模拟小鼠中风:通过颈外动脉的短暂性脑中动脉闭塞

摘要

脑中动脉阻塞（MCAo）的不同模型用于实验性中风研究。在这里，描述了通过颈外动脉（ECA）的短暂性MCAo的实验性中风模型，该模型旨在模仿人类中风，其中由于自发凝块溶解或治疗而切除脑血管血栓。

摘要

在发达国家，卒中是第三大常见死亡原因，也是获得性成人残疾的主要原因。迄今为止，治疗选择仅限于中风后最初几个小时内的一小部分卒中患者。正在广泛研究新的治疗策略，特别是延长治疗时间窗口。目前的这些研究包括研究卒中后重要的病理生理学途径，如卒中后炎症、血管生成、神经元可塑性和再生。在过去十年中，人们越来越关注独立研究小组对实验结果和科学发现的可重复性差的担忧。为了克服所谓的"复制危机"，迫切需要所有程序的详细标准化模型。作为"免疫中风"研究联盟（https://immunostroke.de/）的一项努力，提出了一种短暂的脑中动脉阻塞（MCAo）的标准化小鼠模型。该模型允许在去除细丝时完全恢复血流，模拟在大部分人类中风中发生的治疗性或自发性凝块裂解。该"细丝"卒中模型的外科手术过程及其功能分析工具在随附的视频中进行了演示。

引言

中风是全世界最常见的死亡和残疾原因之一。虽然脑卒中主要有两种截然不同的形式，缺血性和出血性，但80-85%的卒中病例是缺血性^1。目前，缺血性卒中患者只有两种治疗方法:重组组织纤溶酶原激活剂（rtPA）的药物治疗或机械血栓切除术。然而，由于治疗时间窗口狭窄和多种排除标准，只有少数患者可以从这些特定的治疗方案中受益。在过去的二十年中，临床前和转化卒中研究一直集中在神经保护方法的研究上。然而，到目前为止，所有进入临床试验的化合物都没有显示出对患者²的改善。

由于体外模型不能准确再现中风的所有大脑相互作用和病理生理机制，因此动物模型对于临床前卒中研究至关重要。然而，在单个动物模型中模拟人类缺血性卒中的各个方面是不可行的，因为缺血性卒中是一种高度复杂和异质性疾病。因此，随着时间的推移，不同物种中已经开发了不同的缺血性卒中模型。脑小动脉光血栓形成或大脑中动脉永久性远端闭塞（MCA）是常用的模型，可诱导新皮层中小而局部定义的病变^3，4。除此之外，最常用的中风模型可能是所谓的"灯丝模型"，其中实现了MCA的瞬时闭塞。该模型包括将缝合线短暂引入MCA的起源，导致脑血流量突然减少以及随后皮质下和皮质脑区域的大梗死⁵。虽然大多数中风模型模仿MCA闭塞^6，但"灯丝模型"允许精确地划定缺血时间。通过细丝去除进行再灌注，模拟自发性或治疗性（rtPA 或机械血栓切除术）裂解后脑血流恢复的人类临床情况。迄今为止，已经描述了这种"灯丝模型"的不同修改。在最常见的方法中，首先由Longa等人描述。在1989^年5，一种硅涂层的长丝通过颈总动脉（CCA）引入MCA⁷的起源。虽然这是一种广泛使用的方法，但该模型不允许在再灌注期间完全恢复血流，因为CCA在去除细丝后永久结扎。

在过去的十年中，越来越多的研究小组对使用这种"细丝模型"对小鼠中风进行建模感兴趣。然而，该模型的相当大的可变性和程序缺乏标准化是实验结果和迄今为止报道的科学发现具有高变异性和较差再现性的一些原因^2，8。当前"复制危机"的一个潜在原因，指的是研究实验室之间的低可重复性，是使用相同的实验方法的研究小组之间不具可比性的中风梗死体积⁹。事实上，在进行了第一项临床前随机对照多中心试验研究¹⁰后，我们能够证实，该实验中风模型缺乏足够的标准化以及随后的结果参数是独立实验室之间临床前研究再现性失败的主要原因¹¹.尽管使用相同的卒中模型，但由此产生的梗死尺寸的这些巨大差异不仅对验证性研究构成威胁，而且由于缺乏稳健且可重复的模型，也对科学合作构成威胁。

鉴于这些挑战，我们旨在开发和详细描述标准化瞬态MCAo模型的程序，该模型用于"免疫中风"研究联盟（https://immunostroke.de/）内的合作研究工作。该联盟旨在了解中风恢复机制原理背后的脑免疫相互作用。此外，还介绍了用于卒中结果分析的组织学和相关功能方法。所有方法均基于ImmunoStroke联盟所有研究实验室中使用的既定标准操作程序。

研究方案

本视频中报告的实验是按照国家实验动物使用指南进行的，并且协议得到了德国政府委员会（Regierung von Oberbayern，慕尼黑，德国）的批准。使用10周龄的雄性C57Bl / 6J小鼠并将其饲养在受控温度（22±2°C）下，具有12小时的明暗循环期，并随意获得颗粒食物和水 。

1. 材料和仪器的准备

1. 连接热毯，将手术区域的温度和麻醉期间的小鼠体温保持在37°C。
2. 高压灭菌剪刀和镊子，准备70%乙醇溶液，并保持可用的dexpanthenol眼膏，几块棉花和5-0涂层编织聚酯缝合线准备使用。准备一个1毫升注射器，含有0.9%盐水溶液（不含针头），以保持动物切口部位水分充足。准备麻醉气体（100%O₂ +异氟醚）。
3. 通过切割10μL移液器尖端（3-5mm长度）的支架，为激光多普勒探头准备支架。
   注:所有器械均使用热珠灭菌器进行灭菌。手术前后还用微生物消毒剂喷雾对表面进行消毒。在手术前，用伤口消毒喷雾对小鼠头部和胸部周围的区域进行消毒。

2. 激光多普勒的制备

1. 手术前30分钟向小鼠注射镇痛剂（4mg / kg卡洛芬和0，1mg / kg丁丙诺啡，腹膜内注射）。
2. 通过将小鼠置于异氟醚流速为4%的诱导室中来麻醉小鼠，直到自发的身体运动和振动停止。
3. 将鼠标放在手术区域的俯卧位置，鼻子放在麻醉面罩中。将异氟醚浓度再保持在4%，然后再降低并将其保持在2%。
4. 设置相关的反馈控制加热垫，用于将小鼠体温保持在37°C，并轻轻插入直肠探头以监测整个手术过程中的温度。
5. 在双眼上涂抹dexpanthenol眼药膏。
6. 用70%乙醇消毒左眼和耳朵周围的皮肤和头发。
7. 切开左耳和眼睛之间的头皮（1厘米长）以暴露颅骨。
8. 切除并停用颞肌，以可视化颅骨下方的MCA。
9. 用胶水将激光多普勒探头/光纤固定在左侧MCA顶部的尖端外部。然后，粘合皮肤以关闭尖端支架周围的伤口。涂抹2-3滴硬化剂胶水以加快工艺。确保激光多普勒光纤未粘合，并且可以随时从尖端支架上轻松取下。

3. 瞬态 MCAo 模型（遮挡）

1. 将鼠标转至仰卧位。将鼻子放入麻醉锥中，并用胶带固定爪子。
2. 对胸部周围的皮肤和头发进行消毒，并在颈部做一个2厘米长的中线切口。
3. 使用镊子将皮肤和下颌下腺分开。使用牵开器固定胸骨瘤肌，暴露手术区域并找到左颈总动脉（CCA）。解剖不含结缔组织和周围神经的CCA（不损伤迷走神经），并在分叉前进行短暂结扎。
4. 解剖颈外动脉（ECA），并在最远端可见部分打一个永久性的结。在ECA下放置另一条缝合线，靠近分叉处，并准备一个松散的结以供以后使用。
5. 解剖颈内动脉（ICA）并在其上放置一个微血管夹，在分叉处5mm处。确保不要损伤迷走神经。
6. 在紧固和松动的结扎之间在ECA上切一个小孔;注意不要削减整个ECA。
7. 引入灯丝并将其推进到CCA。拧紧腔周围ECA中的松散结扎，以将细丝固定在该位置，并在取下微血管夹时避免出血。
8. 取下微血管夹并将细丝插入ICA，直到通过激光多普勒测量的脑血流量急剧减少（>80%）到达MCA的起源。通过进一步拧紧ECA周围的结，将灯丝固定在此位置。
   注意:当灯丝朝向适当的方向时，它会平稳地前进，并且不应观察到阻力。
9. 记录灯丝插入前后的激光多普勒值。
10. 在缝合伤口之前，取出牵开器并重新定位胸骨瘤肌和下颌下腺。取出激光多普勒探针，并将动物置于37°C的恢复室中1小时（直到去除灯丝）。

4. 瞬态 MCAo 模型（再灌注）

1. 通过将小鼠置于异氟醚流速为4%的诱导室中来麻醉小鼠，直到自发的身体运动和振动停止。
2. 在双眼上涂抹dexpanthenol眼药膏。
3. 将鼠标放在手术区域的俯卧位置，其鼻子放在麻醉面罩中。将异氟醚浓度再保持在4%，然后再降低并将其保持在2%。用胶带固定动物的爪子。
4. 将激光多普勒探头插入探头支架。
5. 取下伤口缝合线，用镊子将皮肤和下颌下腺分开。使用牵开器轻轻拉动胸骨肌并暴露手术区域。
6. 松开拧紧细丝的ECA缝合线，然后轻轻拉动细丝。避免在去除过程中损坏长丝的硅橡胶涂层。
7. 紧紧地系住 ECA 缝合线。
8. 确认激光多普勒装置中脑血流量的增加（再灌注前初始值的>80%）。
9. 记录去除灯丝之前和之后的激光多普勒值。
10. 在与CCA分叉之前打开瞬态结扎。
11. 取出牵开器，并在缝合伤口之前重新定位胸骨瘤肌和下颌下腺。将动物置于37°C的恢复室中1小时，以从麻醉中恢复。
12. 恢复后，将小鼠放回温度受控室的笼子里。
13. 通过在笼子地板上的小培养皿中加入湿的食物颗粒和水凝胶来照顾动物，直到手术后的第3天。
14. 手术后每12小时注射一次镇痛药3天（4mg / kg卡洛芬和0.1mg / kg丁丙诺啡）。

5. 假操作

1. 执行上述所有程序，包括动脉结扎和引入细丝（步骤1-3.7）。
2. 插入后立即取下灯丝。然后，将动物置于恢复室中1小时。
3. 再次将动物置于手术区，并去除CCA的瞬时结扎，以确保脑血流完全恢复。
4. 缝合伤口，并将动物置于37°C的恢复室中1小时以从麻醉中恢复。恢复后，将小鼠放回温度受控室的笼子里。
5. 通过在笼子地板上的小培养皿中加入湿的食物颗粒和水凝胶来照顾动物，直到手术后的第3天。
6. 手术后每12小时注射一次镇痛药3天（4mg / kg卡洛芬和0.1mg / kg丁丙诺啡）。

6. 神经评分

1. 始终在一天中的同一时间进行神经评分，并使用手术服在单个外科医生之间保持"中性气味"。
2. 在测试之前，让小鼠在带有"开放"笼子的房间里休息30分钟。
3. 观察 表1 和 表2 中的每个项目30秒。

7. 心内灌注

1. 准备一个含有磷酸盐缓冲盐水（PBS）-肝素（2 U / mL）的20 mL注射器，并将其放置在工作台上方1 m处，以促进重力驱动灌注。（可选:使用20 mL注射器进行4%多聚甲醛（PFA）的心内灌注，其中PBS中含有4%PFA，pH 7.4）。
2. 腹膜注射100μL氯胺酮和木拉嗪（分别为120和16mg / kg体重）。等待5分钟，确认停止自发的身体运动和振动。
3. 将动物固定在仰卧位，并用70%乙醇消毒腹部体表。
4. 在腹部做一个3厘米长的切口;切开横膈膜、肋骨和胸骨，使心脏完全可视化。
5. 在右心房做一个小切口，将灌注套管插入左心室。
6. 用 20 mL PBS-肝素补液。
7. 灌注后，将动物斩首并取出大脑。
8. 将大脑冷冻在干冰粉上，储存在-80°C直至进一步使用。

8. 梗死容量试验

1. 对于冷冻切片，使用低温恒温器将大脑切成每400μm一次的20μm厚切片。将切片放在载玻片上，并将载玻片储存在-80°C直至使用。
2. 甲酚紫（CV）染色
   1. 通过搅拌并将0.5gCV醋酸盐在500mL H₂O中加热（60°C）直到晶体溶解来制备染色溶液。溶液冷却后，将其存放在深色瓶子中。每次使用前重新加热至60°C并过滤。
   2. 让载玻片在室温下干燥30分钟。将它们浸入95%乙醇中15分钟，在70%乙醇中浸泡1分钟，然后在50%乙醇中浸泡1分钟。
   3. 将载玻片浸入蒸馏水中2分钟;刷新蒸馏水，将载玻片放入水中1分钟。之后，将载玻片浸入预热的染色溶液中，在60°C下浸泡10分钟。 在蒸馏水中洗涤载玻片两次1分钟。
   4. 将载玻片浸入95%乙醇中2分钟。将它们置于100%乙醇中5分钟;刷新100%乙醇，并将载玻片再次置于乙醇中2分钟。之后，用安装介质盖住载玻片。
   5. 分析（图4C）
      1. 扫描载玻片，并使用斯旺森方法¹² 分析间接梗死体积，以使用以下等式纠正水肿:
         （缺血区） = （缺血区）-（（同侧半球）-（对侧半球））

结果

这里描述的模型是对常用的"灯丝"行程模型的修改，该模型包括通过ECA引入硅涂层灯丝以暂时阻断MCA的起源（图1）。去除细丝后，只有ECA中的血流永久停止，允许CCA和ICA完全再通。这允许对大脑进行充分的再灌注（图2），类似于在人类患者中成功进行药物溶栓或机械血栓切除术后观察到的情况。此外，这项工作还描述了一种在闭塞和再灌注过程中测量...

讨论

本方案描述了一种实验性卒中模型，该模型基于德国多中心研究联盟（"ImmunoStroke"）的共识协议，以建立标准化的瞬态MCAo模型。通过将硅涂层灯丝通过ECA引入MCA的起源而建立的瞬态MCAo模型是使用最广泛的卒中模型之一，用于在限定的闭塞期后实现动脉再灌注。因此，此过程可以被视为与翻译相关的笔画模型。

与前面描述的其他卒中模型相比，视频中介绍的"灯丝模型"具有一?...

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
45° ramp	H&S Kunststofftechnik		height: 18 cm
5/0 threat	Pearsalls	10C103000
5 mL Syringe	Braun
Acetic Acid	Sigma Life Science	695092
Anesthesia system for isoflurane	Drager
Bepanthen pomade	Bayer
C57Bl/6J mice	Charles River	000664
Clamp	FST	12500-12
Clip	FST	18055-04
Clip holder	FST	18057-14
Cotons	NOBA Verbondmitel Danz	974116
Cresyl violet	Sigma Life Science	C5042-10G
Cryostat	Thermo Scientific CryoStarNX70
Ethanol 70%	CLN Chemikalien Laborbedorf	521005
Ethanol 96%	CLN Chemikalien Laborbedorf	522078
Ethanol 99%	CLN Chemikalien Laborbedorf	ETO-5000-99-1
Filaments	Doccol	602112PK5Re
Fine 45 angled forceps	FST	11251-35
Fine forceps	FST	11252-23
Fine Scissors	FST	14094-11
Glue	Orechseln	BSI-112
Hardener Glue	Drechseln & Mehr	BSI-151
Heating blanket	FHC DC Temperature Controller
Isoflurane	Abbot	B506
Isopentane	Fluka	59070
Ketamine	Inresa Arzneimittel GmbH
Laser Doppler	Perimed	PF 5010 LDPM, Periflux System 5000
Laser Doppler probe	Perimed	91-00123
Phosphate Buffered Saline pH: 7.4	Apotheke Innestadt Uni Munchen	P32799
Recovery chamber	Mediheat
Roti-Histokit mounting medium	Roth	6638.1
Saline solution	Braun	131321
Scalpel	Feather	02.001.30.011
Silicon-coated filaments	Doccol	602112PK5Re
Stereomicropscope	Leica	M80
Superfrost Plus Slides	Thermo Scientific	J1800AMNZ
Vannas Spring Scissors	FST	15000-00
Xylacine	Albrecht