마우스에서 뇌졸중 모델링: 외부 경동맥을 통한 일시적인 중간 뇌동맥 폐색

요약

중간 대뇌 동맥 폐색의 다른 모델 (MCAo) 실험 적인 뇌졸중 연구에 사용 됩니다. 여기서, 외부 경동맥(ECA)을 통한 과도 MCAo의 실험적인 뇌졸중 모델이 기술되며, 이는 자발적인 혈전 용해 또는 치료로 인해 뇌혈관 혈전이 제거되는 인간의 뇌졸중을 모방하는 것을 목표로 한다.

초록

뇌졸중은 사망률의 세 번째 가장 흔한 원인과 선진국에서 성인 장애의 주요 원인입니다. 현재까지 치료 옵션은 뇌졸중 후 첫 번째 시간 이내에 뇌졸중 환자의 작은 비율로 제한됩니다. 새로운 치료 전략은 광범위하게 조사되고있다, 특히 치료 시간 기간을 연장하기 위해. 이러한 현재 조사는 뇌졸중 후 염증, 혈관 신생, 신경 가소성 및 재생과 같은 중요한 병리학적 경로에 대한 연구를 포함합니다. 지난 10 년 동안, 독립적 인 연구 그룹 중 실험 결과 및 과학적 결과의 가난한 재현성에 대한 우려가 증가하고있다. 소위 "복제 위기"를 극복하기 위해서는 모든 절차에 대한 상세한 표준화 모델이 절실히 필요합니다. "면역 스트로크" 연구 컨소시엄(https://immunostroke.de/) 내에서의 노력으로, 일시적인 중형 동맥 폐색(MCAo)의 표준화된 마우스 모델이 제안된다. 이 모델은 필라멘트를 제거하면 혈류를 완전히 복원하여 인간 뇌졸중의 큰 비율로 발생하는 치료 또는 자발적응고 리시스를 시뮬레이션할 수 있습니다. 이 "필라멘트" 뇌졸중 모델및 기능 분석을 위한 도구의 외과 적 절차는 함께 제공되는 비디오에서 입증됩니다.

서문

뇌졸중은 전 세계적으로 사망과 장애의 가장 흔한 원인 중 하나입니다. 뇌졸중, 허혈성 및 출혈의 두 가지 형태가 주로 있지만, 모든 뇌졸중 케이스의 80-85 %는 허혈성^1입니다. 현재, 허혈성 뇌졸중 환자만 사용할 수 있습니다: 재조합 조직 플라스미노겐 활성제 (rtPA) 또는 기계 혈전 절제술을 가진 약리학적 치료. 그러나, 좁은 치료 시간 창 및 다중 배제 기준 때문에, 단지 선택된 수의 환자만이 이러한 특정 치료 옵션으로부터 혜택을 받을 수 있다. 지난 2 년 동안, 전임상 및 번역 뇌졸중 연구는 신경 보호 접근의 연구에 초점을 맞추고있다. 그러나, 임상 시험에 도달한 모든 화합물은 지금까지 환자에 대한 개선이 없음을 보여주었습니다^2.

체외 모델은 뇌졸중의 모든 뇌 상호 작용 및 병리학 적 메커니즘을 정확하게 재현 할 수 없기 때문에 동물 모델은 전임상 뇌졸중 연구에 매우 중요합니다. 그러나, 단일 동물 모형에 있는 인간 허혈성 치기의 모든 양상을 모방하는 것은 허혈성 치기가 매우 복잡하고 이기종질병이기 때문에, 가능하지 않습니다. 이러한 이유로, 다른 허혈성 뇌졸중 모델은 다른 종에서 시간이 지남에 따라 개발되었습니다. 중대뇌동맥의 뇌동맥 또는 영구탈폐의 광혈전증(MCA)은 신피질^3,4에서작고 국소적으로 정의된 병변을 유도하는 일반적으로 사용되는 모델이다. 그 외에, 가장 일반적으로 사용되는 스트로크 모델은 아마도 MCA의 일시적인 폐색이 달성되는 소위 "필라멘트 모델"입니다. 본 모델은 MCA의 기원에 봉합사 필라멘트의 일시적인 도입으로 구성되며, 이는 대뇌 혈류의 급격한 감소와 피코르피질 및 피질 뇌^영역5의 후속 큰 경색으로 이어진다. 대부분의 스트로크 모델은 MCA 오클루전 ^6을모방하지만" "필라멘트 모델"은 허혈성 시간을 정확하게 제한할 수 있습니다. 필라멘트 제거에 의한 재관류는 자발적 또는 치료 후 대뇌 혈류 회복의 인간 임상 시나리오를 모방 (rtPA 또는 기계적 혈전 절제술) 응고 용해. 현재까지 이 "필라멘트 모델"의 다른 수정 사항이 설명되었습니다. 가장 일반적인 접근 방식에서, 먼저 Longa 외에의해 설명 . 1989년^5년,실리콘 코팅 필라멘트는 MCA^7의기원에 대한 일반적인 경동맥(CCA)을 통해 도입된다. 그것은 널리 사용되는 접근이지만, 이 모델은 CCA가 필라멘트를 제거 한 후 영구적으로 결찰되기 때문에 재관류 동안 혈류의 완전한 복원을 허용하지 않습니다.

지난 10 년 동안, 연구 그룹의 증가 수는이 "필라멘트 모델"을 사용하여 마우스에서 뇌졸중모델링에 관심이있다. 그러나, 이 모델의 상당한 가변성과 절차의 표준화의 부족은 지금까지 보고된 실험 결과 및 과학적 결과의 높은 가변성과 불량한 재현성에 대한 이유 중^{일부이며, 지금까지}보고된 과학적 연구 결과는^2,8이다. 연구 실험실 중 낮은 재현성을 지칭하는 현재의 "복제 위기"의 잠재적 원인은 동일한 실험 방법론^9를사용하여 연구 그룹 간의 비교할 수 없는 스트로크 경부물이다. 실제로, 제1전 무작위대조멀티센터^{시험연구를}수행한 후, 본 실험적 뇌졸중 모델과 후속 결과 파라미터의 충분한 표준화가 부족한 것이 독립적인 실험실 간의 전임상 연구에서 재현성이 실패한 주된 이유임을 확인할 수^{있었다(11)} . 동일한 스트로크 모델을 사용했음에도 불구하고 이러한 급격한 차이는 검증 연구에 대한 위협뿐만 아니라 견고하고 재현 가능한 모델의 부족으로 인한 과학적 협업에 대한 위협을 정당하게 제기합니다.

이러한 과제에 비추어, 우리는 "면역 스트로크" 연구 컨소시엄(https://immunostroke.de/)의 공동 연구 노력에 사용되는 표준화된 일시적인 MCAo 모델의 절차를 개발하고 설명하는 것을 목표로 했습니다. 이 컨소시엄은 뇌졸중 회복의 기계론 적 원칙의 근간을 이해하는 것을 목표로합니다. 또한, 뇌졸중 결과 분석을 위한 조직학적 및 관련 기능적 방법이 제시된다. 모든 방법은 ImmunoStroke 컨소시엄의 모든 연구 실험실에서 사용되는 확립된 표준 운영 절차를 기반으로 합니다.

프로토콜

이 비디오에서 보고된 실험은 실험 동물의 사용에 대한 국가 지침에 따라 수행되었으며, 의정서는 독일 정부 위원회(독일 뮌헨의 레지에룽 폰 오버바이엔)에 의해 승인되었다. 10주 된 남성 C57Bl/6J 마우스는 12h 광암 사이클 기간과 펠릿 식품 및 물 광고 리비툼에 대한 액세스를 통해 제어 온도(22 ± 2°C)로 사용되고 보관되었습니다.

1. 재료 및 계측기의 준비

1. 37°C에서 마취 시 수술 영역과 마우스 체온의 온도를 유지하기 위해 열 담요를 연결합니다.
2. Autoclave 가위와 집게, 70% 에탄올 용액을 준비하고 사용 가능한 덱스파테놀 눈 연고, 면 여러 조각, 5-0 코팅 된 편조 폴리 에스테르 봉합사를 사용할 수 있습니다. 동물의 절개 부위를 수화하기 위해 0.9% 식염수 용액(바늘 없이)으로 1mL 주사기를 준비합니다. 마취 가스 (100 % O₂ + 이소플루란)를 준비하십시오.
3. 10 μL 파이펫 팁(3-5mm 길이)의 끝을 절단하여 레이저 도플러 프로브에 대한 홀더를 준비합니다.
   참고: 모든 기기는 뜨거운 비드 멸균제를 사용하여 멸균됩니다. 표면은 또한 미생물 소독제 스프레이와 수술 전후에 소독됩니다. 수술 전에, 마우스의 머리와 가슴을 둘러싼 지역은 상처 소독 스프레이로 소독됩니다.

2. 레이저 도플러의 준비

1. 수술 전 30분 전에 마우스에 진통증을 주입하십시오(4 mg/kg 카프로펜과 0,1 mg/kg 부프레노르핀, 인내).
2. 자발적인 신체 운동과 비브리세이의 중단될 때까지 4%의 이소플루란 유량으로 유도 챔버에 마우스를 마취한다.
3. 마취 마스크에 코가 있는 수술 부위에 마우스를 놓습니다. 이소플루란 농도를 또 다른 분 동안 4%로 유지한 다음, 이를 줄이고 2%로 유지합니다.
4. 마우스 체온을 37°C에서 유지하기 위한 관련 피드백 제어 가열 패드를 설정하고, 수술 시술 전반에 걸쳐 온도를 모니터링하기 위해 직장 프로브를 부드럽게 삽입한다.
5. 두 눈에 덱스파테놀 눈 연고를 발라주세요.
6. 왼쪽 눈과 귀를 둘러싼 피부와 머리카락을 70%의 에탄올로 소독합니다.
7. 두개골 뼈를 드러내기 위해 왼쪽 귀와 눈 (1cm 길이) 사이에 두피를 잘라냅니다.
8. 두개골 아래 MCA를 시각화하기 위해 시간근육을 자르고 은퇴하십시오.
9. 접착제로 왼쪽 MCA 위에 레이저 도플러 프로브 / 섬유를 들고 팁의 외부 부분을 접착제로 고정합니다. 그런 다음 피부를 접착제로 덮어 팁 홀더 주변의 상처를 닫습니다. 경화 접착제 2-3 방울을 바르면 공정 속도를 높이게 됩니다. 레이저 도플러 섬유가 접착되지 않고 언제든지 팁 홀더에서 쉽게 제거 할 수 있는지 확인하십시오.

3. 일시적인 MCAo 모델 (폐색)

1. 마우스를 척추 위치로 바꿔 놓습니다. 주전자를 마취 콘에 넣고 테이프로 발을 고정합니다.
2. 가슴을 둘러싼 피부와 머리카락을 소독하고 목에 2cm 길이의 중간 절개를 합니다.
3. 집게를 사용하여 피부와 하황을 분리합니다. 흉골 근육을 잡고 수술 장을 노출하고 왼쪽 일반적인 경동맥 (CCA)을 찾기 위해 re트랙터를 사용합니다. 결합 조직및 주변 신경으로부터 CCA를 해부하고 (골신경신경을 해치지 않고) 양분화 전에 일시적인 결찰을 수행한다.
4. 외부 경동맥(ECA)을 해부하고 가장 단면이 보이는 부분에 영구 매듭을 묶는다. 다른 봉합사를 ECA 아래에 놓고 분기에 가깝게 놓고 나중에 사용할 느슨한 매듭을 준비합니다.
5. 내부 경동맥(ICA)을 해부하고 미세 혈관 클립을 분기 위에 5mm 를 배치합니다. 골갈 신경을 손상시키지 않도록 하십시오.
6. 꽉 와 느슨한 결찰 사이의 ECA에 작은 구멍을 잘라; 전체 ECA를 잘라하지 않도록주의하십시오.
7. 필라멘트를 소개하고 CCA쪽으로 진행하십시오. 루멘 주위의 ECA의 느슨한 결찰을 조여 서 곧 해당 위치에 있는 필라멘트를 고정하고 미세 혈관 클립을 제거할 때 출혈을 피하십시오.
8. 레이저 도플러에 의해 측정된 대뇌 혈류에서 급격한 감소(>80%)를 검출하여 MCA의 기원에 도달할 때까지 마이크로혈관 클립을 제거하고 ICA를 통해 필라멘트를 삽입한다. ECA 주변의 매듭을 더 조여이 위치에서 필라멘트를 수정합니다.
   참고: 필라멘트가 적절한 방향으로 가면 원활하게 진행되며 저항을 관찰해서는 안 됩니다.
9. 필라멘트 삽입 전후의 레이저 도플러 값을 기록합니다.
10. 재반을 제거하고 상처를 봉합하기 전에 흉골 근육과 하수 땀샘을 재배치하십시오. 레이저 도플러 프로브를 제거하고 동물을 37°C에서 1시간 동안 (필라멘트 제거까지)에 놓습니다.

4. 일시적인 MCAo 모델 (재관전)

1. 자발적인 신체 운동과 비브리세이의 중단될 때까지 4%의 이소플루란 유량으로 유도 챔버에 마우스를 마취한다.
2. 두 눈에 덱스파테놀 눈 연고를 발라주세요.
3. 마취 마스크에 주미가 있는 수술 부위에 마우스를 놓습니다. 이소플루란 농도를 또 다른 분 동안 4%로 유지한 다음, 이를 줄이고 2%로 유지합니다. 테이프로 동물의 발을 고정합니다.
4. 레이저 도플러 프로브를 프로브 홀더에 삽입합니다.
5. 상처 봉합사를 제거하고, 집게를 사용하여 피부와 아방선샘을 분리합니다. 방종을 사용하여 흉골 근육을 부드럽게 당기고 수술장을 노출하십시오.
6. 필라멘트를 조여주는 ECA 봉합사를 풀고 필라멘트를 부드럽게 당깁니다. 제거 하는 동안 필라멘트의 실리콘 고무 코팅을 손상 하지 마십시오.
7. ECA 봉합사를 단단히 묶습니다.
8. 레이저 도플러 장치의 대뇌 혈류 증가를 확인합니다(>80% 레퍼퓨전 전 초기 값의).
9. 필라멘트 제거 전후에 레이저 도플러 값을 기록합니다.
10. CCA에서 분기하기 전에 일시적인 결찰을 엽니다.
11. 재트랙터를 제거하고 상처를 봉합하기 전에 흉골 근육과 하반신을 재배치하십시오. 동물을 마취에서 회복하기 위해 1 h에 대해 37 °C의 회복실에 동물을 놓습니다.
12. 복구 후, 온도 조절 실에서 자신의 케이지에 마우스를 반환합니다.
13. 수술 후 3일까지 케이지 바닥에 작은 페트리 접시에 젖은 음식 펠릿과 하이드로겔을 추가하여 동물을 돌봐주세요.
14. 수술 후 3d에 대해 12시간마다 진통증을 주입하십시오(4 mg/kg 카프로펜과 0.1 mg/kg 부프레노르핀).

5. 샴 작업

1. 동맥의 결찰 및 필라멘트의 도입을 포함하여 위에서 설명한 바와 같은 모든 절차를 수행한다(1-3.7단계).
2. 삽입 직후 필라멘트를 제거합니다. 그런 다음 동물을 회복실에 1시간 동안 배치합니다.
3. 동물을 수술 부위에 다시 배치하고 CCA의 일시적인 결단을 제거하여 완전한 대뇌 혈류 회복을 보장합니다.
4. 상처를 봉합하고, 마취로부터 회복하기 위해 1 h에 대한 37 °C에서 복구 챔버에 동물을 배치합니다. 복구 후, 온도 조절 실에서 자신의 케이지에 마우스를 반환합니다.
5. 수술 후 3일까지 케이지 바닥에 작은 페트리 접시에 젖은 음식 펠릿과 하이드로겔을 추가하여 동물을 돌봐주세요.
6. 수술 후 3d에 대해 12시간마다 진통증을 주입하십시오(4 mg/kg 카프로펜과 0.1 mg/kg 부프레노르핀).

6. 신경 점수

1. 항상 하루의 동시에 신경 점수를 수행하고, 개별 외과 의사 사이의 "중립적 인 냄새"를 유지하기 위해 수술복을 사용합니다.
2. 마우스가 시험 전에 "열린" 케이지로 방에서 30분 동안 휴식을 취하게 하십시오.
3. 표 1과 표 2의 각 항목을 30s에 관찰합니다.

7. 심장 내 관류

1. 인산염 완충식식염(PBS)-헤파린(2 U/mL)을 함유한 20mL 주사기를 준비하고 중력 구동 관류를 용이하게 하기 위해 벤치 위에 1m를 배치한다. (선택 사항: PBS, pH 7.4에서 4% PFA를 함유한 20mL 주사기를 사용하여 4% 파라포름알데히드(PFA)로 심내 관류를 수행합니다.
2. 케타민과 자일라진의 100 μL을 내장하여 주입하십시오(각각 120 mg/kg 의 체중). 5 분 기다려야하고 자발적인 신체 운동과 vibrissae의 중단을 확인합니다.
3. 동물을 척추 자세로 고정하고 복부 체면을 70%의 에탄올로 소독합니다.
4. 복부에 3cm 길이의 절개를 하십시오. 다이어프램, 갈비뼈, 흉골을 잘라 심장을 완전히 시각화합니다.
5. 오른쪽 아트리움에 작은 절개를 하고, 좌심실에 관류 캐뉼라를 삽입합니다.
6. PBS 헤파린 20mL로 퍼퓨즈.
7. 수혈 후, 동물을 참수하고 뇌를 제거합니다.
8. 가루 드라이 아이스에 뇌를 동결하고 추가 사용까지 -80 °C에 저장합니다.

8. 경색 볼륨

1. 저온 절제의 경우, 저온을 사용하여 뇌를 400 μm마다 20 μm 두께의 섹션으로 자른다. 슬라이드에 섹션을 놓고 슬라이드를 사용할 때까지 -80 °C에 슬라이드를 저장합니다.
2. 크레실 바이올렛 (CV) 염색
   1. 결정이 용해될 때까지 H_2O의500mL에서 CV 아세테이트 0.5g을 교반 및 가열(60°C) 0.5g의 염색 용액을 준비한다. 용액이 식은 후 어두운 병에 보관하십시오. 60 °C로 다시 가열하고 모든 사용 전에 필터링합니다.
   2. 30 분 동안 실온에서 슬라이드를 건조하게하십시오. 15분 동안 95% 에탄올에 넣고, 70%에탄올로 1분, 50%에탄올에 1분 동안 담가 두어 드시면 1분 동안 에탄올을 넣습니다.
   3. 2 분 동안 증류수에 슬라이드를 담급; 증류수를 새로 고치고 슬라이드를 물에 1분 동안 놓습니다. 그 후, 60°C에서 10분 동안 예열된 스테인딩 용액에 슬라이드를 담급니다. 슬라이드를 증류수로 2회 세척하여 1분 동안 세척합니다.
   4. 슬라이드를 95% 에탄올로 2분 동안 담가 두십시오. 5 분 동안 100 % 에탄올에 놓습니다. 100% 에탄올을 새로 고치고 슬라이드를 에탄올에 다시 2분 동안 놓습니다. 그런 다음 슬라이드를 장착 매체로 덮습니다.
   5. 분석(그림 4C)
      1. 슬라이드를 스캔하고 Swanson^{메서드(12)에} 의해 간접 적인 경색 볼륨을 분석하여 다음 방정식을 사용하여 부종에 대해 수정합니다.
         (허혈 영역) = (허혈성 영역)-((입실 반구)-(반대반구))

결과

여기서 설명된 모델은 일반적으로 사용되는 "필라멘트" 스트로크 모델의 변형으로, 이는 MCA의 기원을 일시적으로 차단하기 위해 ECA를 통해 실리콘 코팅 필라멘트를 도입하는 것으로 구성된다(도1). 필라멘트를 제거한 후, ECA의 혈류만 영구적으로 중단되어 CCA와 ICA의 완전한 재운하화를 허용합니다. 이것은 뇌의 적절한 재관전을 허용(도 2),인간 환자에?...

토론

본 프로토콜은 표준화된 일시적인 MCAo 모델을 확립하기 위해 독일 다중 센터 연구 컨소시엄("ImmunoStroke")의 합의에 기초한 실험스트로크 모델을 설명합니다. MCA의 기원에 ECA를 통해 실리콘 코팅 필라멘트를 도입하여 확립된 과도 MCAo 모델은 폐색 기간 후 동맥 재관전을 달성하기 위해 가장 널리 사용되는 스트로크 모델 중 하나입니다. 따라서 이 절차는 번역관련 스트로크 모델로 간주될 수 있습니?...

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
45° ramp	H&S Kunststofftechnik		height: 18 cm
5/0 threat	Pearsalls	10C103000
5 mL Syringe	Braun
Acetic Acid	Sigma Life Science	695092
Anesthesia system for isoflurane	Drager
Bepanthen pomade	Bayer
C57Bl/6J mice	Charles River	000664
Clamp	FST	12500-12
Clip	FST	18055-04
Clip holder	FST	18057-14
Cotons	NOBA Verbondmitel Danz	974116
Cresyl violet	Sigma Life Science	C5042-10G
Cryostat	Thermo Scientific CryoStarNX70
Ethanol 70%	CLN Chemikalien Laborbedorf	521005
Ethanol 96%	CLN Chemikalien Laborbedorf	522078
Ethanol 99%	CLN Chemikalien Laborbedorf	ETO-5000-99-1
Filaments	Doccol	602112PK5Re
Fine 45 angled forceps	FST	11251-35
Fine forceps	FST	11252-23
Fine Scissors	FST	14094-11
Glue	Orechseln	BSI-112
Hardener Glue	Drechseln & Mehr	BSI-151
Heating blanket	FHC DC Temperature Controller
Isoflurane	Abbot	B506
Isopentane	Fluka	59070
Ketamine	Inresa Arzneimittel GmbH
Laser Doppler	Perimed	PF 5010 LDPM, Periflux System 5000
Laser Doppler probe	Perimed	91-00123
Phosphate Buffered Saline pH: 7.4	Apotheke Innestadt Uni Munchen	P32799
Recovery chamber	Mediheat
Roti-Histokit mounting medium	Roth	6638.1
Saline solution	Braun	131321
Scalpel	Feather	02.001.30.011
Silicon-coated filaments	Doccol	602112PK5Re
Stereomicropscope	Leica	M80
Superfrost Plus Slides	Thermo Scientific	J1800AMNZ
Vannas Spring Scissors	FST	15000-00
Xylacine	Albrecht