毎日使用時にポリプロピレン哺乳瓶からマイクロプラスチック放出のサンプリング、同定および特性評価

要約

この研究は、マイクロプラスチックの収集とプラスチック製品の日常的な使用からの検出のための信頼性と費用対効果の高いプロトコルを詳述しました。

要約

マイクロプラスチック(MP)は、人間の健康に対する潜在的なリスクのために世界的な懸念事項になりつつあります。プラスチック製品(すなわち、プラスチックの使い捨てカップおよびケトル)の事例調査は、毎日の使用中のMP放出が非常に高くなることができることを示している。MP リリース レベルを正確に決定することは、露出元を特定して定量化し、この危険に起因する対応するリスクを評価/制御するための重要なステップです。海洋または淡水のMPレベルを測定するためのプロトコルはよく開発されていますが、家庭用プラスチック製品が経験する条件は大きく異なる可能性があります。多くのプラスチック製品は、頻繁な高温(100°C)に曝露され、日常使用時に室温に戻されます。したがって、各製品の実際の日常使用シナリオを模倣したサンプリング プロトコルを開発することが重要です。本研究は、多くのプラスチック製品のMPリリース研究のための費用対効果の高いプロトコルを開発するために広く使用されているポリプロピレンベースの哺乳瓶に焦点を当てた。ここで開発されたプロトコルは可能:1)サンプリングおよび検出中の潜在的な汚染の防止。2)毎日使用シナリオの現実的な実装とWHOガイドラインに基づいて哺乳瓶から解放されたMPの正確なコレクション;3)哺乳瓶から放出されるMPの費用対効果の高い化学的決定および物理的地形マッピング。このプロトコルに基づいて、標準ポリスチレンMP(直径2μm)を使用した回収率は92.4-101.2%であり、検出されたサイズは設計されたサイズの約102.2%であった。ここで詳述するプロトコルは、MPサンプルの調製および検出のための信頼性と費用対効果の高い方法を提供し、プラスチック製品からのMPリリースの将来の研究に大きな利益をもたらす可能性があります。

概要

ほとんどの種類のプラスチックは非生分解性ですが、酸化や機械的摩擦などの化学的および物理的プロセスのために小片に分解することができます^1,2.5mm未満のプラスチック片は、マイクロプラスチック(MP)に分類されます。MPはユビキタスであり、世界中のほぼすべてのコーナーで見られます。彼らは人間と野生動物に対する潜在的なリスクのために世界的な関心事となっています^3,4.現在までに、魚、鳥、昆虫^5、6だけでなく哺乳類(マウス、腸内、腎臓および肝臓^7、8)にMPの有意な蓄積が発見されている。研究は、MPの暴露および蓄積がマウス^7、8の脂質代謝に損傷を与えることができることを発見^した。魚に焦点を当てたリスク評価は、サブミクロンMPが血液対脳関門に浸透し、脳の損傷を引き起こす可能性があることを発見^{しました 9}.人間の健康に対する特定のリスクがまだ不明である一方で、すべてのMPリスク結果は、動物研究から得られていることは、現在までに留意すべきです.

過去2年間で、MPへのヒト暴露レベルの確認により、人間の健康に対するMPの脅威に対する懸念が大幅に増加しました。MPの蓄積は、ヒト結腸^{10、妊婦11}および成人便¹²の胎盤に見られた。MPリリースレベルの正確な決定は、暴露源を特定し、健康リスクを評価し、潜在的な制御措置の効率を評価するために重要です。ここ数年、いくつかのケーススタディは、毎日使用プラスチック(すなわち、プラスチックケトル¹³と使い捨てカップ¹⁴⁾が非常に大量のMPを放出することができることを報告しました。例えば、使い捨て紙コップ(ポリエチレンPEまたはコポリマーフィルムで積層されたインテリア付き)は、85〜90°Cの温水¹⁴への暴露後の液体の各ミリリットルに約250ミクロンサイズのMPおよび1億2000万個のサブミクロンサイズの粒子を放出した。ポリプロピレン(PP)食品容器の研究では、1回の使用^時に最大7.6mgのプラスチック粒子が容器から放出されるという報告がある。さらに高いレベルは、ポリエチレンテレフタレート(PET)およびナイロンから作られたティーバッグから記録され、約116億MPと31億ナノサイズのMPを飲料¹⁶の1カップ(10mL)に放出した。これらの毎日使用プラスチック製品が食品や飲料の準備のために設計されていることを考えると、大量のMPの放出が起こりそうであり、その消費は人間の健康に対する潜在的な脅威です。

家庭用プラスチック製品(例えば、プラスチックケトル¹³と使い捨てカップ¹⁴⁾からのMPリリースに関する研究は初期段階にあるが、この話題は研究者や一般の人々から注目を集めることが期待される。これらの研究で必要とされる方法は、確立されたプロトコルが既^{に存在する}室温海洋または淡水研究で使用されるものとは大きく異なる。対照的に、家庭用プラスチック製品の日常的な使用を含む研究は、はるかに高い温度(100°Cまで)を含み、多くの場合、室温に戻ってサイクリングを繰り返します。以前の研究では、お湯と接触しているプラスチックは、何百万ものMP^16、18を放出することができると指摘^しました。さらに、プラスチック製品の日常的な使用は、時間の経過とともにプラスチック自体の特性を変更する可能性があります。したがって、最も一般的な日常使用シナリオを正確に模倣するサンプリング プロトコルを開発することが重要です。マイクロサイズの粒子の検出も大きな課題です。以前の研究では、プラスチック製品からのMP放出は20 μm^16、19、20より小さいと指摘した。これらのタイプのMPの検出は、小さな細孔サイズの滑らかな膜フィルターの使用を必要とする。さらに、フィルタによって捕捉される可能性のある汚染物質とMPを区別する必要があります。高感度ラマン分光法は、化学組成分析に使用され、小粒子²⁰を容易に破壊することが知られている高いレーザーパワーの必要性を回避できるという利点がある。したがって、このプロトコルは、汚染のない処理手順と最適な膜フィルタの使用と、高速かつ正確なMP識別を可能にする特性評価方法を組み合わせる必要があります。

ここで報告された研究は、日常生活の中で最も一般的に使用されるプラスチック製品の1つであるPPベースの哺乳瓶(BFB)に焦点を当てた。式の準備¹⁸の間に多数の MP がプラスチック BFB から放出されることがわかった。毎日のプラスチックからのMP放出のさらなる研究のために、BFBのサンプル調製および検出方法は、ここで詳述されている。試料調製中に、WHO²¹ が推奨する標準的な式調製プロセス(洗浄、殺菌および混合)を慎重に行った。WHOガイドラインに関するプロトコルを設計することで、BBBからのMPリリースが両親が使用するベビーフォーミュラ調製プロセスを模倣することを保証しました。フィルタプロセスは、BfbsからリリースされたMPを正確に収集するように設計されています。MPの化学同定のために、ラマン分光法の作業条件は、MPのクリーンで容易に同定されたスペクトルを得るために最適化され、同時に標的粒子を燃焼させる可能性を回避した。最後に、原子間力顕微鏡(AFM)を用いたMPの正確な3次元地形マッピングを可能にする最適な試験手順と適用力を開発した。ここで詳しく説明するプロトコル (図 1)は、MP サンプルの調製と検出に対して信頼性が高く、費用対効果の高い方法を提供し、プラスチック製品の将来の研究に大きな利益をもたらす可能性があります。

プロトコル

1. お湯の準備

1. サンプルに接触するすべてのハードウェアに対して、ボロケイ酸3.3製のクリーンガラスを使用して、汚染の可能性を防ぎます。すべてのガラス製品を徹底的に清掃してください。
   注意: ガラス製品の既存の傷や不完全な斑点は、加熱および揺れのプロセス中に粒子を放出することができます。ガラス製品をチェックし、傷付きガラス製品の使用を避けることをお勧めします。異なるガラス(ソーダ石灰やホウケイ酸など)で作られたガラス製品を比較した結果、ホウケイ酸3.3は最も低い量のガラス粒子を放出し(ラマン分光法でスクリーニングすることができる)、すべての試験でホウケイ酸3.3ガラス製品の使用を推奨しています。
2. ガラスビーカーに360mLのDI水を注ぎます。ビーカーをきれいなガラスディスクで覆います。その後、真新しい電子レンジに移動し、フルオーブンパワーで2.5分間加熱します。冷暖房による温度勾配の可能性を取り除くために穏やかに振盪した後、ビーカー内部の水の温度は70°Cであり、サンプル調製の準備が整いました。
3. ガラス製品に1LのDI水を注ぎ、電子レンジで14分間加熱して、BFB滅菌用95°Cの水を調製します。
   注意:お湯を準備するためにプラスチックケトルを使用しないでください。プラスチック製のケトル自体は、沸騰プロセス¹³の間にお湯に何百万人ものMPを放出します。

2. 式の準備中のMPリリース

注:WHO²¹が推奨する標準的な式調製プロセス(洗浄、殺菌および混合)に注意深く従って、式の準備中にBBFから放出されたMPは、次の3つのステップで模倣されます。

1. 薬局の店からブランドの新しいBFB製品を収集し、そのパッケージから製品を削除した後、徹底的にそれらをきれいにします。各BFBを洗剤水(室温-RTで3回繰り返す)と蒸留水(3回繰り返し、RT)を使用して洗浄します。最後に、RTでDI水を使用してBFBを3回リンスします。
   注意:超音波処理を使用してBFBをきれいにしないでください。超音波処理は、混合および洗浄のための実験室で広く使用されているが、BFBの超音波処理は、ボトル表面を著しく損傷し、1分以内にPP製品からのMPリリースを引き起こす可能性があります。
2. BFBを95°CのDI水(セクション1.3)に浸してボトルを殺菌します。BFBの浮動を避けるために、ステンレス製のトゥイザーを使用してBFBの外側をわずかに押し、ボトル本体全体が水に浸かっていることを確認します。
   1. 5分後、ボトルを取り出し、きれいなガラスディスクに移動します。空気乾燥工程中に、液滴の証拠がなくなるまでガラスディスク上のボトルを反転させます。
3. 180 mLの熱いDI水(WHOガイドラインに対応するセクション1.2から)を空気乾燥ボトルに注ぎます。その後、すぐにガラスペトリ皿を使用してボトルをカバーし、揺れるベッドに置きます。
   1. 式混合プロセスをシミュレートするには、ボトルを180 rpmの速度で60秒間振ります。振った後、ボトルをきれいなガラス板に移し、冷まします。

3. MPの識別と定量化のためのサンプル準備

1. DI水を使用して、ガラスフィルター(直径25mm、ガラス漏斗、フリットガラス支持ベース、レシーバフラスコ)の全パーツを超音波処理し、徹底的に洗い流します。
   1. ガラスベースの中央に金でコーティングされたポリカーボネート-PC膜フィルター(0.8 μmの細孔サイズ、40 nmのAuコーティング層の厚さ)を配置します。
   2. ガラス漏斗とステンレススチール製クランプを組み立てて膜フィルターを固定します。最後に、組み立てられたガラスフィルターを真空ポンプに接続します(図2)。
      注意: 膜がガラスベースの表面に滑らかにくっつくようにするためには、ガラスベースを濡らしておくことが重要です。必要に応じて、膜フィルターを下に置く前に、DI水の1〜2滴をガラスベースの表面に落とす必要があります。
2. 冷却水サンプルをBFB(セクション2.3から)に慎重に混合し、ガラスピペットを使用して一定量の水サンプルをガラス漏斗に移します。真空ポンプのスイッチを入れ、水のサンプルが膜フィルターを通してゆっくりと濾過できるようにします。
   1. 濾過後、DI水を使用してガラス漏斗の内部を洗浄し、漏斗に粒子が付着していないことを確認します。
      注意: 膜フィルターの表面上の粒子の重なりを避けるために、フィルターを通過する水の正しい量を慎重に選択することが重要です。BBFは大量の粒子を放出するので、水サンプルの全容をろ過するために3-5膜フィルターが必要になる。
3. 真空ポンプを外し、ガラスフィルターを分解します。その後、ステンレス製のトゥイザーを使用して膜フィルターを慎重に取り出し、きれいなカバーガラスに移動します。カバーガラスの膜フィルターを小さな紙テープで固定します。すぐにきれいなガラスペトリ皿にサンプルを保管してください。

4. AFMトポグラフィの特性評価のサンプル準備

1. クリーンシリコンウエハーを準備します。シリコンウエハの表面に50μLの水サンプル(セクション2.3から)を落とし、103°C前後の温度でオーブンで乾燥させます。 水サンプルのMPレベルが低い場合は、このプロセスを繰り返します。
2. 1時間の乾燥後、ウエハーをきれいなガラスペトリ皿に移し、デシケータで冷まします。
3. ウエハーが冷却された後、乾燥したきれいなガラスシャーレにサンプルを保管します。

5. ラマン分光法を用いたMP同定と定量化

1. ゼロオーダー補正とシリコンウェハを使用してラマン系を較正します。シリコンウエハのピーク位置が520.7cm-1であり、レーザー強度が100%の場合にはピーク強度が6000を超えるようにしてください。
2. RAMの燃焼を避けながら、高い信号からノイズへのMPスペクトルを得るために、ラマンシステムのパラメータを設定します。 システムを次のように設定します:532 nm励起レーザー、宇宙線の除去、10%のレーザー強度(0.18 mWのレーザーパワー)、1.5cm^のスペクトル分解能、10〜20秒の露光時間、10-40回の蓄積、200-3200cm-1のスペクトル範囲。図3は、1sから400sまでの蓄積時間を有するMPの典型的なスペクトルを示した。
   注意: 急速燃焼を避けるために、直接100%レーザーを使用して粒子をテストしないでください(粒子が小さい場合は1分で焼くことができます)。低強度(10-50%)を使用まずテストを行います。
3. ラマンサンプルステージの中央にフィルターサンプル(セクション3.3から)を配置します。4つの代表的なスポット(2つのスポットは中央領域にあり、他の2つのスポットは作業領域の端に近い、図3C)を選択して試験を実施する(全試験領域は1.5mm2前後)。
4. 光学顕微鏡(100x)を用いてラマン分光法を用いて化学同定を行い、膜フィルター表面の粒子を観察・撮影する。
   1. 得られたラマンスペクトルを基準標準ポリマースペクトル(BFBおよび前の刊行^物22のバルク材料から)と比較する。
   2. 2780-2980、1400-1640および709-850^cm-1の範囲で、高分子材料に関連するCH/CH2 /CH3およびC-C基の延伸振動に対応する範囲の集中ピークを用いて、粒子の化学的性質を決定する(図3)。
5. ImageJ を使用して、識別された MP のサイズと量を分析します。
   1. 試験領域、総作業領域(227mm2)および既知のろ過されたサンプル体積に基づいて、水サンプル中のMP濃度を取得します。
   2. 確認したMPをサイズ:0.8-5 μm、5-20 μm、20-50 μm、50-100 μm、>100 μmの5グループに分類します。
   3. 最後に、フィルターされたサンプル量、記録されたMPの数、膜フィルターのテスト領域に基づいて、水サンプルの1リットルのMP量を決定します。

6. AFMを用いたMP地形特性評価

1. AFMシステム(NT-MDT)にタッピングモードプローブを装備します。ステップ高さ標準(SHS)を使用してシステムをキャリブレーションします。最適な作業条件内でシステムを設定:スキャンレートは1Hz、スキャンサイズは10〜50μm、チューニング周波数は約160kHz、スキャンラインは512ピクセルです。
2. シリコンウェーハ(4.3項から)をAFMサンプルステージに固定します。シリコンウエハの表面上の標的粒子を観察し、撮影し、その後、セクション5の方法を用いて化学同定を行う。
3. システムをAFMモードに切り替え(ラマン分光法とAFMは1つのシステムで組み立てられています)、識別されたMPの地形をテストします。
4. Gwyddion 2.54ソフトウェアを使用して3Dデータを分析します。 3D ビューを使用して 3D 構造を取得する場合は、プロファイルオプションを使用して、パーティクルの寸法と平均高さを取得します。

結果

このプロトコルを検証するために、水サンプルは、標準的なポリスチレン微小プラスチック球(直径2.0±0.1μm)をDI水に添加して調製しました。追加された MP の量は、BB からの MP リリース レベルに類似した 4,500,000 パーティクル/L に対応しました。プロトコル・セクション 2-3 に続いて、MP は正常に収集され (図 4A)、回復率は 92.4-101.2% でした。この回復率は、MP

ディスカッション

海洋および淡水のMPの研究は広く報告されており、関連する標準プロトコルは¹⁷に開発されていますが、日用品プラスチック製品の研究は重要な新興研究分野です。家庭用プラスチック製品が経験する環境条件の違いは、信頼性の高い結果を得るためには、特別な注意と努力が必要であることを意味します。研究プロトコルは、実際の日常使用シナリオと一致している必要が...

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
AFM cantilever	NANOSENSORS	PPP-NCSTAuD-10	To obtain three-dimensional topography of PP MPs
Atomic force microscope	Nova	NT-MDT	To obtain three-dimensional topography of PP MPs
Detergent	Fairy Original	1015054	To clean the brand-new product
Gold-coated polycarbonate-PC membrane filter-0.8 um	APC, Germany	0.8um25mmGold	To collect microplastics in water and benefit for Raman test
Gwyddion software	Gwyddion	Gwyddion2.54	To determine MPs topography
ImageJ software	US National Institutes of Health	No, free for use	To determine MPs size
Microwave oven	De'longhi, Italy	815/1195	Hot water preparation
Optical microscope, x100	Mitutoyo, Japan	46-147	To find and observe the small MPs
Raman spectroscopy	Renishaw	InVia confocal Raman system	To checmically determine the PP-MPs
Shaking bed-SSL2	Stuart, UK	51900-64	To mimic the mixing process during sample preparaton
Standard polystyrene microplastic spheres	Polysciences, Europe	64050-15	To validate the robusty of current protocol
Tansfer pipette with glass tip	Macro, Brand	26200	To transfer water sample to glass filter
Ultrasonic cleaner	Witeg, Germany	DH.WUC.D06H	To clean the glassware
Vacuum pump	ILMVAC GmbH	105697	To filter the water sample