Probenahme, Identifizierung und Charakterisierung von Mikroplastik, das aus der Babyflasche aus Polypropylen während des täglichen Gebrauchs frei wird

Zusammenfassung

Diese Studie beschreibt ein zuverlässiges und kostengünstiges Protokoll für die Sammlung und Erkennung von Mikroplastik aus dem täglichen Gebrauch von Kunststoffprodukten.

Zusammenfassung

Mikroplastik (MPs) wird aufgrund des potenziellen Risikos für die menschliche Gesundheit zu einem globalen Problem. Fallstudien von Kunststoffprodukten (z. B. Einwegbecher und Wasserkocher aus Kunststoff) deuten darauf hin, dass die MP-Freisetzung während des täglichen Gebrauchs extrem hoch sein kann. Die genaue Bestimmung des MP-Freisetzungsgrades ist ein entscheidender Schritt, um die Expositionsquelle zu identifizieren und zu quantifizieren und die entsprechenden Risiken, die sich aus dieser Exposition ergeben, zu bewerten / zu kontrollieren. Obwohl Protokolle zur Messung des MP-Gehalts in Meer- oder Süßwasser gut entwickelt wurden, können die Bedingungen für Haushaltskunststoffprodukte sehr unterschiedlich sein. Viele Kunststoffprodukte sind häufig hohen Temperaturen (bis zu 100 °C) ausgesetzt und werden im täglichen Gebrauch wieder auf Raumtemperatur abgekühlt. Es ist daher von entscheidender Bedeutung, ein Probenahmeprotokoll zu entwickeln, das das tatsächliche tägliche Anwendungsszenario für jedes einzelne Produkt nachahmt. Diese Studie konzentrierte sich auf weit verbreitete Babyflaschen auf Polypropylenbasis, um ein kostengünstiges Protokoll für MP-Freisetzungsstudien vieler Kunststoffprodukte zu entwickeln. Das hier entwickelte Protokoll ermöglicht: 1) Vermeidung der potenziellen Kontamination während der Probenahme und des Nachweises; 2) realistische Umsetzung von Alltagsszenarien und genaue Sammlung der aus Babyflaschen entlassenen Abgeordneten auf der Grundlage der WHO-Richtlinien; und 3) kostengünstige chemische Bestimmung und physikalische Topographiekartierung von Abgeordneten, die aus Babyflaschen entlassen wurden. Basierend auf diesem Protokoll betrug der Rückgewinnungsprozentsatz mit Standard-Polystyrol MP (Durchmesser von 2 μm) 92,4-101,2%, während die erkannte Größe etwa 102,2% der geplanten Größe betrug. Das hier beschriebene Protokoll bietet eine zuverlässige und kostengünstige Methode für die Vorbereitung und den Nachweis von MP-Proben, die zukünftigen Studien zur MP-Freisetzung aus Kunststoffprodukten erheblich zugute kommen kann.

Einleitung

Die meisten Kunststoffarten sind nicht biologisch abbaubar, können aber aufgrund chemischer und physikalischer Prozesse wie Oxidation und mechanischer Reibung in kleine Stücke^zerfallen1,². Kunststoffteile, die kleiner als 5 mm sind, werden als Mikroplastik (MPs) klassifiziert. Abgeordnete sind allgegenwärtig und in fast jeder Ecke der Welt zu finden. Sie sind aufgrund des potenziellen Risikos für Menschen und Wildtiere zu einem globalen Problem geworden^3,4. Bis heute wurden signifikante Ansammlungen von Abgeordneten bei Fischen, Vögeln, Insekten^5,6 sowie Säugetieren (Maus, Darm, Niere und Leber^7,8) gefunden. Studien ergaben, dass die Exposition und Ansammlung von MPs den Fettstoffwechsel von Mäusen schädigen kann^7,8. Eine Risikobewertung, die sich auf Fische konzentrierte, ergab, dass Submikrzähler-Abgeordnete die Blut-Hirn-Schranke durchdringen und Hirnschäden verursachen können⁹. Es sei darauf hingewiesen, dass bisher alle MP-Risikoergebnisse aus Tierversuchen gewonnen wurden, während das spezifische Risiko für die menschliche Gesundheit noch unbekannt ist.

In den letzten 2 Jahren nahmen die Bedenken über die Bedrohung der menschlichen Gesundheit durch die Abgeordneten mit der Bestätigung der Exposition des Menschen gegenüber Abgeordneten erheblich zu. Die Ansammlung von MPs wurde im menschlichen Dickdarm¹⁰, der Plazenta schwangerer Frauen¹¹ und im Erwachsenenstuhl¹²gefunden. Eine genaue Bestimmung der MP-Freisetzungswerte ist entscheidend, um Expositionsquellen zu identifizieren, das Gesundheitsrisiko zu bewerten und die Wirksamkeit potenzieller Kontrollmaßnahmen zu bewerten. In den letzten Jahren berichteten einige Fallstudien, dass Kunststoffe des täglichen Gebrauchs (z. B. der Kunststoffkessel¹³ und die Einwegbecher¹⁴⁾extrem hohe Mengen an Abgeordneten freisetzen können. Zum Beispiel haben Einweg-Pappbecher (mit Innenausstattungen, die mit Polyethylen-PE- oder Copolymerfolien laminiert sind) nach Einwirkung von 85-90 °C heißem Wasser etwa 250 mikrometergroße MPs und 102 Millionen Partikel in submikromingroße Partikel in jeden Milliliter Flüssigkeit freigesetzt¹⁴. Eine Studie von Polypropylen (PP) Lebensmittelbehältern berichtete, dass bis zu 7,6 mg Kunststoffpartikel während eines einmaligen Gebrauchs aus dem Behälter freigesetzt werden¹⁵. Noch höhere Werte wurden von Teebeuteln aus Polyethylenterephthalat (PET) und Nylon verzeichnet, die etwa 11,6 Milliarden MPs und 3,1 Milliarden Nano-MPs in eine einzige Tasse (10 ml) des Getränks¹⁶freisenden. Angesichts der Tatsache, dass diese Kunststoffprodukte des täglichen Gebrauchs für die Zubereitung von Lebensmitteln und Getränken bestimmt sind, ist die Freisetzung hoher Mengen von Abgeordneten wahrscheinlich und ihr Verzehr ist eine potenzielle Bedrohung für die menschliche Gesundheit.

Studien zur MP-Freisetzung aus Haushaltskunststoffprodukten (z. B. dem Kunststoffkessel¹³ und Einwegbechern¹⁴⁾befinden sich in einem frühen Stadium, aber es wird erwartet, dass dieses Thema von Forschern und der Öffentlichkeit zunehmend beachtet wird. Die in diesen Studien erforderlichen Methoden unterscheiden sich signifikant von denen, die in Raumtemperatur-Meeres- oder Süßwasserstudien verwendet werden, wo bereits gut etablierte Protokolle existieren¹⁷. Im Gegensatz dazu beinhalten Studien zur täglichen Verwendung von Haushaltskunststoffprodukten eine viel höhere Temperatur (bis zu 100 ° C), wobei in vielen Fällen wiederholt auf Raumtemperatur zurückgeschlichen wird. Frühere Studien wiesen darauf hin, dass Kunststoffe, die mit heißem Wasser in Berührung berührung treten, Millionen von Abgeordneten freisetzen können^16,18. Darüber hinaus kann der tägliche Gebrauch von Kunststoffprodukten im Laufe der Zeit die Eigenschaften des Kunststoffs selbst verändern. Es ist daher von entscheidender Bedeutung, ein Probenahmeprotokoll zu entwickeln, das die häufigsten Szenarien des täglichen Gebrauchs genau nachahmt. Der Nachweis von Partikeln in Mikrogröße ist eine weitere große Herausforderung. Frühere Studien wiesen darauf hin, dass die Freisetzung von MPs aus Kunststoffprodukten kleiner als 20 μm^16,19,20ist. Die Erkennung dieser Art von MPs erfordert die Verwendung von glatten Membranfiltern mit kleiner Porengröße. Darüber hinaus ist es notwendig, MPs von möglichen Verunreinigungen zu unterscheiden, die vom Filter aufgefangen werden. Die hochempfindliche Raman-Spektroskopie wird für die Analyse der chemischen Zusammensetzung verwendet, was den Vorteil hat, dass keine hohe Laserleistung erforderlich ist, von der bekannt ist, dass sie kleine Partikel leicht zerstört²⁰. Daher muss das Protokoll kontaminationsfreie Handhabungsverfahren mit dem Einsatz optimaler Membranfilter und für eine Charakterisierungsmethode kombinieren, die eine schnelle und genaue MP-Identifizierung ermöglicht.

Die hier berichtete Studie konzentrierte sich auf die PP-basierte Babyflasche (BFB), eines der am häufigsten verwendeten Kunststoffprodukte im täglichen Leben. Es wurde festgestellt, dass eine hohe Anzahl von Abgeordneten während der Formelvorbereitung aus Kunststoff-BFB freigesetzt wird¹⁸. Für weitere Untersuchungen der MP-Freisetzung aus täglichen Kunststoffen wird die Probenvorbereitungs- und Nachweismethode für BFB hier detailliert beschrieben. Bei der Probenvorbereitung wurde der von der WHO²¹ empfohlene Standard-Rezepturvorbereitungsprozess (Reinigen, Sterilisieren und Mischen) sorgfältig befolgt. Durch die Gestaltung der Protokolle rund um die WHO-Richtlinien stellten wir sicher, dass die MP-Freisetzung von BFBs den von den Eltern verwendeten Prozess zur Zubereitung von Babynahrung nachahmte. Der Filterprozess wurde entwickelt, um die von BFBs freigesetzten Abgeordneten genau zu erfassen. Für die chemische Identifizierung von MPs wurden die Arbeitsbedingungen für die Raman-Spektroskopie optimiert, um saubere und leicht identifizierbare Spektren von MPs zu erhalten und gleichzeitig die Möglichkeit der Verbrennung der Zielpartikel zu vermeiden. Abschließend wurde das optimale Testverfahren und die angewandte Kraft entwickelt, um eine genaue 3-dimensionale Topographie-Kartierung von MPs mittels Rasterkraftmikroskopie (AFM) zu ermöglichen. Das hier beschriebene Protokoll (Abbildung 1) bietet eine zuverlässige und kostengünstige Methode zur Vorbereitung und Detektion von MP-Proben, die zukünftigen Studien von Kunststoffprodukten erheblich zugute kommen kann.

Protokoll

1. Warmwasseraufbereitung

1. Verwenden Sie für alle Hardware, die mit den Proben in Berührung kommt, sauberes Glas aus Borosilikat 3.3, um eine mögliche Kontamination zu vermeiden. Reinigen Sie alle Glaswaren gründlich.
   Achtung:Bereits vorhandene Kratzer oder Unvollkommenheiten auf Glaswaren können während des Erhitzungs- und Schüttelvorgangs Partikel freisetzen. Wir empfehlen den Benutzern, die Glaswaren zu überprüfen und die Verwendung der zerkratzten Glaswaren zu vermeiden. Unser Vergleich von Glaswaren aus verschiedenen Gläsern (wie Kalknatron und Borosilikat) zeigte, dass Borosilikat 3.3 die geringste Menge an Glaspartikeln freisetzt (kann durch Raman-Spektroskopie gescreent werden), und wir empfehlen die Verwendung von Borosilikat-3.3-Glaswaren in allen Tests.
2. Gießen Sie 360 ml DI-Wasser in ein Glasbecherglas. Decken Sie das Becherglas mit einer sauberen Glasscheibe ab. Dann in eine brandneue Mikrowelle geben und 2,5 Minuten bei voller Ofenleistung erhitzen. Nach vorsichtigem Schütteln, um mögliche Temperaturgradienten aufgrund ungleichmäßiger Erwärmung zu entfernen, beträgt die Temperatur des Wassers im Inneren des Becherglases 70 °C und ist bereit für die Probenvorbereitung.
3. Bereiten Sie 95 °C Wasser für die BFB-Sterilisation vor, indem Sie 1 L DI-Wasser in Gläser gießen und 14 Minuten in einer Mikrowelle erhitzen.
   Achtung:Verwenden Sie niemals Plastikkessel, um heißes Wasser zuzubereiten. Der Kunststoffkessel selbst gibt während des Kochvorgangs Millionen von Abgeordneten in das heiße Wasser ab¹³.

2. MP-Freisetzung während der Formelvorbereitung

HINWEIS: Nach sorgfältiger Befolung des von der WHO²¹empfohlenen Standard-Formelvorbereitungsprozesses (Reinigung, Sterilisation und Mischen) werden die von BFBs während der Formelvorbereitung freigesetzten MPs in den folgenden 3 Schritten nachgeahmt.

1. Sammeln Sie brandneue BFB-Produkte in Apotheken und reinigen Sie sie gründlich, nachdem Sie das Produkt aus der Verpackung entfernt haben. Waschen Sie jeden BFB mit Reinigungswasser (3 mal bei Raumtemperatur-RT wiederholen) und destilliertem Wasser (wiederholt 3 mal, RT). Zum Schluss spülen Sie den BFB 3 Mal mit DI-Wasser bei RT ab.
   Achtung:Reinigen Sie den BFB nicht mit Ultraschall. Obwohl die Beschallung in Labors zum Mischen und Reinigen weit verbreitet ist, kann die Beschallung von BFB die Flaschenoberfläche schwer beschädigen und innerhalb von 1 Minute eine MP-Freisetzung von PP-Produkten verursachen.
2. Die BFB wird in 95 °C DI-Wasser (Abschnitt 1.3) eingeweicht, um die Flasche zu sterilisieren. Um das Schweben des BFB zu vermeiden, drücken Sie die Außenseite des BFB mit einer Edelstahlpinzette leicht und sorgen Sie dafür, dass der gesamte Flaschenkörper in das Wasser eintaucht.
   1. Nehmen Sie nach 5 Minuten die Flasche heraus und bewegen Sie sie auf eine saubere Glasscheibe. Während des Lufttrocknungsschritts die Flasche auf der Glasscheibe umkehren, bis keine Tröpfchen mehr vorhanden sind.
3. Gießen Sie 180 ml heißes DI-Wasser (70 °C, aus Abschnitt 1.2, entsprechend den WHO-Richtlinien) in die luftgetrocknete Flasche. Dann decken Sie die Flasche sofort mit einer Glas-Petrischale ab und legen Sie sie in ein Schüttelbett.
   1. Um den Formelmischprozess zu simulieren, schütteln Sie die Flasche mit einer Geschwindigkeit von 180 U / min für 60 Sekunden. Nach dem Schütteln die Flasche auf eine saubere Glasplatte bringen und abkühlen lassen.

3. Probenvorbereitung zur MP-Identifizierung und Quantifizierung

1. Beschallen und spülen Sie alle Teile des Glasfilters (Durchmesser 25 mm, Glastrichter, Streuglassockel und Empfängerkolben) mit DI-Wasser gründlich aus.
   1. Legen Sie ein Stück goldbeschichteten Polycarbonat-PC-Membranfilter (Porengröße 0,8 μm, Au-Schichtdicke 40 nm) in die Mitte des Glasbodens.
   2. Montieren Sie den Glastrichter und die Edelstahlklemme, um den Membranfilter zu fixieren. Schließen Sie den montierten Glasfilter abschließend an eine Vakuumpumpe an (Abbildung 2).
      Achtung:Um sicherzustellen, dass die Membran sanft auf der Oberfläche des Glasbodens haftet, ist es wichtig, den Glasboden nass zu halten. Falls erforderlich, sollten 1-2 Tropfen DI-Wasser auf die Oberfläche der Glasbasis fallen gelassen werden, bevor der Membranfilter abgesetzt wird.
2. Mischen Sie die gekühlte Wasserprobe vorsichtig in der BFB (aus Abschnitt 2.3) und übertragen Sie dann eine bestimmte Menge der Wasserprobe mit einer Glaspipette in den Glastrichter. Schalten Sie die Vakuumpumpe ein, damit die Wasserprobe langsam durch den Membranfilter filtern kann.
   1. Waschen Sie nach dem Filtern das Innere des Glastrichters mit DI-Wasser, um sicherzustellen, dass keine Partikel auf dem Trichter haften.
      Vorsicht:Um die Überlappung der Partikel auf der Oberfläche des Membranfilters zu vermeiden, ist es wichtig, sorgfältig das richtige Wasservolumen auszuwählen, das durch den Filter geleitet wird. BFBs setzen eine große Anzahl von Partikeln frei, so dass 3-5 Membranfilter benötigt werden, um das gesamte Volumen der Wasserprobe zu filtern.
3. Trennen Sie die Vakuumpumpe und demontieren Sie den Glasfilter. Nehmen Sie dann vorsichtig den Membranfilter mit einer Edelstahlpinzette heraus und bewegen Sie ihn in ein sauberes Deckglas. Befestigen Sie den Membranfilter mit einem kleinen Stück Papierband auf dem Deckglas. Bewahren Sie die Probe sofort in einer sauberen Glas-Petrischale auf.

4. Probenvorbereitung zur AFM-Topographiecharakterisierung

1. Bereiten Sie einen sauberen Siliziumwafer vor. Eine 50 μL Wasserprobe (aus Abschnitt 2.3) auf die Oberfläche des Siliziumwafers fallen lassen und in einem Ofen bei einer Temperatur von etwa 103 °C trocknen. Wiederholen Sie diesen Vorgang, wenn der MP-Wert in der Wasserprobe niedrig ist.
2. Nach 1 Stunde Trocknen die Waffel in eine saubere Glas-Petrischale geben und in einem Austrocknungsmittel abkühlen lassen.
3. Nachdem der Wafer abgekühlt ist, lagern Sie die Probe in einer trockenen und sauberen Glas-Petrischale.

5. MP-Identifizierung und Quantifizierung mittels Raman-Spektroskopie

1. Kalibrieren Sie das Raman-System mit einer Null-Ordnungs-Korrektur und einem Siliziumwafer. Stellen Sie sicher, dass die Spitzenposition des Siliziumwafers bei 520,7 cm^{-1 liegt} und dass die Spitzenintensität höher als 6000 a.U. ist, wenn die Laserintensität bei 100% liegt.
2. Stellen Sie das System wie folgt ein: 532 nm Anregungslaser, Entfernung kosmischer Strahlung, Laserintensität von 10% (Laserleistung von 0,18 mW), spektrale Auflösung von 1,5 cm -1 , Belichtungszeit von^10-20Sekunden, Ansammlungen von 10-40 mal und Spektralbereich von 200-3200 cm^-1. Abbildung 3 zeigte typische Spektren von MPs mit Akkumulationszeiten von 1 s bis 400 s.
   Achtung:Testen Sie die Partikel nicht direkt mit 100% Laser, um das schnelle Brennen zu vermeiden (kann in 1 Minute verbrannt werden, wenn das Partikel klein ist). Verwenden Sie eine niedrige Intensität (10-50%) , um den Test zuerst durchzuführen.
3. Legen Sie die Filterprobe (aus Abschnitt 3.3) in die Mitte der Raman-Probenstufe. Wählen Sie vier repräsentative Spots (2 Spots befinden sich im mittleren Bereich, während sich andere 2 Spots in der Nähe des Randes des Arbeitsbereichs befinden, Abbildung 3C)auf dem Membranfilter, um den Test durchzuführen (Gesamttestfläche ca. 1,5 mm²).
4. Beobachten und fotografieren Sie die Partikel auf der Oberfläche des Membranfilters mit einem optischen Mikroskop (100x), gefolgt von einer chemischen Identifizierung mittels Raman-Spektroskopie.
   1. Vergleichen Sie das erhaltene Raman-Spektrum mit den Referenzstandard-Polymerspektren (aus Schüttgut von BFB und früherer^{Publikation 22}).
   2. Bestimmen Sie die chemische Eigenschaft der Partikel anhand der intensiven Peaks im Bereich von 2780-2980, 1400-1640 und 709-850 cm^-1, entsprechend den Dehnungsschwingungen von CH/CH2_/CH3- und C-C-Gruppen, die mit Polymermaterialien assoziiert sind (Abbildung 3).
5. Analysieren Sie die Größe und Anzahl der identifizierten MPs mit ImageJ.
   1. Erhalten Sie die MPs-Konzentration in der Wasserprobe basierend auf dem getesteten Bereich, der Gesamtarbeitsfläche (227 mm²) und dem bekannten gefilterten Probenvolumen.
   2. Klassifizieren Sie die bestätigten MPs in 5 Gruppen in Bezug auf die Größe: 0,8-5 μm, 5-20 μm, 20-50 μm, 50-100 μm und > 100 μm.
   3. Bestimmen Sie schließlich die MPs-Menge in einem Liter Wasserprobe basierend auf dem gefilterten Probenvolumen, der Anzahl der aufgezeichneten MPs und der getesteten Fläche des Membranfilters.

6. MP topographische Charakterisierung mittels AFM

1. Statten Sie das AFM-System (NT-MDT) mit einer Zapfmodussonde aus. Kalibrieren Sie das System mit einem Stufenhöhenstandard (SHS). Richten Sie das System unter optimalen Arbeitsbedingungen ein: Die Scanrate beträgt 1 Hz, die Scangröße beträgt 10-50 μm, die Tuningfrequenz beträgt etwa 160 kHz und die Scanzeile beträgt 512 Pixel.
2. Fixieren Sie den Siliziumwafer (aus Abschnitt 4.3) auf der AFM-Probenstufe. Beobachten und fotografieren Sie die Zielpartikel auf der Oberfläche des Siliziumwafers, gefolgt von der chemischen Identifizierung mit dem Verfahren in Abschnitt 5.
3. Schalten Sie das System in den AFM-Modus (Raman-Spektroskopie und AFM werden in einem System zusammengefasst) und testen Sie die Topographie der identifizierten MPs.
4. Analysieren Sie die 3D-Daten mit der Gwyddion 2.54 Software. Verwenden Sie die Option des Profils, um die Partikelabmessungen und durchschnittlichen Höhen in der 3D-Ansicht zu erhalten, um die 3D-Struktur zu erhalten.

Ergebnisse

Zur Validierung dieses Protokolls wurde die Wasserprobe durch Zugabe von Standard-Polystyrol-Mikroplastikkugeln (ein Durchmesser von 2,0 ± 0,1 μm) zu DI-Wasser vorbereitet. Die hinzugefügte MP-Menge entsprach 4.500.000 Partikeln/L, was dem MP-Freisetzungsniveau von BFBs entspricht. Nach den Protokollabschnitten 2-3 wurden die Abgeordneten erfolgreich gesammelt (Abbildung 4A) und die Rückforderungsrate betrug 92,4-101,2%. Diese Rückgewinnungsrate ist vergleichbar mit einer früheren Stud...

Diskussion

Obwohl über die Studie von Abgeordneten im Meeres- und Süßwasserbereich ausführlich berichtet wurde und das entsprechende Standardprotokoll entwickelt wurde¹⁷, ist die Untersuchung von Kunststoffprodukten des täglichen Bedarfs ein wichtiger aufstrebender Forschungsbereich. Die unterschiedlichen Umweltbedingungen von Haushaltskunststoffprodukten bedeuten, dass zusätzliche Sorgfalt und Anstrengungen erforderlich sind, um zuverlässige Ergebnisse zu erzielen. Das Studienprotokoll muss mit den r...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
AFM cantilever	NANOSENSORS	PPP-NCSTAuD-10	To obtain three-dimensional topography of PP MPs
Atomic force microscope	Nova	NT-MDT	To obtain three-dimensional topography of PP MPs
Detergent	Fairy Original	1015054	To clean the brand-new product
Gold-coated polycarbonate-PC membrane filter-0.8 um	APC, Germany	0.8um25mmGold	To collect microplastics in water and benefit for Raman test
Gwyddion software	Gwyddion	Gwyddion2.54	To determine MPs topography
ImageJ software	US National Institutes of Health	No, free for use	To determine MPs size
Microwave oven	De'longhi, Italy	815/1195	Hot water preparation
Optical microscope, x100	Mitutoyo, Japan	46-147	To find and observe the small MPs
Raman spectroscopy	Renishaw	InVia confocal Raman system	To checmically determine the PP-MPs
Shaking bed-SSL2	Stuart, UK	51900-64	To mimic the mixing process during sample preparaton
Standard polystyrene microplastic spheres	Polysciences, Europe	64050-15	To validate the robusty of current protocol
Tansfer pipette with glass tip	Macro, Brand	26200	To transfer water sample to glass filter
Ultrasonic cleaner	Witeg, Germany	DH.WUC.D06H	To clean the glassware
Vacuum pump	ILMVAC GmbH	105697	To filter the water sample