Моделирование инсульта у мышей: транзиторная окклюзия средней мозговой артерии через наружную сонную артерию

Резюме

Различные модели окклюзии средней мозговой артерии (MCAo) используются в экспериментальных исследованиях инсульта. Здесь описана экспериментальная модель инсульта транзиторного MCAo через наружную сонную артерию (ECA), целью которой является имитация инсульта человека, при котором цереброваскулярный тромб удаляется из-за спонтанного лизиса сгустка или терапии.

Аннотация

Инсульт является третьей наиболее распространенной причиной смертности и основной причиной приобретенной инвалидности взрослых в развитых странах. На сегодняшний день терапевтические возможности ограничены небольшой долей пациентов с инсультом в течение первых часов после инсульта. Новые терапевтические стратегии широко исследуются, особенно для продления терапевтического временного окна. Эти текущие исследования включают изучение важных патофизиологических путей после инсульта, таких как постинсультное воспаление, ангиогенез, пластичность нейронов и регенерация. В последнее десятилетие растет обеспокоенность по поводу плохой воспроизводимости экспериментальных результатов и научных результатов среди независимых исследовательских групп. Для преодоления так называемого «кризиса репликации» срочно необходимы подробные стандартизированные модели для всех процедур. В рамках исследовательского консорциума «ImmunoStroke» (https://immunostroke.de/) предложена стандартизированная мышиная модель транзиторной окклюзии средней мозговой артерии (MCAo). Эта модель позволяет полностью восстановить кровоток при удалении нити, имитируя терапевтический или спонтанный лизис сгустка, который происходит при значительной части инсультов человека. Хирургическая процедура этой модели инсульта «нити» и инструменты для ее функционального анализа демонстрируются в сопроводительном видео.

Введение

Инсульт является одной из наиболее распространенных причин смерти и инвалидности во всем мире. Хотя существует в основном две различные формы инсульта, ишемическая и геморрагическая, 80-85% всех случаев инсульта являются ишемическими^1. В настоящее время для пациентов с ишемическим инсультом доступны только два метода лечения: фармакологическое лечение активатором рекомбинантного тканевого плазминогена (rtPA) или механическая тромбэктомия. Однако из-за узкого терапевтического временного окна и нескольких критериев исключения только избранное число пациентов может извлечь выгоду из этих конкретных вариантов лечения. За последние два десятилетия доклинические и трансляционные исследования инсульта были сосредоточены на изучении нейропротекторных подходов. Тем не менее, все соединения, которые достигли клинических испытаний, до сих пор не показали никаких улучшений для пациента^2.

Поскольку модели in vitro не могут точно воспроизвести все взаимодействия мозга и патофизиологические механизмы инсульта, животные модели имеют решающее значение для доклинических исследований инсульта. Однако имитация всех аспектов ишемического инсульта человека на одной животной модели невозможна, поскольку ишемический инсульт является очень сложным и гетерогенным заболеванием. По этой причине различные модели ишемического инсульта были разработаны с течением времени у разных видов. Фототромбоз артериол головного мозга или постоянная дистальная окклюзия средней мозговой артерии (MCA) являются широко используемыми моделями, которые индуцируют небольшие и локально определяемые поражения в неокортексе^3,4. Кроме того, наиболее часто используемой моделью инсульта, вероятно, является так называемая «модель нити», в которой достигается преходящая окклюзия MCA. Данная модель состоит из преходящего введения шовной нити к источнику МКА, приводящего к резкому снижению мозгового кровотока и последующему большому инфаркту подкорковой и корковой областей мозга^5. Хотя большинство моделей инсульта имитируют окклюзии MCA ^6,«модель нити» позволяет точно разграничить ишемическое время. Реперфузия путем удаления нити имитирует клинический сценарий восстановления мозгового кровотока человека после спонтанного или терапевтического (rtPA или механическая тромбэктомия) лизиса сгустка. На сегодняшний день описаны различные модификации этой "модели нити накаливания". В наиболее распространенном подходе, впервые описанном Longa et al. в 1989^{году 5}нить с силиконовым покрытием вводится через общую сонную артерию (CCA) к происхождению MCA^7. Хотя это широко используемый подход, эта модель не позволяет полностью восстановить кровоток во время реперфузии, так как ОАС постоянно перевязывается после удаления нити.

За последнее десятилетие все большее число исследовательских групп были заинтересованы в моделировании инсульта у мышей с использованием этой «модели нити». Однако значительная изменчивость этой модели и отсутствие стандартизации процедур являются одними из причин высокой изменчивости и плохой воспроизводимости экспериментальных результатов и научных выводов, о которых сообщалось до сих пор^2,8. Потенциальной причиной нынешнего «кризиса репликации», относящегося к низкой воспроизводимости среди исследовательских лабораторий, являются несопоставимые объемы инфаркта инсульта между исследовательскими группами, использующими одну и ту же экспериментальную методологию^9. Фактически, проведя первое доклиническое рандомизированное контролируемое многоцентровое исследование^10,мы смогли подтвердить, что отсутствие достаточной стандартизации этой экспериментальной модели инсульта и последующих параметров исхода были основными причинами неспособности воспроизводимости в доклинических исследованиях между независимыми лабораториями¹¹ . Эти резкие различия в результирующих размерах инфаркта, несмотря на использование одной и той же модели инсульта, справедливо представляют угрозу не только для подтверждающих исследований, но и для научного сотрудничества из-за отсутствия надежных и воспроизводимых моделей.

В свете этих проблем мы стремились разработать и подробно описать процедуру стандартизированной переходной модели MCAo, используемой для совместных исследований в рамках исследовательского консорциума «ImmunoStroke» (https://immunostroke.de/). Этот консорциум стремится понять мозг-иммунные взаимодействия, лежащие в основе механистических принципов восстановления после инсульта. Кроме того, представлены гистологические и связанные с ними функциональные методы анализа исходов инсульта. Все методы основаны на установленных стандартных операционных процедурах, используемых во всех исследовательских лабораториях консорциума ImmunoStroke.

протокол

Эксперименты, о которых сообщается в этом видео, проводились в соответствии с национальными руководящими принципами использования экспериментальных животных, а протоколы были одобрены немецкими правительственными комитетами (Regierung von Oberbayern, Мюнхен, Германия). Десятинедельные самцы мышей C57Bl/6J использовались и содержались при контролируемой температуре (22 ± 2 ° C), с периодом 12-часового светло-темного цикла и доступом к гранулированной пище и воде ad libitum.

1. Подготовка материала и инструментов

1. Подключите тепловое одеяло для поддержания температуры рабочей зоны и температуры тела мыши во время анестезии при 37 °C.
2. Автоклавные ножницы и щипцы, приготовьте 70% раствор этанола и держите в наличии глазную мазь декспантенола, несколько кусочков хлопка и 5-0 покрытый плетеным полиэфирным швом готовым к использованию. Приготовьте шприц объемом 1 мл с 0,9% физиологическим раствором (без иглы), чтобы сохранить место разреза животного гидратированным. Готовят анестезиологический газ (100% O₂ + изофлуран).
3. Подготовьте держатель для лазерного доплеровского зонда, разрезав наконечник пипетки объемом 10 мкл (длина 3-5 мм).
   ПРИМЕЧАНИЕ: Все инструменты стерилизуются с помощью горячего стерилизатора. Поверхности также дезинфицируются до и после операции с помощью микробного дезинфицирующего спрея. Перед операцией области, окружающие голову и грудь мышей, дезинфицируются спреем для дезинфекции ран.

2. Подготовка лазерного допплера

1. Вводят анальгезию мыши за 30 мин до операции (4 мг/кг карпрофена и 0,1 мг/кг бупренорфина, внутрибрюшинно).
2. Обезболивают мышь, помещая ее в индукционную камеру со скоростью потока изофлунана 4% до прекращения спонтанных движений тела и вибрисс.
3. Поместите мышь в положение лежа в зоне операции носом в анестезиологической маске. Поддерживайте концентрацию изофлурана на уровне 4% в течение еще одной минуты, затем уменьшите ее и сохраните на уровне 2%.
4. Установите соответствующую грелку с обратной связью для поддержания температуры тела мыши на уровне 37 °C и осторожно вставьте ректальный зонд для контроля температуры на протяжении всех хирургических процедур.
5. Нанесите декспантенол глазную мазь на оба глаза.
6. Продезинфицируйте кожу и волосы, окружающие левый глаз и ухо, 70% этанолом.
7. Разрезайте кожу головы между левым ухом и глазом (длиной 1 см), чтобы обнажить кость черепа.
8. Отрежьте и уберите височную мышцу, чтобы визуализировать MCA под черепом.
9. Закрепите клеем внешнюю часть наконечника, удерживая лазерный доплеровский зонд/волокно поверх левого MCA с помощью клея. Затем приклейте кожу, чтобы закрыть рану вокруг держателя наконечника. Нанесите 2-3 капли клея отвердителя для ускорения процесса. Убедитесь, что лазерное допплеровское волокно не склеено и может быть легко удалено из держателя наконечника в любое время.

3. Переходная модель MCAo (окклюзия)

1. Поверните мышь в положение лежа на спине. Вставьте морду в конус анестезии и зафиксируйте лапы скотчем.
2. Продезинфицируйте кожу и волосы, окружающие грудь, и сделайте разрез средней линии длиной 2 см на шее.
3. Используйте щипцы, чтобы раздвинуть кожу и подчелюстные железы. Используйте втягивающие средства, чтобы удерживать грудиномастоидную мышцу, обнажать хирургическое поле и находить левую общую сонную артерию (CCA). Рассекните ККА свободным от соединительной ткани и окружающих нервов (без вреда для блуждающего нерва) и выполните преходящую перевязку перед бифуркацией.
4. Рассекните наружную сонную артерию (ЭКА) и завяжите постоянный узел в самой дистальной видимой части. Поместите еще один шов под ЭКА, близко к бифуркации, и подготовьте свободный узел для последующего использования.
5. Рассекните внутреннюю сонную артерию (ИКА) и поместите на нее микрососудистый клипс, на 5 мм над бифуркацией. Следите за тем, чтобы не повредить блуждающий нерв.
6. Вырежьте небольшое отверстие в ЭКА между плотной и рыхлой лигациями; будьте осторожны, чтобы не сократить всю ЭКА.
7. Введите нить накала и продвигайте ее к ОАС. Затяните свободную перевязку в ЭКА вокруг просвета, чтобы быстро закрепить нить в этом положении и избежать кровотечения при удалении микрососудистого клипса.
8. Удалите микрососудистый зажим и вставьте нить через ICA до тех пор, пока происхождение MCA не будет достигнуто путем обнаружения резкого снижения (>80%) мозгового кровотока, измеренного лазерным допплером. Зафиксируйте нить в этом положении, дополнительно затянув узел вокруг ЭКА.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Когда нить накала идет в соответствующем направлении, она плавно продвигается, и никакого сопротивления не должно наблюдаться.
9. Запись значений лазерной допплерографии до и после введения нити накаливания.
10. Удалите втягивающий нерв и переместите грудиномастоидную мышцу и подчелюстные железы перед наложением швов на рану. Удалите лазерный допплеровский зонд и поместите животное в камеру восстановления при 37 °C на 1 ч (до удаления нити накаливания).

4. Переходная модель MCAo (реперфузия)

1. Обезболивают мышь, помещая ее в индукционную камеру со скоростью потока изофлунана 4% до прекращения спонтанных движений тела и вибрисс.
2. Нанесите декспантенол глазную мазь на оба глаза.
3. Поместите мышь в положение лежа в зоне операции мордой в анестезиологической маске. Поддерживайте концентрацию изофлурана на уровне 4% в течение еще одной минуты, затем уменьшите ее и сохраните на уровне 2%. Зафиксируйте лапы животного скотчем.
4. Вставьте лазерный доплеровский зонд в держатель зонда.
5. Снимите раневой шов, используйте щипцы, чтобы раздвинуть кожу и подчелюстные железы. Используйте втягивающие устройства, чтобы осторожно вытянуть грудино-сосцевидную мышцу и обнажить хирургическое поле.
6. Ослабьте шов ECA, который затягивает нить, и осторожно потяните нить. Избегайте повреждения силиконово-резинового покрытия нити накала во время удаления.
7. Плотно завяжите шов ЭКА.
8. Подтверждают усиление мозгового кровотока в лазерном допплеровском аппарате (>80% от исходного значения перед реперфузией).
9. Запись значений лазерной допплерографии до и после удаления нити.
10. Вскрываем переходную перевязку перед бифуркацией от ОАС.
11. Удалите втягивающее устройство и переместите грудиномастоидную мышцу и подчелюстные железы перед наложением швов на рану. Поместите животное в восстановительную камеру при 37 °C в течение 1 ч, чтобы восстановиться после анестезии.
12. После выздоровления верните мышей в клетки в комнату с контролируемой температурой.
13. Позаботьтесь о животных, добавив гранулы влажного корма и гидрогель в небольшие чашки Петри на полу клетки до 3-го дня после операции.
14. Вводят анальгезию каждые 12 ч в течение 3 сут после операции (4 мг/кг карпрофена и 0,1 мг/кг бупренорфина).

5. Фиктивная операция

1. Выполните все процедуры, как описано выше, включая перевязку артерий и введение нити накаливания (этапы 1-3.7).
2. Удалите нить накала сразу после ее введения. Затем поместите животное в восстановительную камеру на 1 ч.
3. Поместите животное в зону операции снова и удалите преходящую перевязку CCA, чтобы обеспечить полное восстановление мозгового кровотока.
4. Зашить рану и поместить животное в восстановительную камеру при 37 °C в течение 1 ч, чтобы восстановиться после анестезии. После выздоровления верните мышей в клетки в комнату с контролируемой температурой.
5. Позаботьтесь о животных, добавив гранулы влажного корма и гидрогель в небольшие чашки Петри на полу клетки до 3-го дня после операции.
6. Вводят анальгезию каждые 12 ч в течение 3 сут после операции (4 мг/кг карпрофена и 0,1 мг/кг бупренорфина).

6. Нейрооценка

1. Выполняйте Neuroscore всегда в одно и то же время суток и используйте хирургическую одежду для поддержания «нейтрального запаха» между отдельными хирургами.
2. Дайте мышам отдохнуть в течение 30 минут в комнате с «открытой» клеткой перед тестом.
3. Наблюдайте за каждым элементом в Таблице 1 и Таблице 2 в течение 30 с.

7. Внутрисердечная перфузия

1. Подготовьте шприц объемом 20 мл, содержащий фосфатно-буферный физиологический раствор (PBS)-гепарин (2 ЕД/мл), и поместите его на 1 м над стендом, чтобы облегчить гравитационную перфузию. (НЕОБЯЗАТЕЛЬНО: Выполните внутрисердечную перфузию с 4% параформальдегидом (PFA) с использованием шприца 20 мл, содержащего 4% PFA в PBS, рН 7,4).
2. Вводят интрперитонеально 100 мкл кетамина и ксилазина (120 и 16 мг/кг массы тела соответственно). Подождите 5 мин и подтвердите прекращение спонтанных движений тела и вибрисс.
3. Зафиксируйте животное в положении лежа на спине, и продезинфицируйте поверхность брюшного тела 70% этанолом.
4. Сделайте 3-сантиметровый разрез в живот; разрезать диафрагму, ребра и грудину, чтобы полностью визуализировать сердце.
5. Сделайте небольшой разрез в правом предсердии и вставьте перфузионную канюлю в левый желудочек.
6. Перфуз с 20 мл PBS-гепарина.
7. После перфузии обезглавить животное и удалить мозг.
8. Заморозьте мозг на порошкообразном сухом льду и храните при -80 °C до дальнейшего использования.

8. Объем инфаркта

1. Для криосекции используйте криостат, чтобы разрезать мозг на участки толщиной 20 мкм каждые 400 мкм. Поместите секции на слайды и храните слайды при температуре −80 °C до использования.
2. Окрашивание крезиловой фиалкой (CV)
   1. Готовят окрашивающий раствор путем перемешивания и нагревания (60 °C) 0,5 г CV ацетата в 500 мл_H2Oдо растворения кристаллов. После того, как раствор остынет, храните его в темном флаконе. Разогревайте до 60 °C и фильтруйте перед каждым использованием.
   2. Дайте горкам высохнуть при комнатной температуре в течение 30 минут. Погружают их в 95% этанол на 15 мин, в 70% этанол на 1 мин, а затем в 50% этанол на 1 мин.
   3. Погрузить горки в дистиллированную воду на 2 мин; освежите дистиллированную воду и поместите горки в воду на 1 мин. После этого погрузите слайды в предварительно нагретый раствор для окрашивания на 10 мин при 60 °C. Дважды промойте горки в дистиллированной воде в течение 1 мин.
   4. Погрузите слайды в 95% этанол на 2 мин. Поместите их в 100% этанол на 5 мин; освежите 100% этанол и снова поместите слайды в этанол на 2 мин. После этого накройте слайды монтажным носителем.
   5. Анализ (Рисунок 4C)
      1. Отсканируйте слайды и проанализируйте объем непрямого инфаркта методом¹² Суонсона, чтобы исправить отек с помощью следующего уравнения:
         (Ишемическая область) = (ишемическая область)-((ипсилатеральное полушарие)-(контралатеральное полушарие))

Результаты

Модель, описанная здесь, является модификацией широко используемой модели штриха «нити», которая состоит из введения нити накаливания с силиконовым покрытием через ECA для временного блокирования происхождения MCA(рисунок 1). После удаления нити накала только кровоток в ?...

Обсуждение

Настоящий протокол описывает экспериментальную модель инсульта, основанную на консенсусном соглашении немецкого многоцентрового исследовательского консорциума («ImmunoStroke») о создании стандартизированной переходной модели MCAo. Переходная модель MCAo, созданная путем введения нити с сил...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
45° ramp	H&S Kunststofftechnik		height: 18 cm
5/0 threat	Pearsalls	10C103000
5 mL Syringe	Braun
Acetic Acid	Sigma Life Science	695092
Anesthesia system for isoflurane	Drager
Bepanthen pomade	Bayer
C57Bl/6J mice	Charles River	000664
Clamp	FST	12500-12
Clip	FST	18055-04
Clip holder	FST	18057-14
Cotons	NOBA Verbondmitel Danz	974116
Cresyl violet	Sigma Life Science	C5042-10G
Cryostat	Thermo Scientific CryoStarNX70
Ethanol 70%	CLN Chemikalien Laborbedorf	521005
Ethanol 96%	CLN Chemikalien Laborbedorf	522078
Ethanol 99%	CLN Chemikalien Laborbedorf	ETO-5000-99-1
Filaments	Doccol	602112PK5Re
Fine 45 angled forceps	FST	11251-35
Fine forceps	FST	11252-23
Fine Scissors	FST	14094-11
Glue	Orechseln	BSI-112
Hardener Glue	Drechseln & Mehr	BSI-151
Heating blanket	FHC DC Temperature Controller
Isoflurane	Abbot	B506
Isopentane	Fluka	59070
Ketamine	Inresa Arzneimittel GmbH
Laser Doppler	Perimed	PF 5010 LDPM, Periflux System 5000
Laser Doppler probe	Perimed	91-00123
Phosphate Buffered Saline pH: 7.4	Apotheke Innestadt Uni Munchen	P32799
Recovery chamber	Mediheat
Roti-Histokit mounting medium	Roth	6638.1
Saline solution	Braun	131321
Scalpel	Feather	02.001.30.011
Silicon-coated filaments	Doccol	602112PK5Re
Stereomicropscope	Leica	M80
Superfrost Plus Slides	Thermo Scientific	J1800AMNZ
Vannas Spring Scissors	FST	15000-00
Xylacine	Albrecht