매일 사용하는 동안 폴리 프로필렌 아기 먹이 병에서 방출 마이크로 플라스틱의 샘플링, 식별 및 특성화

요약

이 연구는 플라스틱 제품의 일상적인 사용에서 미세 플라스틱 수집 및 탐지를위한 신뢰할 수 있고 비용 효율적인 프로토콜을 자세히 설명했습니다.

초록

미세 플라스틱 (의원)은 인간의 건강에 잠재적 인 위험으로 인해 세계적인 관심사가되고 있습니다. 플라스틱 제품(예: 플라스틱 일회용 컵 및 주전자)에 대한 사례 연구에 따르면 매일 사용하는 동안 MP 릴리스가 매우 높을 수 있음을 나타냅니다. MP 방출 수준을 정확하게 결정하는 것은 노출 소스를 식별하고 정량화하고 이 노출에서 비롯된 해당 위험을 평가/제어하는 중요한 단계입니다. 해양 또는 담수에서 MP 수준을 측정하기위한 프로토콜이 잘 개발되었지만 가정용 플라스틱 제품에 의해 경험되는 조건은 매우 다양 할 수 있습니다. 많은 플라스틱 제품은 빈번한 고온 (최대 100 °C)에 노출되며 매일 사용하는 동안 실온으로 다시 냉각됩니다. 따라서 각 특정 제품에 대한 실제 일일 사용 시나리오를 모방한 샘플링 프로토콜을 개발하는 것이 중요합니다. 이 연구는 많은 플라스틱 제품의 MP 방출 연구를위한 비용 효율적인 프로토콜을 개발하기 위해 널리 사용되는 폴리 프로필렌 기반의 아기 먹이 병에 초점을 맞추었다. 여기서 개발된 프로토콜은 샘플링 및 검출 중 잠재적 오염을 예방할 수 있습니다. 2) WHO 지침에 따라 유아 용병에서 방출 된 일일 사용 시나리오및 정확한 수집의 현실적인 구현; 및 3) 아기 먹이 병에서 풀어 놓인 의원의 비용 효과적인 화학 적 결정 및 물리적 지형 매핑. 이 프로토콜에 따라 표준 폴리스티렌 MP(직경 2 μm)를 사용한 회수 비율은 92.4-101.2%였으며 검출된 크기는 설계 크기의 약 102.2%였다. 여기에 자세히 설명된 프로토콜은 MP 샘플 준비 및 검출을 위한 안정적이고 비용 효율적인 방법을 제공하며, 이는 플라스틱 제품에서 MP 릴리스의 향후 연구에 실질적으로 도움이 될 수 있습니다.

서문

대부분의 플라스틱 유형은 생분해성이 없지만 산화 및 기계적 마찰^1,2와같은 화학적 및 물리적 공정으로 인해 작은 조각으로 분해될 수 있습니다. 5mm 미만의 플라스틱 조각은 미세 플라스틱(MP)으로 분류됩니다. 의원은 유비쿼터스이며 세계의 거의 모든 구석에서 발견됩니다. 그(것)들은 인간과 야생 동물에 잠재적인 리스크 때문에^세계적인관심사가 되었습니다^3,4. 현재까지, 의원의 상당한 축적은 물고기, 조류, 곤충^5,6뿐만 아니라 포유동물 (마우스, 창자, 신장 및 간^7,8)에서발견되었습니다. 연구 결과는 의원의 노출 그리고 축적이 마우스의 지질 대사를 손상시킬 수 있다는 것을^{것을을발견했습니다 7,8.} 물고기에 초점을 맞춘 위험 평가는 하위 미크론 의원이 혈액 대 뇌 장벽을 관통하고 뇌 손상을 일으킬 수 있음을^{발견 9.} 현재까지 모든 MP 위험 결과는 동물 연구에서 얻은 반면 인간의 건강에 대한 구체적인 위험은 아직 알려지지 않았습니다.

지난 2 년 동안, 인간의 건강에 대한 MP 위협에 대한 우려는 의원에 대한 인간의 노출 수준의 확인과 함께 실질적으로 증가했습니다. 국회의원의 축적은 인간 결장^{10,임산부(11)와 성인 대변(12)의} 태반에서 발견되었다. MP 방출 수준의 정확한 결정은 노출 소스를 식별하고, 건강 위험을 평가하고, 잠재적인 제어 조치의 효율성을 평가하는 데 매우 중요합니다. 지난 몇 년 동안, 일부 사례 연구는 매일 사용하는 플라스틱 (즉, 플라스틱 주전자¹³ 및 일회용 컵^14)이매우 높은 양의 의원을 방출 할 수 있다고보고했습니다. 예를 들어, 일회용 종이 컵(폴리에틸렌-PE 또는 공중합체 필름으로 적층된 내부) 약 250개의 미크론 크기의 MP와 1억 2,000만 개의 서브 미크론 크기의 입자를 85-90°C의 뜨거운^물에노출된 후 액체의 각 밀리리터에 방출하였다. 폴리 프로필렌 (PP) 식품 용기의 연구는 플라스틱 입자의 최대 7.6 mg이 단일 사용 동안 용기에서 방출되는 것으로 보고^15. 폴리에틸렌 테레프탈레이트(PET)와 나일론으로 만든 티백에서 더 높은 수준이 기록되었으며, 약^116억명의 의원과 31억 나노 크기의 의원을 음료 16잔(10mL)으로 방출했다. 이러한 일일 사용 플라스틱 제품이 식음료 준비를 위해 설계되었기 때문에 대량의 의원을 방출할 가능성이 높으며 소비는 인간의 건강에 잠재적인 위협이 될 수 있습니다.

가정용 플라스틱 제품(예: 플라스틱 주전자^13개 및 일회용 컵^14)의MP 방출에 대한 연구는 초기 단계에 있지만, 이 주제는 연구자와 일반 대중의 관심을 끌 것으로 예상됩니다. 이러한 연구에서 필요한 방법은 잘 확립 된 프로토콜이 이미^17이존재하는 실온 해양 또는 담수 연구에 사용되는 것과 크게 다릅니다. 대조적으로, 가정용 플라스틱 제품의 일일 사용과 관련된 연구는 훨씬 더 높은 온도 (최대 100 °C)를 포함하며 많은 경우 실온으로 다시 사이클링을 반복합니다. 이전 연구는 뜨거운 물과 접촉 플라스틱 은 의원^16,18의수백만을 해제 할 수 있음을 지적했다. 또한, 플라스틱 제품의 일일 사용은 시간이 지남에 따라 플라스틱 자체의 특성을 변경할 수 있습니다. 따라서 가장 일반적인 일일 사용 시나리오를 정확하게 모방하는 샘플링 프로토콜을 개발하는 것이 중요합니다. 미세 크기의 입자의 검출은 또 다른 주요 과제입니다. 이전 연구는 플라스틱 제품에서 방출하는 의원이 20μm^{16,19,20보다}작다는 것을 지적했습니다. 이러한 유형의 의원을 감지하려면 작은 기공 크기의 부드러운 멤브레인 필터를 사용해야 합니다. 또한, 필터에 의해 캡처 가능한 오염 물질에서 의원을 구별 할 필요가있다. 고감도 라만 분광법은 화학 조성 분석에 사용되며, 이는 작은^{입자(20)를}쉽게 파괴하는 것으로 알려진 높은 레이저 전력의 필요성을 피할 수 있는 장점이 있다. 따라서 이 프로토콜은 오염없는 처리 절차를 최적의 멤브레인 필터를 사용하고 빠르고 정확한 MP 식별을 허용하는 특성화 방법을 결합해야 합니다.

이 연구는 일상 생활에서 가장 일반적으로 사용되는 플라스틱 제품 중 하나인 PP 기반 의 젖병(BFB)에 초점을 맞추고 있다고 보고했습니다. 수식 준비¹⁸동안 플라스틱 BFB에서 많은 수의 의원이 방출되는 것으로 나타났습니다. 매일 플라스틱에서 MP 방출에 대한 추가 연구를 위해 BFB에 대한 샘플 준비 및 검출 방법은 여기에 자세히 설명되어 있습니다. 시료 준비 중 WHO^21에서 권장하는 표준 수식 준비 과정(세척, 살균 및 혼합)을 신중하게 따랐다. WHO 지침에 관한 프로토콜을 설계함으로써 BFBs의 MP 릴리스가 부모가 사용하는 유아용 분유 준비 프로세스를 모방하도록 했습니다. 필터 프로세스는 BfB에서 방출된 의원을 정확하게 수집하도록 설계되었습니다. 의원의 화학적 식별을 위해 라만 분광법의 작업 조건은 의원들의 깨끗하고 쉽게 식별되는 스펙트럼을 얻기 위해 최적화되었으며, 동시에 표적 입자를 연소할 가능성을 피했습니다. 마지막으로, 원자력 현미경검사(AFM)를 이용한 MP의 정확한 3차원 지형 매핑을 허용하는 최적의 시험 절차와 적용된 힘이 개발되었다. 여기에 상세히 설명된프로토콜(그림 1)은MP 샘플 준비 및 검출을 위한 안정적이고 비용 효율적인 방법을 제공하며, 이는 향후 플라스틱 제품에 대한 연구에 실질적으로 도움이 될 수 있다.

프로토콜

1. 뜨거운 물 준비

1. 시료와 접촉하는 모든 하드웨어의 경우, 보로실리케이트 3.3로 만든 깨끗한 유리를 사용하여 잠재적인 오염을 방지하십시오. 모든 유리 제품을 철저히 청소하십시오.
   주의: 유리 제품에 기존의 스크래치 또는 불완전 한 반점은 가열 및 흔들림 과정에서 입자를 방출 할 수 있습니다. 우리는 사용자가 유리 제품을 확인하고 긁힌 유리 제품의 사용을 피하는 것이 좋습니다. 다른 안경 (예 : 소다 라임 및 borosilicate)으로 만든 유리 제품을 비교한 결과 borosilicate 3.3은 가장 낮은 양의 유리 입자 (라만 분광법에 의해 선별 될 수 있음)를 방출하며 모든 테스트에서 borosilicate 3.3 유리 제품을 사용하는 것이 좋습니다.
2. 유리 비커에 360mL의 DI 물을 붓습니다. 깨끗한 유리 디스크로 비커를 덮습니다. 그런 다음 새로운 전자 레인지로 이동하고 전체 오븐 전원으로 2.5 분 동안 가열합니다. 고르지 않은 가열로 인해 잠재적인 온도 그라데이션을 제거하기 위해 부드럽게 흔들면 비커 내부의 물의 온도는 70 °C이며 시료 준비를위한 준비가되어 있습니다.
3. 유리 제품에 DI 물 1L을 붓고 전자 레인지에 14 분 동안 가열하여 BFB 살균을위한 95 °C 물을 준비하십시오.
   주의: 뜨거운 물을 준비하기 위해 플라스틱 주전자를 사용하지 마십시오. 플라스틱 주전자 자체는 끓는 과정 동안 뜨거운 물에 의원의 수백만을 해제^13.

2. 수식 준비 중 MP 릴리스

참고: WHO^21에서권장하는 표준 수식 준비 과정(세척, 살균 및 혼합)에 따라, 수식 준비 중에 BFB에서 방출된 의원은 다음 3단계에서 모방된다.

1. 약국 매장에서 새로운 BFB 제품을 수집하고 포장에서 제품을 제거 한 후 철저하게 청소하십시오. 세제용수(실온-RT에서 3회 반복) 및 증류수(3회 반복, RT)를 사용하여 각 BFB를 세척합니다. 마지막으로 RT에서 DI 물을 사용하여 BFB를 3 번 헹구습니다.
   주의: 초음파 처리를 사용하여 BFB를 청소하지 마십시오. 초음파 처리는 혼합 및 청소를위한 실험실에서 널리 사용되지만 BFB의 초음파 처리는 병 표면을 심각하게 손상시키고 1 분 이내에 PP 제품에서 MP 방출을 일으킬 수 있습니다.
2. BFB를 95°C DI 물(섹션 1.3)에 담그고 병을 살균합니다. BFB의 부동을 피하기 위해 스테인레스 스틸 트위저를 사용하여 BFB의 외관을 약간 누르고 전체 병 본체가 물에 몰입하도록 하십시오.
   1. 5분 후 병을 꺼내 깨끗한 유리 디스크로 옮습니다. 공기 건조 단계 동안, 물방울의 증거가 없을 때까지 유리 디스크에 병을 반전.
3. 180mL의 온수 DI 수(70°C, WHO 지침에 상응하는 1.2항)를 공기 건조 병에 붓습니다. 그런 다음 유리 페트리 접시를 사용하여 즉시 병을 덮고 흔들리는 침대에 놓습니다.
   1. 수식 믹싱 공정을 시뮬레이션하려면 병을 180rpm의 속도로 60초 동안 흔들어 줍니다. 흔들기 후 병을 깨끗한 유리 판으로 옮기고 식힙니다.

3. MP 식별 및 정량화를 위한 샘플 준비

1. DI 물을 사용하여 유리 필터 (직경 25mm, 유리 깔때기, fritted 유리 지지대 및 수신기 플라스크)의 모든 부분을 초음파 처리하고 철저히 헹구십시오.
   1. 유리 베이스 중간에 금 코팅 폴리카보네이트-PC 멤브레인 필터(0.8 μm의 모공 크기, 40nm의 Au 코팅 층 두께)를 배치합니다.
   2. 유리 깔때기와 스테인레스 스틸 클램프를 조립하여 멤브레인 필터를 고정합니다. 마지막으로 조립 된 유리 필터를 진공 펌프(그림 2)에연결합니다.
      주의: 멤브레인이 유리 베이스의 표면에 부드럽게 달라붙도록 하려면 유리 베이스를 젖은 상태로 유지하는 것이 중요합니다. 필요한 경우, 막 필터를 내려 놓기 전에 1-2 방울의 DI 물을 유리 베이스 표면에 떨어뜨려야 합니다.
2. BFB(섹션 2.3에서)에서 냉각된 물 샘플을 조심스럽게 혼합한 다음 유리 파이펫을 사용하여 일정량의 물 샘플을 유리 깔때기로 옮다. 진공 펌프를 전환하여 물 샘플이 멤브레인 필터를 천천히 걸러내도록 합니다.
   1. 여과 후 DI 물을 사용하여 유리 깔때기의 내부를 세척하여 깔때기에 입자가 붙어 있지 않도록하십시오.
      주의: 멤브레인 필터 표면에 입자가 겹치지 않도록 필터를 통과하는 정확한 물 량을 신중하게 선택하는 것이 중요합니다. BfB는 물 샘플의 전체 부피를 필터링하기 위해 3-5 멤브레인 필터가 필요하도록 많은 수의 입자를 방출합니다.
3. 진공 펌프를 분리하고 유리 필터를 분해합니다. 그런 다음 스테인레스 스틸 트위저를 사용하여 멤브레인 필터를 조심스럽게 꺼내 깨끗한 커버 글래스로 옮습니다. 작은 종이 테이프를 사용하여 커버 글래스의 멤브레인 필터를 고정합니다. 즉시 깨끗한 유리 페트리 접시에 샘플을 저장합니다.

4. AFM 지형 특성화를 위한 샘플 준비

1. 깨끗한 실리콘 웨이퍼를 준비합니다. 실리콘 웨이퍼 표면에 50 μL 물 샘플(섹션 2.3에서)을 떨어 뜨리고 약 103 °C의 온도에서 오븐에서 건조시십시오. 물 샘플의 MP 레벨이 낮은 경우 이 프로세스를 반복합니다.
2. 1시간 의 건조 후 웨이퍼를 깨끗한 유리 페트리 접시로 옮기고 건조기에서 식힙니다.
3. 웨이퍼가 식은 후, 건조하고 깨끗한 유리 페트리 접시에 샘플을 저장합니다.

5. 라만 분광법을 사용하여 MP 식별 및 정량화

1. 제로 오더 보정 및 실리콘 웨이퍼를 사용하여 라만 시스템을 교정합니다. 실리콘 웨이퍼의 피크 위치가 520.7cm^-1이고 레이저 강도가 100 %일 때 피크 강도가 6000 a.u. 보다 높은지 확인하십시오.
2. 라만 시스템의 매개 변수를 설정하여 의원의 연소를 피하면서 높은 신호 대 잡음 MP 스펙트럼을 얻습니다. 다음과 같이 시스템을 설정 : 532 nm 여기 레이저, 우주 광선 제거, 레이저 강도 10 % (레이저 전력 0.18 mW), 스펙트럼 해상도 1.5cm^-1,10-20 초의 노출 시간, 10-40 배의 축적 및 스펙트럼 범위 200-3200cm^-1. 그림 3은 1초에서 400초까지 누적 시간을 가진 의원들의 전형적인 스펙트럼을 보였다.
   주의: 100% 레이저를 사용하여 입자를 직접 테스트하지 말고 빠른 연소를 방지하십시오(입자가 작으면 1분 만에 연소할 수 있음). 저강도 사용(10-50%) 먼저 테스트를 수행합니다.
3. 라만 샘플 스테이지 중간에 필터 샘플(섹션 3.3에서)을 배치합니다. 시험을 수행하기 위해 멤브레인 필터에 4개의 대표 반점(2점은 중간 영역에 있는 반면, 다른 2개의 반점이 작업 영역의 가장자리에 가깝고, 도 3C)를선택하여 시험을 수행한다(총 시험 영역 은 1.5mm^2).
4. 광학 현미경(100x)을 사용하여 멤브레인 필터 표면의 입자를 관찰하고 촬영한 다음 라만 분광법을 사용하여 화학적 식별을 수행합니다.
   1. 기준 표준 폴리머 스펙트럼(BFB 및 이전^{간행물(22)의}벌크 재료로부터 얻은 라만 스펙트럼을 비교한다.
   2. 2780-2980, 1400-1640 및 709-850cm^-1범위의집중성 피크를 이용하여 입자의 화학적 특성을 결정하며, 이는 폴리머 물질과 관련된 CH/CH_2/CH3 및 C-C 군의 스트레칭 진동에 해당한다(그림3).
5. ImageJ를 사용하여 식별된 의원의 크기와 양을 분석합니다.
   1. 검증된 면적, 총 작업 영역(227mm²⁾및 알려진 여과된 시료 부피를 기준으로 수질 샘플에서 의원 농도를 획득한다.
   2. 0.8-5 μm, 5-20 μm, 20-50 μm, 50-50 μm, 50-100 μm 및 > 100 μm : 5 그룹으로 확인 된 의원을 분류합니다.
   3. 마지막으로, 여과된 시료 부피, 멤브레인 필터의 기록 및 테스트 된 면적을 기준으로 한 리터의 물 샘플에서 의원 양을 결정합니다.

6. AFM을 이용한 MP 지형 특성화

1. AFM 시스템(NT-MDT)에 태핑 모드 프로브를 장착합니다. 단계 높이 표준(SHS)을 사용하여 시스템을 보정합니다. 최적의 작업 조건 내에서 시스템을 설정 : 스캔 속도는 1 Hz, 스캔 크기는 10-50 μm, 튜닝 주파수는 약 160 kHz이며, 스캔 라인은 512 픽셀입니다.
2. AFM 샘플 단계에서 실리콘 웨이퍼(섹션 4.3에서)를 수정합니다. 실리콘 웨이퍼 의 표면에 표적 입자를 관찰하고 촬영한 다음 5절에서 방법을 사용하여 화학적 식별을 한다.
3. 시스템을 AFM 모드(라만 분광기 및 AFM은 하나의 시스템에서 조립)로 전환하고 식별된 MP의 지형을 테스트합니다.
4. Gwyddion 2.54 소프트웨어를 사용하여 3d 데이터를 분석합니다. 3D 구조를 얻기 위해 3D 뷰동안 파티클 치수와 평균 높이를 얻기 위해 프로파일 옵션을 사용합니다.

결과

이 프로토콜을 검증하기 위해, 물 샘플은 표준 폴리스티렌 미세 플라스틱 구체(직경 2.0 ± 0.1 μm)를 DI 물에 추가하여 제조하였다. 추가된 MP 수량은 BFB의 MP 방출 수준과 유사한 4,500,000개의 입자/L에 해당합니다. 프로토콜 섹션 2-3에 이어 국회의원이 성공적으로 수집되었으며(그림4A)와회복률은 92.4-101.2%였다. 이 회복율은 의원^23에대한 이전 연구와 비교됩니다...

토론

해양 및 담수의 의원들에 대한 연구가 널리 보고되고 관련 표준 프로토콜이^17개개발되었지만, 일일 플라스틱 제품에 대한 연구는 중요한 신흥 연구 분야입니다. 가정용 플라스틱 제품에 의해 경험되는 다른 환경 조건은 신뢰할 수있는 결과를 얻기 위해 여분의 주의와 노력이 필요하다는 것을 의미합니다. 스터디 프로토콜은 실제 일일 사용 시나리오와 일치해야 합니다. 예를 들?...

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
AFM cantilever	NANOSENSORS	PPP-NCSTAuD-10	To obtain three-dimensional topography of PP MPs
Atomic force microscope	Nova	NT-MDT	To obtain three-dimensional topography of PP MPs
Detergent	Fairy Original	1015054	To clean the brand-new product
Gold-coated polycarbonate-PC membrane filter-0.8 um	APC, Germany	0.8um25mmGold	To collect microplastics in water and benefit for Raman test
Gwyddion software	Gwyddion	Gwyddion2.54	To determine MPs topography
ImageJ software	US National Institutes of Health	No, free for use	To determine MPs size
Microwave oven	De'longhi, Italy	815/1195	Hot water preparation
Optical microscope, x100	Mitutoyo, Japan	46-147	To find and observe the small MPs
Raman spectroscopy	Renishaw	InVia confocal Raman system	To checmically determine the PP-MPs
Shaking bed-SSL2	Stuart, UK	51900-64	To mimic the mixing process during sample preparaton
Standard polystyrene microplastic spheres	Polysciences, Europe	64050-15	To validate the robusty of current protocol
Tansfer pipette with glass tip	Macro, Brand	26200	To transfer water sample to glass filter
Ultrasonic cleaner	Witeg, Germany	DH.WUC.D06H	To clean the glassware
Vacuum pump	ILMVAC GmbH	105697	To filter the water sample