Günlük Kullanım Sırasında Polipropilen Bebek Besleme Şişesinden Mikroplastik Salınımının Örneklemesi, Tanımlanması ve Karakterizasyonu

Özet

Bu çalışmada, plastik ürünlerin günlük kullanımından mikroplastiklerin toplanması ve tespiti için güvenilir ve uygun maliyetli bir protokol ayrıntılı olarak açıklanmıştır.

Özet

Mikroplastikler (milletvekilleri) insan sağlığına yönelik potansiyel risk nedeniyle küresel bir endişe haline gelmektedir. Plastik ürünlerin (örneğin, plastik tek kullanımlık bardaklar ve su ısıtıcıları) örnek çalışmaları, günlük kullanım sırasında MP salınımının son derece yüksek olabileceğini göstermektedir. MP salınım seviyesinin tam olarak belirlenmesi, maruz kalma kaynağını tanımlamak ve ölçmek ve bu maruziyetten kaynaklanan ilgili riskleri değerlendirmek / kontrol etmek için çok önemli bir adımdır. Deniz veya tatlı sudaki MP seviyelerini ölçme protokolleri iyi geliştirilmiş olsa da, ev plastik ürünlerinin yaşadığı koşullar büyük ölçüde değişebilir. Birçok plastik ürün sık yüksek sıcaklıklara (100 °C'ye kadar) maruz kalır ve günlük kullanım sırasında oda sıcaklığına geri soğutulur. Bu nedenle, her bir ürün için gerçek günlük kullanım senaryosunu taklit eden bir örnekleme protokolü geliştirmek çok önemlidir. Bu çalışma, birçok plastik ürünün MP salınım çalışmaları için uygun maliyetli bir protokol geliştirmek için yaygın olarak kullanılan polipropilen bazlı bebek besleme şişelerine odaklanmıştır. Burada geliştirilen protokol şunları sağlar: 1) örnekleme ve tespit sırasında potansiyel kontaminasyonun önlenmesi; 2) günlük kullanım senaryolarının gerçekçi bir şekilde uygulanması ve DSÖ yönergelerine göre bebek besleme şişelerinden serbest bırakılan milletvekillerinin doğru toplanması; ve 3) bebek besleme şişelerinden salınan milletvekillerinin uygun maliyetli kimyasal tespiti ve fiziksel topografya haritalaması. Bu protokole dayanarak, standart polistiren MP (2 μm çapında) kullanan geri kazanım yüzdesi% 92.4-101.2 iken, tespit edilen boyut tasarlanan boyutun yaklaşık% 102.2'si idi. Burada ayrıntılı olarak açıklanan protokol, MP numune hazırlama ve algılama için güvenilir ve uygun maliyetli bir yöntem sağlar ve bu da gelecekteki plastik ürünlerden MP salınımı çalışmalarına önemli ölçüde fayda sağlayabilir.

Giriş

Çoğu plastik türü biyolojik olarak parçalanamaz, ancak oksidasyon ve mekanik sürtünme gibi kimyasal ve fiziksel işlemler nedeniyle küçük parçalara ayrılabilir^1,2. 5 mm'den küçük plastik parçalar mikroplastik (milletvekilleri) olarak sınıflandırılır. Milletvekilleri her yerde bulunur ve dünyanın hemen hemen her köşesinde bulunur. İnsanlar ve yaban hayatı için potansiyel risk nedeniyle küresel bir endişe haline geldiler^3,4. Bugüne kadar, balıklarda, kuşlarda, böceklerde⁵, 6^{vememelilerde} (fare, bağırsak, böbrek ve karaciğerde 7^,8)önemli miktarda milletvekili birikimi bulunmuştur. Çalışmalar, milletvekillerinin maruz kalmasının ve birikmesinin farelerin lipid metabolizmasına zarar verebileceğini buldu^7,8. Balıklara odaklanan bir risk değerlendirmesi, mikron altı milletvekillerinin kandan beyne bariyere nüfuz haline geldiğini ve beyin hasarına neden olabileceğini buldu⁹. Bugüne kadar insan sağlığına özgü risk hala bilinmemekle birlikte, hayvan çalışmalarından tüm MP risk sonuçlarının elde edildiği belirtilmelidir.

Son 2 yılda, milletvekilinin insan sağlığına yönelik tehdidine ilişkin endişeler, insanların milletvekillerine maruz kalma seviyelerinin onaylanmasıyla önemli ölçüde arttı. Milletvekillerinin birikimi insan kolonu¹⁰, hamile kadınların plasentası¹¹ ve yetişkin tabure¹²bulundu. Mp salınım seviyelerinin kesin bir şekilde belirlenmesi, maruz kalma kaynaklarını belirlemek, sağlık riskini değerlendirmek ve olası kontrol önlemlerinin verimliliğini değerlendirmek için çok önemlidir. Son birkaç yılda, bazı vaka çalışmaları günlük kullanılan plastiklerin (yani plastik su ısıtıcısı¹³ ve tek kullanımlık bardaklar¹⁴⁾son derece yüksek miktarlarda milletvekili serbest bırakabileceğini bildirmektedir. Örneğin, tek kullanımlık kağıt bardaklar (polietilen-PE veya koalyolimer filmlerle lamine edilmiş iç mekanlarla), 85-90 °C sıcak suya maruz kalmanın ardından her mililitre sıvıya yaklaşık 250 mikron büyüklüğünde milletvekili ve 102 milyon mikron altı parçacık saldı¹⁴. Polipropilen (PP) gıda kapları üzerinde yapılan bir çalışmada, tek bir kullanım sırasında kaptan 7,6 mg'a kadar plastik partikül salındığı^{bildirilmiştir 15}. Polietilen tereftalat (PET) ve naylondan yapılan çay poşetlerinden daha da yüksek seviyeler kaydedildi, bu da yaklaşık 11,6 milyar milletvekili ve 3,1 milyar nano boyutlu milletvekilini içeceğin tek bir bardağına (10 mL) serbest bıraktı¹⁶. Günlük kullanılan bu plastik ürünlerin yiyecek ve içecek hazırlama için tasarlandığı göz önüne alındığında, yüksek miktarda milletvekilinin serbest bırakılması muhtemeldir ve tüketimleri insan sağlığı için potansiyel bir tehdittir.

Ev plastik ürünlerinden MP salınımı ile ilgili çalışmalar (örneğin, plastik su ısıtıcısı¹³ ve tek kullanımlık bardaklar¹⁴⁾erken aşamadadır, ancak bu konunun araştırmacılardan ve genel halktan giderek daha fazla ilgi görmesi beklenmektedir. Bu çalışmalarda gerekli olan yöntemler, iyi kurulmuş protokollerin zaten mevcut olduğu oda sıcaklığı deniz veya tatlı su çalışmalarında kullanılanlardan önemli ölçüde farklıdır¹⁷. Buna karşılık, ev plastik ürünlerinin günlük kullanımını içeren çalışmalar çok daha yüksek sıcaklık (100 ° C'ye kadar) içerir ve çoğu durumda oda sıcaklığına tekrar tekrar bisiklete biner. Önceki çalışmalar, sıcak su ile temas eden plastiklerin milyonlarca milletvekilini serbest bırakabileceğine işaret etti^16,18. Ek olarak, plastik ürünlerin günlük kullanımı zamanla plastiğin özelliklerini değiştirebilir. Bu nedenle, en yaygın günlük kullanım senaryolarını doğru bir şekilde taklit eden bir örnekleme protokolü geliştirmek çok önemlidir. Mikro boyutlu parçacıkların tespiti de bir diğer büyük zorluktur. Önceki çalışmalar, milletvekillerinin plastik ürünlerden salındığının 20 μm^{16 , 19,20}'den küçük^olduğunaişaret etti. Bu tür milletvekillerinin tespiti, küçük gözenek boyutuna sahip pürüzsüz membran filtrelerinin kullanılmasını gerektirir. Ek olarak, milletvekillerini filtre tarafından yakalanan olası kirleticilerden ayırmak gerekir. Yüksek hassasiyet Raman spektroskopisi, küçük parçacıkları kolayca yok ettiği bilinen yüksek lazer gücü ihtiyacını önleme avantajına sahip kimyasal bileşim analizi için kullanılır²⁰. Bu nedenle, protokol kontaminasyonsuz elleçleme prosedürlerini optimum membran filtrelerinin kullanımıyla ve hızlı ve doğru MP tanımlamaya izin veren bir karakterizasyon yöntemiyle birleştirmelidir.

Burada bildirilen çalışma, günlük hayatta en sık kullanılan plastik ürünlerden biri olan PP bazlı bebek besleme şişesine (BFB) odaklanmıştır. Formül hazırlama sırasında plastik BFB'den çok sayıda milletvekilinin salındığı tespit edildi¹⁸. Günlük plastiklerden MP salınımının daha fazla incelenmesi için, BFB için numune hazırlama ve algılama yöntemi burada ayrıntılı olarak açıklanmıştır. Numune hazırlama sırasında, WHO²¹ tarafından önerilen standart formül hazırlama işlemi (temizleme, sterilizasyon ve karıştırma) dikkatle takip edildi. DSÖ yönergeleri etrafında protokoller tasarlayarak, BFF'lerden MP sürümünün ebeveynler tarafından kullanılan bebek formülü hazırlama sürecini taklit ettiğini sağladık. Filtre süreci, BFF'lerden serbest bırakılan milletvekillerini doğru bir şekilde toplamak için tasarlanmıştır. Milletvekillerinin kimyasal tanımlaması için, Raman spektroskopisinin çalışma koşulları, milletvekillerinin temiz ve kolay tanımlanmış spektrumlarını elde etmek için optimize edildi, aynı zamanda hedef parçacıkları yakma olasılığından kaçındı. Son olarak, atomik kuvvet mikroskopisi (AFM) kullanılarak milletvekillerinin doğru 3 boyutlu topografya haritalamasını sağlamak için optimum test prosedürü ve uygulanan kuvvet geliştirilmiştir. Burada ayrıntılı olarak açıklanan protokol (Şekil 1), MP numune hazırlama ve tespiti için güvenilir ve uygun maliyetli bir yöntem sağlar ve bu da gelecekteki plastik ürünlerin çalışmalarına önemli ölçüde fayda sağlayabilir.

Protokol

1. Sıcak su hazırlama

1. Numunelerle temas eden tüm donanımlar için, olası kirlenmeyi önlemek için borosilikat 3.3'den yapılmış temiz cam kullanın. Tüm cam eşyaları iyice temizleyin.
   Dikkat: Cam eşyalarda önceden var olan çizikler veya kusur lekeleri, ısıtma ve sallama işlemi sırasında parçacıkları serbest bırakabilir. Kullanıcıların cam eşyaları kontrol ettiğini ve çizilmiş cam eşyaların kullanımından kaçınmasını öneririz. Farklı bardaklardan (soda-kireç ve borosilikat gibi) yapılmış cam eşyaları karşılaştırmamız, borosilikat 3.3'ün en düşük miktarda cam parçacık salgıladığını gösterdi (Raman spektroskopisi ile taranabilir) ve tüm testlerde borosilikat 3.3 camlarının kullanılmasını öneririz.
2. Bir cam kabın içine 360 mL DI suyu dökün. Kabı temiz bir cam diskle örtün. Daha sonra yepyeni bir mikrodalga fırına taşıyın ve tam fırın gücünde 2,5 dakika ısıtın. Düzensiz ısıtma nedeniyle olası sıcaklık gradyanlarını gidermek için hafifçe sallanan, kabın içindeki suyun sıcaklığı 70 ° C'dir ve numune hazırlamaya hazırdır.
3. Züccaciyeye 1 L DI suyu dökerek ve mikrodalga fırında 14 dakika ısıtarak BFB sterilizasyonu için 95 °C su hazırlayın.
   Dikkat: Sıcak su hazırlamak için asla plastik su ısıtıcıları kullanmayın. Plastik su ısıtıcısının kendisi, kaynama işlemi sırasında milyonlarca milletvekilini sıcak suya bırakır¹³.

2. Formül hazırlığı sırasında MP sürümü

NOT: WHO²¹tarafından önerilen standart formül hazırlama işlemini (temizleme, sterilizasyon ve karıştırma) dikkatle takip ederek, formül hazırlama sırasında BGB'lerden salınan milletvekilleri aşağıdaki 3 adımda taklit edilir.

1. Eczane mağazalarından yepyeni BFB ürünlerini toplayın ve ürünü ambalajından çıkardıktan sonra iyice temizleyin. Her BFB'yi deterjanlı su (oda sıcaklığında 3 kez tekrarlayın-RT) ve damıtılmış su (3 kez tekrarlanır, RT) kullanarak yıkayın. Son olarak, RT'de DI suyu kullanarak BFB'yi 3 kez durulayın.
   Dikkat: Sonication kullanarak BFB'nin temizlenmesini yapmayın. Sonication karıştırma ve temizlik için laboratuvarlarda yaygın olarak kullanılsa da, BFB sonication ciddi şişe yüzeyine zarar verebilir ve 1 dakika içinde PP ürünlerinden MP salınımına neden olabilir.
2. Şişeyi sterilize etmek için BFB'yi 95 °C DI suya (bölüm 1.3) batırın. BFB'nin yüzmesini önlemek için, paslanmaz çelik bir cımbız kullanarak BFB'nin dış kısmına hafifçe bastırın ve tüm şişe gövdesinin suya daldığından emin olun.
   1. 5 dakika sonra şişeyi çıkar ve temiz bir cam diske taşıyın. Hava kurutma adımı sırasında, damlacık kanıtı olmayana kadar şişeyi cam diskte ters çevirin.
3. Havayla kurutulmuş şişeye 180 mL sıcak DI suyu (DSÖ yönergelerine karşılık gelen Bölüm 1.2'den 70 °C) dökün. Ardından şişeyi hemen bir cam Petri kabı kullanarak örtün ve sallanan bir yatağa yerleştirin.
   1. Formül karıştırma işlemini simüle etmek için şişeyi 60 saniye boyunca 180 rpm hızında sallayın. Salladıktan sonra şişeyi temiz bir cam tabağa taşıyın ve soğumasını bekleyin.

3. MP tanımlama ve niceleme için örnek hazırlık

1. DI suyu kullanarak cam filtrenin tüm parçalarını (25 mm çapında, cam huni, frit cam destek tabanı ve alıcı şişesi) sonicate edin ve iyice durulayın.
   1. Cam tabanın ortasına bir parça altın kaplı polikarbonat PC membran filtresi (0,8 μm gözenek boyutu, 40 nm Au kaplama tabakası kalınlığı) yerleştirin.
   2. Membran filtresini sabitlemek için cam hunisini ve paslanmaz çelik kelepçeyi monte edin. Son olarak monte edilmiş cam filtreyi bir vakum pompasına bağlayın (Şekil 2).
      Dikkat: Membran cam tabanın yüzeyine düzgün bir şekilde yapıştığından emin olmak için cam tabanı ıslak tutmak önemlidir. Gerekirse, membran filtresini yerleştirmeden önce cam tabanın yüzeyine 1-2 damla DI suyu bırakılmalıdır.
2. Soğutulmuş su örneğini BFB'de (Bölüm 2.3'ten) dikkatlice karıştırın ve ardından bir cam pipet kullanarak belirli miktarda su örneğini cam hunine aktarın. Su örneğinin membran filtresinden yavaşça filtrelenebilmesi için vakum pompasını kapatın.
   1. Filtreden sonra, huni üzerinde partikül olmadığından emin olmak için cam hunisinin içini DI suyu kullanarak yıkayın.
      Dikkat: Membran filtresinin yüzeyindeki parçacıkların çakışmasını önlemek için, filtreden geçirilen doğru su hacmini dikkatlice seçmek önemlidir. BFF'ler çok sayıda parçacık serbest bırakır, böylece su örneğinin tüm hacmini filtrelemek için 3-5 membran filtresi gerekir.
3. Vakum pompasını çıkarın ve cam filtreyi sökün. Ardından, paslanmaz çelik bir cımbız kullanarak membran filtresini dikkatlice çıkartın ve temiz bir kapak camına taşıyın. Zar filtresini küçük bir kağıt bant kullanarak kapak camına sabitleyin. Örneği hemen temiz bir cam Petri kabında saklayın.

4. AFM topografya karakterizasyonu için örnek hazırlık

1. Temiz bir silikon gofret hazırlayın. Silikon gofret yüzeyine 50 μL'lik bir su örneği (Bölüm 2.3'ten) bırakın ve yaklaşık 103 °C sıcaklıkta bir fırında kurutun. Su numuneslerindeki MP seviyesi düşükse bu işlemi tekrarlayın.
2. 1 saat kuruduktan sonra, gofredi temiz bir cam Petri kabına taşıyın ve bir kurutucuda soğumasını bekleyin.
3. Gofret soğuduktan sonra, numuneyi kuru ve temiz bir cam petri kabında saklayın.

5. Raman spektroskopisi kullanılarak MP tanımlama ve niceleme

1. Raman sistemini sıfır sıra düzeltme ve silikon gofret kullanarak kalibre edin. Silikon gofretin en yüksek konumunun 520,7 cm^-1 seviyesinde olduğundan ve lazer yoğunluğu %100 olduğunda bu pik yoğunluğunun 6000 a.u'dan yüksek olduğundan emin olun.
2. Milletvekillerinin yanmasını önlerken yüksek sinyalden gürültüye MP spektrumları elde etmek için Raman sisteminin parametrelerini ayarlayın. Sistemi aşağıdaki gibi ayarlayın: 532 nm ekscitasyon lazer, kozmik ışın kaldırmak, lazer yoğunluğu% 10 (lazer gücü 0.18 mW), spektral çözünürlük 1.5 cm^-1,maruz kalma süresi 10-20 saniye, birikimler 10-40 kez ve spektral aralığı 200-3200 cm^-1. Şekil 3, 1 sn ile 400 s arasında birikim süreleri olan tipik milletvekilleri tayfını gösterdi.
   Dikkat: Hızlı yanmayı önlemek için doğrudan %100 lazer kullanarak parçacıkları test etmeyin (parçacık küçükse 1 dakika içinde yakılabilir). Düşük yoğunluklu kullanın (%10-50) önce testi yapmak için.
3. Filtre örneğini (Bölüm 3.3'ten) Raman örnek aşamasının ortasına yerleştirin. Testi yapmak için membran filtresinde dört temsili nokta seçin (2 nokta orta alanda, diğer 2 nokta ise çalışma alanının kenarına yakın, Şekil 3C).
4. Membran filtresinin yüzeyindeki parçacıkları optik mikroskop (100x) ve ardından Raman spektroskopisi kullanılarak kimyasal tanımlama kullanarak gözlemleyin ve fotoğraflayın.
   1. Elde edilen Raman spektrumunu referans standart polimer spektrumu ile karşılaştırın (BFB'nin dökme malzemesinden ve önceki yayın^22).
   2. Polimer malzemelerle ilişkili CH/CH 2 /CH 3 ve C-C gruplarının germe titreşimlerine karşılık gelen 2780-2980,^1400-1640ve 709-850 cm_-1 aralığındaki yoğun zirveleri kullanarak parçacıkların kimyasal özelliğini belirleyin (Şekil 3).
5. ImageJ kullanarak tanımlanan milletvekillerinin boyutunu ve miktarını analiz edin.
   1. Test edilen alana, toplam çalışma alanına (227 mm²⁾ve bilinen filtrelenmiş numune hacmine göre su numunesinde milletvekilleri konsantrasyonu elde edin.
   2. Onaylanan milletvekillerini boyut açısından 5 gruba sınıflandırın: 0,8-5 μm, 5-20 μm, 20-50 μm, 50-100 μm ve > 100 μm.
   3. Son olarak, filtrelenmiş numune hacmine, kaydedilen milletvekili sayısına ve membran filtresinin test edilen alanına göre milletvekillerinin miktarını bir litre su numunesinde belirleyin.

6. AFM kullanarak MP topografik karakterizasyon

1. AFM sistemini (NT-MDT) dokunma modu probuyla donatın. Sistemi bir adım yüksekliği standardı (SHS) kullanarak kalibre et. Sistemi en uygun çalışma koşullarında kurun: tarama hızı 1 Hz, tarama boyutu 10-50 μm, ayar frekansı yaklaşık 160 kHz ve tarama çizgisi 512 pikseldir.
2. Silikon gofretini (Bölüm 4.3'ten itibaren) AFM örnek aşamasında sabitle. Silikon gofret yüzeyindeki hedef parçacıkları gözlemleyin ve fotoğraflayın, ardından Bölüm 5'teki yöntemi kullanarak kimyasal tanımlama.
3. Sistemi AFM moduna geçirin (Raman spektroskopisi ve AFM tek bir sistemde monte edilir) ve tanımlanan milletvekillerinin topografyasını test edin.
4. Gwyddion 2.54 yazılımını kullanarak 3d verileri analiz edin. 3D yapı elde etmek için 3D görünüm iken parçacık boyutlarını ve ortalama yükseklikleri elde etmek için profil seçeneğini kullanın.

Sonuçlar

Bu protokolü doğrulamak için, su numunesi DI suyuna standart polistiren mikroplastik küreler (2.0 ± 0.1 μm çapında) eklenerek hazırlanmıştır. Eklenen MP miktarı, BFB'lerin MP yayın seviyesine benzer şekilde 4.500.000 parçacık / L'ye karşılık gelir. Protokol bölüm 2-3'ün ardından milletvekilleri başarıyla toplandı (Şekil 4A) ve iyileşme oranı %92,4-101,2 olarak gerçekleşti. Bu iyileşme oranı milletvekilleri üzerinde daha önce yapılan bir çalışma ile kar...

Tartışmalar

Milletvekillerinin deniz ve tatlı su alanındaki çalışmaları yaygın olarak rapor edilmiş ve ilgili standart protokol geliştirilmiş olmasına rağmen¹⁷, günlük kullanılan plastik ürünlerin incelenmesi önemli bir gelişmekte olan araştırma alanıdır. Ev plastik ürünlerinin yaşadığı farklı çevre koşulları, güvenilir sonuçlar elde etmek için ekstra bakım ve çabaya ihtiyaç duyulduğu anlamına gelir. Çalışma protokolü gerçek günlük kullanım senaryolarıyla tuta...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
AFM cantilever	NANOSENSORS	PPP-NCSTAuD-10	To obtain three-dimensional topography of PP MPs
Atomic force microscope	Nova	NT-MDT	To obtain three-dimensional topography of PP MPs
Detergent	Fairy Original	1015054	To clean the brand-new product
Gold-coated polycarbonate-PC membrane filter-0.8 um	APC, Germany	0.8um25mmGold	To collect microplastics in water and benefit for Raman test
Gwyddion software	Gwyddion	Gwyddion2.54	To determine MPs topography
ImageJ software	US National Institutes of Health	No, free for use	To determine MPs size
Microwave oven	De'longhi, Italy	815/1195	Hot water preparation
Optical microscope, x100	Mitutoyo, Japan	46-147	To find and observe the small MPs
Raman spectroscopy	Renishaw	InVia confocal Raman system	To checmically determine the PP-MPs
Shaking bed-SSL2	Stuart, UK	51900-64	To mimic the mixing process during sample preparaton
Standard polystyrene microplastic spheres	Polysciences, Europe	64050-15	To validate the robusty of current protocol
Tansfer pipette with glass tip	Macro, Brand	26200	To transfer water sample to glass filter
Ultrasonic cleaner	Witeg, Germany	DH.WUC.D06H	To clean the glassware
Vacuum pump	ILMVAC GmbH	105697	To filter the water sample