每日使用期间从聚丙烯婴儿喂养瓶中释放的微塑料的采样、鉴定和特征

摘要

这项研究详细介绍了一个可靠和具有成本效益的协议，用于从塑料产品的日常使用中收集和检测微塑料。

摘要

由于对人类健康的潜在风险，微塑料（MPs）正在成为全球关注的焦点。对塑料制品（即塑料一次性杯子和水壶）的案例研究表明，日常使用期间释放的MP可能非常高。精确确定 MP 释放级别是识别和量化暴露源并评估/控制此暴露产生的相应风险的关键步骤。虽然测量海洋或淡水中MP水平的协议已经制定得很好，但家用塑料制品所经历的条件可能差别很大。许多塑料制品暴露在频繁的高温（高达 100 °C）中，并在日常使用期间冷却回室温。因此，开发一个模拟每个特定产品的实际日常使用场景的采样协议至关重要。这项研究侧重于广泛使用的聚丙烯为基础的婴儿喂养瓶，以开发一个经济有效的协议MP释放研究的许多塑料产品。这里制定的协议允许:1） 在采样和检测期间预防潜在的污染:2） 根据世卫组织准则，切实执行日常使用方案，准确收集从婴儿喂养瓶中释放的议员:和 3） 从婴儿喂养瓶中释放的 Mps 具有成本效益的化学测定和物理地形映射。根据此协议，使用标准聚苯乙烯 MP（直径为 2μm）的回收百分比为 92.4-101.2%，而检测到的尺寸约为设计尺寸的 102.2%。此处详述的协议为 MP 样品的制备和检测提供了可靠且经济高效的方法，这将大大有利于未来对塑料产品中 MP 释放的研究。

引言

大多数类型的塑料是不可生物降解的，但由于化学和物理过程，如氧化和机械摩擦^1，2，可能会分解成小块。小于 5 mm 的塑料片被归类为微塑料 （MPs）。Mps 无处不在， 几乎在世界各地的每个角落都能找到。由于人类和野生动物的潜在风险^，它们已成为全球^{关注的焦点。}迄今为止，在鱼类、鸟类、昆虫^5、6以及哺乳动物（老鼠、肠道、肾脏和肝脏^7、8）中发现了大量议员的积累。研究发现，Mps的暴露和积累会损害7^号、8号老鼠的脂质代谢。一项以鱼类为重点的风险评估发现，亚微米议员可以穿透血到脑屏障，造成脑损伤^。应当指出，迄今为止，所有MP风险结果都来自动物研究，而对人类健康的具体风险仍不得而知。

在过去两年中，随着人类接触议员水平的确认，对议员对人类健康的威胁的关切大大增加。在人类结肠^{10、孕妇胎盘11}和成人粪便¹²中发现议员的积累。精确确定 MP 释放水平对于确定暴露源、评估健康风险和评估任何潜在控制措施的效率至关重要。在过去几年中，一些案例研究报告说，日常使用的塑料（即塑料水壶¹³和一次性杯子^14）可以释放出极高数量的议员。例如，一次性纸杯（内部用聚乙烯-PE或聚合物薄膜层压），在接触85-90°C热水14后，释放出约250微米大小的MP和^1.02亿亚微米大小的颗粒到每毫升液体中。一项对聚丙烯（PP）食品容器的研究报告说，在一次使用15过程中，从容器中释放出多达^7.6毫克的塑料颗粒。更高水平的记录从茶包由聚乙烯四苯甲酸酯（PET）和尼龙，释放约116亿议员和31亿纳米大小的议员到一个杯子（10mL）的饮料^16。鉴于这些日常使用的塑料制品是为食品和饮料制备而设计的，因此有可能释放大量议员，他们的消费对人类健康构成潜在威胁。

关于家用塑料制品（即塑料水壶¹³和一次性杯子^14）释放MP的研究还处于早期阶段，但预计这一主题将受到研究人员和公众越来越多的关注。这些研究所要求的方法与室温海洋或淡水研究所采用的方法大不相同，因为已有¹⁷项既定协议。相比之下，涉及家庭塑料制品日常使用的研究涉及更高的温度（高达100°C），在许多情况下，反复循环回到室温。先前的研究指出，与热水接触的塑料可以释放数百万议员^16日，18日。此外，塑料制品的日常使用可能会随着时间的推移改变塑料本身的特性。因此，制定一个能够准确模拟最常见的日常使用场景的采样协议至关重要。微小颗粒的检测是另一个重大挑战。先前的研究指出，议员们从塑料制品中释放出来的体积小于20微米16、19、20。检测这些类型的 Mps 需要使用小孔大小的平滑膜过滤器。此外，有必要区分 Mps 与过滤器捕获的可能污染物。高灵敏度拉曼光谱用于化学成分分析，其优点是避免需要高激光功率，已知很容易破坏小颗粒^20。因此，该协议必须结合无污染处理程序与使用最佳膜过滤器和定型方法，允许快速和准确的MP识别。

这里报道的研究集中在基于PP的婴儿喂养瓶（BFB），这是日常生活中最常用的塑料制品之一。调查发现，在配方制备^过程中，大量议员从塑料BFB中释放出来。为进一步研究日常塑料中的MP释放，此处详细介绍了BFB的样品制备和检测方法。在样品准备过程中，仔细遵循了世卫组织²¹ 国建议的标准配方制备过程（清洁、消毒和混合）。通过围绕世卫组织准则设计协议，我们确保来自 BBB 的 MP 版本模仿父母使用的婴儿配方奶粉制备过程。筛选过程旨在准确收集从 BBB 释放的 Mps。对于议员的化学识别，对拉曼光谱仪的工作条件进行了优化，以获得清洁和容易识别的议员光谱，同时避免燃烧目标粒子的可能性。最后，开发了最佳的测试程序和应用力，以便使用原子力显微镜 （AFM） 对 Mps 进行精确的三维地形映射。此处详述的协议（图 1）为 MP 样品的制备和检测提供了可靠且经济高效的方法，可大大有利于未来塑料制品的研究。

研究方案

1. 热水制备

1. 对于所有接触样品的硬件，请使用由玻色酸酯 3.3 制成的清洁玻璃以防止任何潜在的污染。彻底清洁所有的玻璃器皿。
   注意:玻璃器皿上预先存在的划痕或不完美点可以在加热和摇晃过程中释放颗粒。我们建议用户检查玻璃器皿，避免使用刮伤的玻璃器皿。我们对不同玻璃杯（如苏打石灰和肉碱）制成的玻璃器皿的比较表明，玻色酸酯3.3释放出的玻璃颗粒数量最低（可由拉曼光谱仪筛选），我们建议在所有测试中使用肉碱酸盐3.3玻璃器皿。
2. 将 360 毫升 DI 水倒入玻璃烧杯中。用干净的玻璃盘盖住烧杯。然后将其移入一个全新的微波炉，在全烤箱供电下加热2.5分钟。轻轻摇晃以去除因加热不均匀而可能出现的温度梯度后，烧嘴内的水温为 70 °C，并准备样品。
3. 通过将 1 升 DI 水倒入玻璃器皿中并在微波炉中加热 14 分钟，为 BFB 灭菌准备 95 °C 水。
   注意:切勿使用塑料水壶来准备热水。塑料水壶本身释放数以百万计的议员到热水在沸腾过程中^13。

2. 配方准备期间的 MP 版本

注:按照世卫组织²¹国建议的标准配方制备过程（清洁、消毒和混合），在配方制备过程中从BBB释放的议员在以下3个步骤中进行模拟。

1. 从药店收集全新的 BFB 产品，并在从包装中取出产品后彻底清洁。使用洗涤剂水清洗每个 BFB（在室温下重复 3 次-RT）和蒸馏水（重复 3 次，RT）。最后，在RT使用DI水冲洗FB3次。
   注意:不要使用声波清洁 BFB。虽然声波在实验室中广泛用于混合和清洁，但 BFB 的声波可以严重损坏瓶子表面，并在 1 分钟内导致 PP 产品的 MP 释放。
2. 将 BFB 浸泡在 95 °C DI 水中（第 1.3 节），以消毒瓶子。为了避免 BFB 的浮动，请使用不锈钢钳子稍微按压 BFB 的外部，并确保整个瓶子主体浸入水中。
   1. 5分钟后，取出瓶子，将其移到干净的玻璃盘上。在空气干燥过程中，将瓶子倒置在玻璃盘上，直到没有液滴的证据。
3. 将180mL的热水（70°C，从第1.2节，与世卫组织准则相对应）倒入风干瓶中。然后立即用玻璃培养皿盖住瓶子，放在摇床里。
   1. 要模拟配方混合过程，以 180 rpm 的速度摇动瓶子 60 秒。摇晃后，将瓶子移到干净的玻璃板上，使其冷却。

3. MP 识别和量化的样品准备

1. 使用 DI 水对玻璃过滤器的所有部分（直径为 25 毫米、玻璃漏斗、碎玻璃支撑底座和接收器烧瓶）进行声波处理和彻底冲洗。
   1. 将一块镀金聚碳酸酯-PC膜过滤器（孔径为0.8微米，Au涂层厚度为40纳米）放在玻璃底座中间。
   2. 组装玻璃漏斗和不锈钢夹子，以固定膜过滤器。最后将组装的玻璃滤镜连接到真空泵（图 2）。
      注意:为了确保膜顺利粘在玻璃底座的表面，保持玻璃底座湿润非常重要。如有必要，在放置膜过滤器之前，应将 1-2 滴 DI 水滴在玻璃底座表面。
2. 小心地混合 BFB 中的冷却水样品（从第 2.3 节），然后使用玻璃移液器将一定量的水样转移到玻璃漏斗中。打开真空泵，使水样缓慢地通过膜过滤器进行过滤。
   1. 过滤后，使用 DI 水清洗玻璃漏斗内部，以确保漏斗上没有颗粒。
      注意:为了避免膜过滤器表面颗粒的重叠，必须仔细选择通过滤镜的正确水量。BBB 会释放大量颗粒，因此需要 3-5 个膜过滤器来过滤整个水样体积。
3. 断开真空泵并拆解玻璃滤镜。然后使用不锈钢钳子小心地取出膜过滤器，将其移动到干净的盖玻璃中。使用一小块纸胶带修复盖玻璃上的膜过滤器。立即将样品存放在干净的玻璃培养皿中。

4. AFM 地形特征的样本准备

1. 准备一个干净的硅晶片。将 50 μL 水样（来自第 2.3 节）滴到硅片表面，在温度约为 103 °C 的烤箱中干燥。 如果水中样品中的 MP 水平较低，则重复此过程。
2. 干燥1小时后，将晶圆移到干净的玻璃培养皿中，使其在干燥器中冷却。
3. 晶圆冷却后，将样品存放在干燥干净的玻璃培养皿中。

5. 使用拉曼光谱法进行 MP 识别和定量

1. 使用零顺序校正和硅晶圆校准拉曼系统。确保硅晶片的峰值位置为 520.7 厘米^-1， 当激光强度为 100% 时，峰值强度高于 6000 a.u.
2. 设置拉曼系统的参数，以获得高信号到噪声MP光谱，同时避免燃烧议员。 设置系统如下:532纳米激发激光，去除宇宙射线，激光强度为10%（激光功率为0.18mW），光谱分辨率为1.5厘米^-1，曝光时间为10-20秒，积累10-40倍，光谱范围为200-3200厘米^-1。图3显示了典型的 Mps 光谱， 积累时间从 1s 到 400s 。
   注意:不要直接使用100%激光测试粒子以避免快速燃烧（如果颗粒很小，可以在1分钟内燃烧）。使用低强度 （10-50%）首先进行测试。
3. 将过滤器样本（来自第 3.3 节）置于 Raman 示例阶段的中间。在膜过滤器上选择四个代表点（中间区域有 2 个点，而其他 2 个点靠近工作区边缘，图 3C）进行测试（总测试区域约为 1.5 mm^2）。
4. 使用光学显微镜（100倍）观察和拍摄膜过滤器表面的颗粒，然后使用拉曼光谱仪进行化学识别。
   1. 将获得的 Raman 光谱与参考标准聚合物光谱（来自 BFB 的散装材料和先前出版物^22）进行比较。
   2. 使用2780-2980、1400-1640和709-850厘米^-1等密集峰值确定粒子的化学特性，对应与聚合物材料相关的CH/CH_2/CH3和C-C组的拉伸振动（图3）。
5. 使用 ImageJ 分析已识别的 Mps 的大小和数量。
   1. 根据测试区域、总工作区域（227 mm^2）和已知过滤样本量，获得水样中的 MPS 浓度。
   2. 按大小将已确认的 Mps 分为 5 组:0.8-5 μm、5-20 μm、20-50 μm、50-100 μm 和> 100 μm。
   3. 最后，根据过滤样本量、记录的议员人数和膜过滤器的测试区域，确定一升水样中的 MPP 数量。

6. 使用 AFM 进行 MP 地形特征

1. 为自动对焦系统 （NT-MDT） 配备攻丝模式探头。使用步高标准 （SHS） 校准系统。在最佳工作条件下设置系统:扫描速率为 1 Hz，扫描大小为 10-50 μm，调谐频率约为 160 kHz，扫描线为 512 像素。
2. 修复 AFM 示例舞台上的硅晶片（从第 4.3 节）。观察和拍摄硅晶片表面的目标粒子，然后使用第 5 节中的方法进行化学识别。
3. 将系统切换到自动对焦模式（拉曼光谱和自动对焦在一个系统中组装），并测试已识别的 Mps 的地形。
4. 使用格威迪翁 2.54 软件分析 3D 数据。使用 轮廓 选项获取粒子尺寸和平均高度，同时 获得 3D 视图 以获得 3D 结构。

结果

为了验证此协议，水样是通过在 DI 水中添加标准聚苯乙烯微塑料球体（直径为 2.0 ± 0.1 μm）来编制的。增加的MP数量对应于4，500，000个粒子/升，这与来自BBB的MP释放水平相似。按照协议第2-3节，议员成功收集（图4A），回收率为92.4-101.2%。这个恢复率与先前对议员²³的研究相当。使用 ImageJ，标准 Mps 的检测直径为 2.04 ±0.08 微米（其中±表示平均值的标准误差...

讨论

虽然对海洋和淡水的议员研究已得到广泛报道，并制定了相关标准协议¹⁷项，但日常使用塑料制品的研究是一个重要的新兴研究领域。家用塑料制品所经历的不同环境条件意味着需要额外的照顾和努力才能获得可靠的结果。研究协议必须与实际的日常使用场景一致。例如，声波在实验室测试中广泛用于清洁样品。然而，发现1分钟的声波可以严重损坏BFB的表面，导致MP水平释放一?...

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
AFM cantilever	NANOSENSORS	PPP-NCSTAuD-10	To obtain three-dimensional topography of PP MPs
Atomic force microscope	Nova	NT-MDT	To obtain three-dimensional topography of PP MPs
Detergent	Fairy Original	1015054	To clean the brand-new product
Gold-coated polycarbonate-PC membrane filter-0.8 um	APC, Germany	0.8um25mmGold	To collect microplastics in water and benefit for Raman test
Gwyddion software	Gwyddion	Gwyddion2.54	To determine MPs topography
ImageJ software	US National Institutes of Health	No, free for use	To determine MPs size
Microwave oven	De'longhi, Italy	815/1195	Hot water preparation
Optical microscope, x100	Mitutoyo, Japan	46-147	To find and observe the small MPs
Raman spectroscopy	Renishaw	InVia confocal Raman system	To checmically determine the PP-MPs
Shaking bed-SSL2	Stuart, UK	51900-64	To mimic the mixing process during sample preparaton
Standard polystyrene microplastic spheres	Polysciences, Europe	64050-15	To validate the robusty of current protocol
Tansfer pipette with glass tip	Macro, Brand	26200	To transfer water sample to glass filter
Ultrasonic cleaner	Witeg, Germany	DH.WUC.D06H	To clean the glassware
Vacuum pump	ILMVAC GmbH	105697	To filter the water sample