Modélisation de l’AVC chez la souris: occlusion transitoire de l’artère cérébrale moyenne via l’artère carotide externe

Résumé

Différents modèles d’occlusion de l’artère cérébrale moyenne (MCAo) sont utilisés dans la recherche expérimentale sur les accidents vasculaires cérébraux. Ici, un modèle expérimental d’AVC de MCAo transitoire via l’artère carotide externe (ECA) est décrit, qui vise à imiter l’AVC humain, dans lequel le thrombus cérébrovasculaire est enlevé en raison d’une lyse spontanée du caillot ou d’un traitement.

Résumé

L’AVC est la troisième cause de mortalité la plus fréquente et la principale cause d’invalidité acquise chez les adultes dans les pays développés. À ce jour, les options thérapeutiques sont limitées à une petite proportion de patients victimes d’un AVC dans les premières heures suivant l’AVC. De nouvelles stratégies thérapeutiques sont largement étudiées, en particulier pour prolonger la fenêtre de temps thérapeutique. Ces recherches actuelles comprennent l’étude d’importantes voies physiopathologiques après un AVC, telles que l’inflammation post-AVC, l’angiogenèse, la plasticité neuronale et la régénération. Au cours de la dernière décennie, les groupes de recherche indépendants se sont de plus en plus préoccupés par la faible reproductibilité des résultats expérimentaux et des résultats scientifiques. Pour surmonter la soi-disant « crise de la réplication », des modèles standardisés détaillés pour toutes les procédures sont nécessaires de toute urgence. Dans le cadre d’un effort au sein du consortium de recherche « ImmunoStroke » (https://immunostroke.de/), un modèle murin standardisé d’occlusion transitoire de l’artère cérébrale moyenne (MCAo) est proposé. Ce modèle permet la restauration complète du flux sanguin lors de l’élimination du filament, simulant la lyse thérapeutique ou spontanée des caillots qui se produit dans une grande proportion des accidents vasculaires cérébraux humains. La procédure chirurgicale de ce modèle d’AVC « filament » et les outils pour son analyse fonctionnelle sont présentés dans la vidéo d’accompagnement.

Introduction

L’AVC est l’une des causes les plus fréquentes de décès et d’invalidité dans le monde. Bien qu’il existe principalement deux formes distinctes d’AVC, ischémique et hémorragique, 80 à 85% de tous les cas d’AVC sont ischémiques^1. Actuellement, seuls deux traitements sont disponibles pour les patients victimes d’AVC ischémique : le traitement pharmacologique avec un activateur tissulaire recombinant du plasminogène (rtPA) ou une thrombectomie mécanique. Cependant, en raison de la fenêtre de temps thérapeutique étroite et des multiples critères d’exclusion, seul un nombre restreint de patients peut bénéficier de ces options de traitement spécifiques. Au cours des deux dernières décennies, la recherche préclinique et translationnelle sur les AVC s’est concentrée sur l’étude des approches neuroprotectrices. Cependant, tous les composés qui ont atteint les essais cliniques n’ont jusqu’à présent montré aucune amélioration pour le patient².

Étant donné que les modèles in vitro ne peuvent pas reproduire avec précision toutes les interactions cérébrales et les mécanismes physiopathologiques de l’AVC, les modèles animaux sont cruciaux pour la recherche préclinique sur l’AVC. Cependant, il n’est pas possible d’imiter tous les aspects de l’AVC ischémique humain dans un seul modèle animal, car l’AVC ischémique est une maladie très complexe et hétérogène. Pour cette raison, différents modèles d’AVC ischémiques ont été développés au fil du temps chez différentes espèces. La photothrommbose des artérioles cérébrales ou l’occlusion distale permanente de l’artère cérébrale moyenne (ACM) sont des modèles couramment utilisés qui induisent de petites lésions définies localement dans le néocortex^3,4. En plus de ceux-ci, le modèle de course le plus couramment utilisé est probablement le soi-disant « modèle de filament », dans lequel une occlusion transitoire de MCA est obtenue. Ce modèle consiste en une introduction transitoire d’un filament de suture à l’origine du MCA, conduisant à une réduction brutale du flux sanguin cérébral et à un infarctus important subséquent des régions cérébrales sous-corticales et corticales⁵. Bien que la plupart des modèles d’AVC imitent les occlusions MCA ^6,le « modèle de filament » permet une délimitation précise du temps ischémique. La reperfusion par élimination de filament imite le scénario clinique humain de restauration du flux sanguin cérébral après une lyse spontanée ou thérapeutique (rtPA ou thrombectomie mécanique). À ce jour, différentes modifications de ce « modèle de filament » ont été décrites. Dans l’approche la plus courante, décrite pour la première fois par Longa et al. en 1989⁵, un filament revêtu de silicium est introduit via l’artère carotide commune (CCA) à l’origine du MCA^7. Bien qu’il s’agisse d’une approche largement utilisée, ce modèle ne permet pas une restauration complète du flux sanguin pendant la reperfusion, car le CCA est ligaturé de manière permanente après l’élimination du filament.

Au cours de la dernière décennie, un nombre croissant de groupes de recherche se sont intéressés à la modélisation de l’AVC chez la souris à l’aide de ce « modèle de filament ». Cependant, la variabilité considérable de ce modèle et le manque de normalisation des procédures sont quelques-unes des raisons de la grande variabilité et de la faible reproductibilité des résultats expérimentaux et des découvertes scientifiques rapportés jusqu’à présent^2,8. Une cause potentielle de la « crise de réplication » actuelle, en référence à la faible reproductibilité entre les laboratoires de recherche, est les volumes d’infarctus d’AVC non comparables entre les groupes de recherche utilisant la même méthodologie expérimentale⁹. En fait, après avoir mené la première étude préclinique randomisée contrôlée multicentrique¹⁰, nous avons pu confirmer que le manque de normalisation suffisante de ce modèle expérimental d’AVC et des paramètres de résultat ultérieurs étaient les principales raisons de l’échec de la reproductibilité dans les études précliniques entre laboratoires indépendants¹¹ . Ces différences drastiques dans les tailles d’infarctus qui en résultent, malgré l’utilisation du même modèle d’AVC, constituent à juste titre une menace non seulement pour la recherche de confirmation, mais aussi pour les collaborations scientifiques en raison du manque de modèles robustes et reproductibles.

À la lumière de ces défis, nous avons cherché à développer et à décrire en détail la procédure d’un modèle MCAo transitoire standardisé tel qu’utilisé pour les efforts de recherche collaboratifs au sein du consortium de recherche « ImmunoStroke » (https://immunostroke.de/). Ce consortium vise à comprendre les interactions cerveau-immunité qui sous-tendent les principes mécanistes de la récupération après un AVC. En outre, des méthodes histologiques et fonctionnelles connexes pour l’analyse des résultats de l’AVC sont présentées. Toutes les méthodes sont basées sur des procédures opérationnelles normalisées établies utilisées dans tous les laboratoires de recherche du consortium ImmunoStroke.

Protocole

Les expériences rapportées dans cette vidéo ont été menées conformément aux directives nationales pour l’utilisation d’animaux de laboratoire, et les protocoles ont été approuvés par les comités gouvernementaux allemands (Regierung von Oberbayern, Munich, Allemagne). Des souris mâles C57Bl/6J âgées de dix semaines ont été utilisées et logées sous température contrôlée (22 ± 2 °C), avec une période de cycle lumière-obscurité de 12 h et un accès ad libitum aux aliments et à l’eau en granulés.

1. Préparation du matériel et des instruments

1. Connectez la couverture chauffante pour maintenir la température de la zone d’opération et la température corporelle de la souris pendant l’anesthésie à 37 ° C.
2. Ciseaux et pinces autoclaves, préparez une solution d’éthanol à 70% et gardez à disposition une pommade pour les yeux au dexpanthénol, plusieurs morceaux de coton et une suture en polyester tressé enduit 5-0 prêt à l’emploi. Préparez une seringue de 1 mL avec une solution saline à 0,9 % (sans aiguille) pour garder le site d’incision de l’animal hydraté. Préparer le gaz d’anesthésie (100% O₂ + isoflurane).
3. Préparez un support pour la sonde laser Doppler en coupant l’extrémité d’une pointe de pipette de 10 μL (longueur de 3 à 5 mm).
   REMARQUE: Tous les instruments sont stérilisés à l’aide d’un stérilisateur à billes chaudes. Les surfaces sont également désinfectées avant et après la chirurgie avec un spray désinfectant microbien. Avant la chirurgie, les zones entourant la tête et la poitrine des souris sont désinfectées avec un spray de désinfection des plaies.

2. Préparation du laser Doppler

1. Injecter l’analgésie à la souris 30 minutes avant la chirurgie (4 mg/kg de carprofène et 0,1 mg/kg de buprénorphine, par voie intrapéritonéale).
2. Anesthésiez la souris en la plaçant dans la chambre d’induction avec un débit d’isoflurane de 4% jusqu’à l’arrêt des mouvements spontanés du corps et des vibrisses.
3. Placez la souris en position couchée dans la zone d’opération avec son nez dans le masque d’anesthésie. Maintenez la concentration d’isoflurane à 4% pendant une autre minute, puis réduisez-la et maintenez-la à 2%.
4. Réglez le coussin chauffant à rétroaction contrôlée associé pour maintenir la température corporelle de la souris à 37 ° C et insérez doucement la sonde rectale pour surveiller la température tout au long des interventions chirurgicales.
5. Appliquez la pommade pour les yeux au dexpanthénol sur les deux yeux.
6. Désinfectez la peau et les cheveux entourant l’œil et l’oreille gauches avec de l’éthanol à 70%.
7. Coupez le cuir chevelu entre l’oreille gauche et l’œil (1 cm de long) pour exposer l’os du crâne.
8. Coupez et retirez le muscle temporal pour visualiser le MCA sous le crâne.
9. Fixez avec de la colle la partie extérieure de la pointe en tenant la sonde / fibre Doppler laser sur le dessus du MCA gauche avec de la colle. Ensuite, collez la peau pour fermer la plaie autour du porte-pointe. Appliquez 2-3 gouttes de colle durcisseuse pour accélérer le processus. Assurez-vous que la fibre laser Doppler n’est pas collée et peut être facilement retirée du porte-embout à tout moment.

3. Modèle MCAo transitoire (occlusion)

1. Tournez la souris en position couchée. Mettez le museau dans le cône d’anesthésie et fixez les pattes avec du ruban adhésif.
2. Désinfectez la peau et les cheveux entourant la poitrine et faites une incision médiane de 2 cm de long dans le cou.
3. Utilisez une pince pour séparer la peau et les glandes sous-maxillaires. Utilisez des rétracteurs pour maintenir le muscle sternomastoïde, exposer le champ chirurgical et trouver l’artère carotide commune gauche (ACC). Disséquez le CCA libre du tissu conjonctif et des nerfs environnants (sans endommager le nerf vagal) et effectuez une ligature transitoire avant la bifurcation.
4. Disséquez l’artère carotide externe (ECA) et nouez un nœud permanent à la partie visible la plus distale. Placez une autre suture sous l’ECA, près de la bifurcation, et préparez un nœud lâche à utiliser plus tard.
5. Disséquez l’artère carotide interne (ICA) et placez-y un clip microvasculaire, à 5 mm au-dessus de la bifurcation. Assurez-vous de ne pas endommager le nerf vagal.
6. Couper un petit trou dans l’ECA entre les ligatures serrées et lâches; veillez à ne pas couper toute la COUR.
7. Introduisez le filament et avancez-le vers le CCA. Resserrez la ligature lâche dans l’ECA autour de la lumière pour fixer rapidement le filament dans cette position et éviter les saignements lors du retrait du clip microvasculaire.
8. Retirez le clip microvasculaire et insérez le filament à travers l’ICA jusqu’à ce que l’origine du MCA soit atteinte en détectant une forte réduction (>80%) du flux sanguin cérébral mesurée par le laser Doppler. Fixez le filament dans cette position en resserrant davantage le nœud autour de l’ECA.
   REMARQUE: Lorsque le filament va dans la direction appropriée, il avance en douceur et aucune résistance ne doit être observée.
9. Enregistrez les valeurs Doppler laser avant et après l’insertion du filament.
10. Retirez l’enrouleur et déplacez le muscle sternomastoïde et les glandes sous-maxillaires avant de suturer la plaie. Retirez la sonde laser Doppler et placez l’animal dans une chambre de récupération à 37 °C pendant 1 h (jusqu’à l’élimination du filament).

4. Modèle MCAo transitoire (Reperfusion)

1. Anesthésiez la souris en la plaçant dans la chambre d’induction avec un débit d’isoflurane de 4% jusqu’à l’arrêt des mouvements spontanés du corps et des vibrisses.
2. Appliquez la pommade pour les yeux au dexpanthénol sur les deux yeux.
3. Placez la souris en position couchée dans la zone d’opération avec son museau dans le masque d’anesthésie. Maintenez la concentration d’isoflurane à 4% pendant une autre minute, puis réduisez-la et maintenez-la à 2%. Fixez les pattes de l’animal avec du ruban adhésif.
4. Insérez la sonde laser Doppler dans le support de la sonde.
5. Retirez la suture de la plaie, utilisez une pince pour séparer la peau et les glandes sous-maxillaires. Utilisez des rétracteurs pour tirer doucement le muscle sternomastoïde et exposer le champ chirurgical.
6. Desserrez la suture ECA qui resserre le filament et tirez doucement le filament. Évitez d’endommager le revêtement silicone-caoutchouc du filament pendant le retrait.
7. Attachez fermement la suture ECA.
8. Confirmer l’augmentation du flux sanguin cérébral dans le dispositif laser Doppler (>80% de la valeur initiale avant reperfusion).
9. Enregistrez les valeurs Doppler laser avant et après le retrait du filament.
10. Ouvrez la ligature transitoire avant la bifurcation du CCA.
11. Retirez l’enrouleur et déplacez le muscle sternomastoïde et les glandes sous-maxillaires avant de suturer la plaie. Placer l’animal dans une chambre de récupération à 37 °C pendant 1 h pour récupérer de l’anesthésie.
12. Après la récupération, retournez les souris dans leurs cages dans une pièce à température contrôlée.
13. Prenez soin des animaux en ajoutant des granulés de nourriture humide et de l’hydrogel dans de petites boîtes de Pétri sur le sol de la cage jusqu’au jour 3 après la chirurgie.
14. Injecter une analgésie toutes les 12 h pendant 3 jours après la chirurgie (4 mg/kg de carprofène et 0,1 mg/kg de buprénorphine).

5. Opération simulée

1. Effectuer toutes les procédures décrites ci-dessus, y compris la ligature des artères et l’introduction du filament (étapes 1-3.7).
2. Retirez le filament immédiatement après son insertion. Ensuite, placez l’animal dans la chambre de récupération pendant 1 h.
3. Placez à nouveau l’animal dans la zone d’opération et retirez la ligature transitoire du CCA pour assurer une restauration complète du flux sanguin cérébral.
4. Suturez la plaie et placez l’animal dans une chambre de récupération à 37 °C pendant 1 h pour récupérer de l’anesthésie. Après la récupération, retournez les souris dans leurs cages dans une pièce à température contrôlée.
5. Prenez soin des animaux en ajoutant des granulés de nourriture humide et de l’hydrogel dans de petites boîtes de Pétri sur le sol de la cage jusqu’au jour 3 après la chirurgie.
6. Injecter une analgésie toutes les 12 h pendant 3 jours après la chirurgie (4 mg/kg de carprofène et 0,1 mg/kg de buprénorphine).

6. Neuroscore

1. Effectuez le Neuroscore toujours à la même heure de la journée et utilisez des vêtements chirurgicaux pour maintenir une « odeur neutre » entre les chirurgiens individuels.
2. Laissez les souris reposer pendant 30 minutes dans la pièce avec une cage « ouverte » avant le test.
3. Observez chaque élément du tableau 1 et du tableau 2 pendant 30 s.

7. Perfusion intracardiaque

1. Préparer une seringue de 20 mL contenant une solution saline tamponnée au phosphate (PBS)-héparine (2 U/mL) et la placer à 1 m au-dessus du banc pour faciliter la perfusion par gravité. (FACULTATIF: Effectuer une perfusion intracardiaque avec 4% de paraformaldéhyde (PFA) à l’aide d’une seringue de 20 mL contenant 4% de PFA dans pbS, pH 7,4).
2. Injecter par voie intrapéritonéale 100 μL de kétamine et de xylazine (120 et 16 mg/kg de poids corporel, respectivement). Attendez 5 min et confirmez l’arrêt des mouvements spontanés du corps et des vibrisses.
3. Fixez l’animal en position couchée et désinfectez la surface abdominale du corps avec de l’éthanol à 70%.
4. Faites une incision de 3 cm de long dans l’abdomen; couper le diaphragme, les côtes et le sternum pour visualiser complètement le cœur.
5. Faites une petite incision dans l’oreillette droite et insérez la canule de perfusion dans le ventricule gauche.
6. Perfuser avec 20 mL de PBS-héparine.
7. Après perfusion, décapiter l’animal et retirer le cerveau.
8. Congeler le cerveau sur de la glace sèche en poudre et conserver à -80 °C jusqu’à une utilisation ultérieure.

8. Volumétrie de l’infarctus

1. Pour la cryosection, utilisez un cryostat pour couper les cerveaux en sections de 20 μm d’épaisseur tous les 400 μm. Placez les sections sur les diapositives et rangez-les à −80 °C jusqu’à ce qu’elles soient utilisées.
2. Coloration au violet crésyl (CV)
   1. Préparer la solution colorante en remuant et en chauffant (60 °C) 0,5 g d’acétate CV dans 500 mL de_H2Ojusqu’à dissolution des cristaux. Une fois la solution refroidie, conservez-la dans une bouteille sombre. Réchauffer à 60 °C et filtrer avant chaque utilisation.
   2. Laissez sécher les lames à température ambiante pendant 30 min. Immergez-les dans de l’éthanol à 95 % pendant 15 min, dans de l’éthanol à 70 % pendant 1 min, puis dans de l’éthanol à 50 % pendant 1 min.
   3. Immerger les toboggans dans de l’eau distillée pendant 2 min; rafraîchir l’eau distillée et placer les toboggans dans l’eau pendant 1 min. Ensuite, immergez les lames dans la solution de coloration préchauffée pendant 10 min à 60 °C. Laver les lames deux fois à l’eau distillée pendant 1 min.
   4. Immerger les lames dans de l’éthanol à 95% pendant 2 min. Placez-les dans de l’éthanol à 100% pendant 5 min; rafraîchir l’éthanol à 100% et replacer les lames dans l’éthanol pendant 2 min. Ensuite, couvrez les diapositives avec un support de montage.
   5. Analyse (Figure 4C)
      1. Scannez les lames et analysez le volume de l’infarctus indirect par la méthode Swanson¹² pour corriger l’œdème à l’aide de l’équation suivante :
         (Aire ischémique) = (région ischémique)-((hémisphère ipsilatéral)-(hémisphère controlatéral))

Résultats

Le modèle décrit ici est une modification du modèle de course « filament » couramment utilisé, qui consiste à introduire un filament recouvert de silicium à travers l’ECA pour bloquer transitoirement l’origine du MCA(Figure 1). Après avoir retiré le filament, seul le flux sanguin dans l’ECA est définitivement arrêté, ce qui permet une recanalisation complète du CCA et de l’ICA. Cela permet une reperfusion adéquate du cerveau(Figure 2),si...

Discussion

Le présent protocole décrit un modèle expérimental d’AVC basé sur l’accord consensuel d’un consortium de recherche multicentrique allemand (« ImmunoStroke ») pour établir un modèle MCAo transitoire standardisé. Le modèle transitoire MCAo établi en introduisant un filament recouvert de silicium à travers l’ECA à l’origine du MCA est l’un des modèles de course les plus largement utilisés pour obtenir une reperfusion artérielle après une période d’occlusion délimitée. Par conséquent, cett...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
45° ramp	H&S Kunststofftechnik		height: 18 cm
5/0 threat	Pearsalls	10C103000
5 mL Syringe	Braun
Acetic Acid	Sigma Life Science	695092
Anesthesia system for isoflurane	Drager
Bepanthen pomade	Bayer
C57Bl/6J mice	Charles River	000664
Clamp	FST	12500-12
Clip	FST	18055-04
Clip holder	FST	18057-14
Cotons	NOBA Verbondmitel Danz	974116
Cresyl violet	Sigma Life Science	C5042-10G
Cryostat	Thermo Scientific CryoStarNX70
Ethanol 70%	CLN Chemikalien Laborbedorf	521005
Ethanol 96%	CLN Chemikalien Laborbedorf	522078
Ethanol 99%	CLN Chemikalien Laborbedorf	ETO-5000-99-1
Filaments	Doccol	602112PK5Re
Fine 45 angled forceps	FST	11251-35
Fine forceps	FST	11252-23
Fine Scissors	FST	14094-11
Glue	Orechseln	BSI-112
Hardener Glue	Drechseln & Mehr	BSI-151
Heating blanket	FHC DC Temperature Controller
Isoflurane	Abbot	B506
Isopentane	Fluka	59070
Ketamine	Inresa Arzneimittel GmbH
Laser Doppler	Perimed	PF 5010 LDPM, Periflux System 5000
Laser Doppler probe	Perimed	91-00123
Phosphate Buffered Saline pH: 7.4	Apotheke Innestadt Uni Munchen	P32799
Recovery chamber	Mediheat
Roti-Histokit mounting medium	Roth	6638.1
Saline solution	Braun	131321
Scalpel	Feather	02.001.30.011
Silicon-coated filaments	Doccol	602112PK5Re
Stereomicropscope	Leica	M80
Superfrost Plus Slides	Thermo Scientific	J1800AMNZ
Vannas Spring Scissors	FST	15000-00
Xylacine	Albrecht