого оттенка). Параформальдегид (8% в DPBS, 500 мкл на скважину) обычно используется для иммуномаркировки, в то время как глутаральдегид (5% в какодилатном буфере, 500 мкл на скважину) используется для анализа электронной микроскопии.
2. Используя пипетку P1000, аккуратно сделайте несколько пипеток вверх и вниз с фиксатором и гелем, чтобы однородно разбавить метилцеллюлозу.
3. Используя ту же пипетку и наконечник, перенесите весь объем из скважины в трубку объемом 15 мл, содержащую 10 мл DPBS, и гомогенизируйте.
4. Центрифугировать смесь при 300 × г в течение 7 мин.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Для удаления всей метилцеллюлозы может потребоваться второй этап промывки
5. Отбросьте супернатант и повторно суспендируйте гранулу мегакариоцитов в соответствующей среде согласно желаемому анализу (иммуномаркировка, проточная цитометрия^9,электронная микроскопия ...) (для электронной микроскопии см. также статью метод«Исследование in situ основных этапов мегакариопоэтиса с использованием просвечивающих электронных микроскопий» в этом выпуске JoVE).

Результаты

Данные, полученные с помощью этого протокола, были первоначально опубликованы в Blood в 2016^{году 9.}

Согласно протоколу, клетки были посеяны либо в жидкой, либо в метилцеллюлозно-гидрогелевую среду. Ячейки в жидкой среде все осаждены на дне скважины, в контакте с же...

Обсуждение

В предыдущее десятилетие механобиология вызывала все больший интерес ко многим областям биологии. В настоящее время общепризнано, что механическая среда, окружающая клетки, играет определенную роль в их поведении, подчеркивая важность изучения того, как мегакариоциты чувствуют и реа?...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
18-gauge needles	Sigma-Aldrich	1001735825
21-gauge needles	BD Microlance	301155
23-gauge needles	Terumo	AN*2332R1
25-gauge neeldes	BD Microlance	300400
4-well culture dishes	Thermo Scientific	144444
5 mL syringes	Terumo	SS+05S1
Cytoclips	Microm Microtech	F/CLIPSH
Cytofunnels equiped with filter cards	Microm Microtech	F/JC304
Cytospin centrifuge	Thermo Scientific		Cytospin 4
Dakopen	Dako
DMEM 1x	Gibco, Life Technologies	41 966-029
DPBS	Life Technologies	14190-094	Sterile Dulbecco’s phosphate-buffered saline
EasySep magnets	Stem Cell Technologies	18000
EasySep Mouse Hematopoietic Progenitor Cell isolation Kit	Stem Cell Technologies	19856A	biotinylated antibodies (CD5,CD11b, CD19, CD45R/B220, Ly6G/C(Gr-1), TER119,7–4) and streptavidin-coated magnetic beads
EDTA	Invitrogen	15575-020
Fetal Bovine Serum	Healthcare Life Science	SH30071.01
Luer lock 1 mL syringes	Sigma-Aldrich	Z551546-100EA	or 309628 syringes from BD MEDICAL
Luer lock syringes connectors	Fisher Scientific	11891120
MC 3%	R&D systems	HSC001
Polylysin coated slides	Thermo Scientific	J2800AMNZ
PSG 100x	Gibco, Life Technologies	1037-016	10,000 units/mL penicillin, 10,000 μg/mL streptomycin and 29.2 mg/mL glutamine
Rat serum	Stem Cell Technologies	13551
Recombinant hirudin	Transgène	rHV2-Lys47
Recombinant human trombopoietin (rhTPO)	Stem Cell Technologies	2822	10,000 units/mL
Round bottomed 10 mL plastique tubes	Falcon	352054
Round bottomed 5 mL polystyrene tubes