שבץ דוגמנות בעכברים: אומת עורק מוחי אמצעי חולף דרך העורק הראשי החיצוני

Summary

מודלים שונים של אומת עורק המוח האמצעי (MCAo) משמשים במחקר שבץ ניסיוני. כאן, מודל שבץ ניסיוני של MCAo חולף דרך העורק הראשי החיצוני (ECA) מתואר, שמטרתו לחקות שבץ אנושי, שבו פקקת המוח מוסרת עקב תמוגה קריש ספונטני או טיפול.

Abstract

שבץ מוחי הוא הגורם השלישי בשכיחותו לתמותה והגורם המוביל לנכות בוגרת שנרכשה במדינות המפותחות. עד כה, אפשרויות טיפוליות מוגבלות לחלק קטן של חולי שבץ בשעות הראשונות לאחר השבץ. אסטרטגיות טיפוליות חדשניות נחקרות בהרחבה, במיוחד כדי להאריך את חלון הזמן הטיפולי. חקירות נוכחיות אלה כוללות את המחקר של מסלולים פתופיציולוגיים חשובים לאחר שבץ, כגון דלקת לאחר שבץ, אנגיוגנזה, פלסטיות עצבית, והתחדשות. בעשור האחרון גובר החשש מפני שכפול לקוי של תוצאות ניסוי וממצאים מדעיים בקרב קבוצות מחקר עצמאיות. כדי להתגבר על מה שמכונה "משבר השכפול", יש צורך דחוף במודלים סטנדרטיים מפורטים לכל ההליכים. כמאמץ בתוך קונסורציום המחקר "ImmunoStroke" (https://immunostroke.de/), מוצע מודל עכבר סטנדרטי של נעילת עורק המוח האמצעי החולף (MCAo). מודל זה מאפשר שחזור מלא של זרימת הדם עם הסרת חוט, המדמה את תמוגת קריש הדם הטיפולית או הספונטנית המתרחשת בחלק גדול של שבץ אנושי. ההליך הכירורגי של מודל שבץ "חוט" זה וכלים לניתוח הפונקציונלי שלו מוצגים בסרטון המצורף.

Introduction

שבץ מוחי הוא אחד הגורמים השכיחים ביותר למוות ונכות ברחבי העולם. למרות שיש בעיקר שתי צורות שונות של שבץ, איסכמי ודימומי, 80-85% מכלל מקרי השבץ הם איסכמיים¹. נכון לעכשיו, רק שני טיפולים זמינים עבור חולים עם שבץ איסכמי: טיפול תרופתי עם מפעיל פלסמינוגן רקמה רקומביננטי (rtPA) או פקקת מכנית. עם זאת, בשל חלון הזמן הטיפולי הצר וקריטריוני אי הכללה מרובים, רק מספר נבחר של חולים יכולים ליהנות מאפשרויות טיפול ספציפיות אלה. במהלך שני העשורים האחרונים, מחקר שבץ פרה-אקליני ותרגום התמקד בחקר גישות נוירו-הגנתיות. עם זאת, כל התרכובות שהגיעו לניסויים קליניים לא הראו עד כה שיפורים עבור המטופל².

מכיוון שמודלים במבחנה אינם יכולים לשחזר במדויק את כל האינטראקציות במוח ומנגנונים פתולוגיים של שבץ, מודלים של בעלי חיים חיוניים למחקר שבץ פרה-אקליני. עם זאת, חיקוי כל ההיבטים של שבץ איסכמי אנושי במודל של חיה אחת אינו ריאלי, שכן שבץ איסכמי הוא מחלה מורכבת והטרוגנית מאוד. מסיבה זו, מודלים שונים של שבץ איסכמי פותחו לאורך זמן במינים שונים. פוטוטרומבוזיס של עורקים מוחיים או חסם דיסטלי קבוע של העורק המוחי האמצעי (MCA) הם מודלים נפוצים הגורמים נגעים קטנים ומוגדרים באופן מקומי בנאוקורטקס^3,4. מלבד אלה, מודל השבץ הנפוץ ביותר הוא כנראה מה שנקרא "מודל חוט", שבו מושגת אוסם חולף של MCA. מודל זה מורכב מהקדמה חולפת של חוט תפירה למקור ה- MCA, מה שמוביל לירידה פתאומית של זרימת הדם במוח ולאוטם הגדול הבא של אזורי מוח תת-קורטיקליים וקליפתיים⁵. למרות שרוב דגמי השבץ מחקים את החסימות של MCA ⁶, "מודל הסיב" מאפשר תיחום מדויק של הזמן האיסכמי. רפרפוזיה על ידי הסרת חוט מחקה את התרחיש הקליני האנושי של שחזור זרימת הדם המוחי לאחר ספונטני או טיפולי (rtPA או פקקת מכנית) תמיסת קריש. עד כה תוארו שינויים שונים של "מודל חוט" זה. בגישה הנפוצה ביותר, שתואר לראשונה על ידי לונגה ואח'. בשנת 1989^5,חוט מצופה סיליקון מוצג דרך העורק הראשי המשותף (CCA) למקורו של MCA⁷. למרות שזו גישה נפוצה, מודל זה אינו מאפשר שיקום מלא של זרימת הדם במהלך reperfusion, כמו CCA הוא קשור לצמיתות לאחר הסרת חוט.

בעשור האחרון, מספר גדל והולך של קבוצות מחקר התעניינו בדוגמנות שבץ בעכברים באמצעות "מודל חוט" זה. עם זאת, השונות ניכרת של מודל זה וחוסר התקינה של ההליכים הם חלק מהסיבות לשונות גבוהה ולשחזור לקוי של תוצאות הניסוי והממצאים המדעיים שדווחו עד כה^2,8. גורם פוטנציאלי ל"משבר השכפול" הנוכחי, בהתייחסו להתרבות הנמוכה בקרב מעבדות המחקר, הוא נפחי אוטם השבץ הלא-דומים בין קבוצות מחקר המשתמשות באותה מתודולוגיה ניסיונית⁹. למעשה, לאחר ביצוע הראשון אקראי אקראי מבוקר ניסוי מחקר^{multicenter 10}, הצלחנו לאשר כי חוסר סטנדרטיזציה מספקת של מודל שבץ ניסיוני זה ואת הפרמטרים התוצאה הבאים היו הסיבות העיקריות לכישלון רבייה במחקרים פרה קליניים בין מעבדות עצמאיות¹¹ . הבדלים דרסטיים אלה בגדלים האוטם הנובעים מכך, למרות השימוש באותו מודל שבץ, מהווים בצדק לא רק איום על מחקר מאשר, אלא גם על שיתופי פעולה מדעיים בשל היעדר מודלים חזקים וניתן לשחזור.

לאור אתגרים אלה, אנו שואפים לפתח ולתאר בפירוט את ההליך למודל MCAo ארעי סטנדרטי המשמש למאמצי המחקר השיתופיים בתוך קונסורציום המחקר "ImmunoStroke" (https://immunostroke.de/). קונסורציום זה נועד להבין את האינטראקציות בין המוח לחיסון שבבסיס העקרונות המכניסטיים של התאוששות שבץ. בנוסף, מוצגות שיטות היסתולוגיות ופונקציונליות הקשורות לניתוח תוצאות שבץ. כל השיטות מבוססות על נהלי הפעלה סטנדרטיים שנקבעו המשמשים בכל מעבדות המחקר של קונסורציום ImmunoStroke.

Protocol

הניסויים שדווחו בסרטון זה נערכו בעקבות ההנחיות הלאומיות לשימוש בבעלי חיים ניסיוניים, והפרוטוקולים אושרו על ידי הוועדות הממשלתיות הגרמניות (Regierung von Oberbayern, מינכן, גרמניה). עכברי C57Bl/6J זכרים בני עשרה שבועות שימשו ושוכנו בטמפרטורה מבוקרת (22 ± 2 מעלות צלזיוס), עם תקופת מחזור של 12 שעות בהירות-כהה וגישה למזון גלולה ומים עד ליביטום.

1. הכנת החומר והמכשירים

1. חבר את שמיכת החום כדי לשמור על הטמפרטורה של אזור הניתוח ואת טמפרטורת גוף העכבר במהלך הרדמה ב 37 °C (50 °F).
2. אוטומטית מספריים ומלקחיים, להכין 70% פתרון אתנול ולשמור על משחת עיניים dexpanthenol זמין, כמה חתיכות כותנה, 5-0 מצופה פוליאסטר תפר מוכן לשימוש. הכן מזרק 1 מ"ל עם תמיסת מלח 0.9% (ללא מחט) כדי לשמור על אתר ההסתה של החיה hydrated. הכן את גז ההרדמה (100% O₂ + איזופלוריין).
3. הכן מחזיק עבור גשושית דופלר לייזר על ידי חיתוך הקצה של קצה צינור 10 μL (3-5 מ"מ אורך).
   הערה: כל המכשירים מעוקרים באמצעות מחטא חרוזים חם. משטחים מחוטאים גם לפני ואחרי הניתוח עם תרסיס חיטוי מיקרוביאלי. לפני הניתוח, האזורים המקיפים את הראש והחזה של עכברים מחוטאים בתרסיס חיטוי פצעים.

2. הכנת דופלר הלייזר

1. הזרקת מפרך לבער 30 דקות לפני הניתוח (4 מ"ג/ק"ג קרפפן ו-0,1 מ"ג/ק"ג בופרנורפין, תוך-פריטון).
2. להרגיז את העכבר על ידי הצבתו בתא האינדוקציה עם קצב זרימת איזופלוראן של 4% עד להפסקת תנועת הגוף הספונטנית והוויבריס.
3. מניחים את העכבר במצב נוטה באזור הניתוח עם האף שלו במסכת ההרדמה. לשמור על ריכוז איזופלוראן ב 4% במשך דקה נוספת, ולאחר מכן להפחית אותו ולשמור אותו ב 2%.
4. הגדר את כרית החימום המשויכת לשליטת משוב לשמירה על טמפרטורת גוף העכבר ב-37 °C (70 °F), והכנס בעדינות את הבדיקה רקטלית כדי לפקח על הטמפרטורה לאורך כל ההליכים הכירורגיים.
5. יש למרוח משחת עיניים של דקסנתנול על שתי העיניים.
6. לחטא את העור והשיער המקיפים את העין והאוזן השמאלית עם 70% אתנול.
7. חותכים את הקרקפת בין האוזן השמאלית לעין (באורך 1 ס"מ) כדי לחשוף את עצם הגולגולת.
8. לחתוך ולפרוש את שריר הזמן כדי לדמיין את MCA מתחת לגולגולת.
9. תקן עם הדבק את החלק החיצוני של הקצה מחזיק את לייזר דופלר בדיקה / סיבים על גבי MCA שמאל עם דבק. לאחר מכן, להדביק את העור כדי לסגור את הפצע סביב מחזיק הקצה. יש למרוח 2-3 טיפות של דבק מתקשה כדי להאיץ את התהליך. ודא כי סיבי דופלר לייזר אינו מודבק וניתן להסיר בקלות מבעל הקצה בכל עת.

3. מודל MCAo חולף (אוסיפה)

1. הפוך את העכבר לתנוחה על-ביתית. שים את החוטם לתוך חרוט ההרדמה ולתקן את כפות עם קלטת.
2. לחטא את העור והשיער המקיפים את החזה ולבצע חבטה בקו האמצע באורך 2 ס"מ בצוואר.
3. השתמש במלקחיים כדי למשוך את העור ואת הבלוטות submandibular לגזרים. השתמש מפסקים להחזיק את שריר sternomastoid, לחשוף את השדה הכירורגי ולמצוא את העורק הראשי המשותף השמאלי (CCA). לנתח את CCA ללא רקמת חיבור והעצבים שמסביב (מבלי לפגוע בעצב vagal) ולבצע קשירה חולפת לפני bifurcation.
4. לנתח את העורק הראשי החיצוני (ECA) ולקשור קשר קבוע בחלק הנראה ביותר דיסטלי. מניחים תפר נוסף מתחת ל- ECA, קרוב לביפורציה, והכנו קשר רופף לשימוש מאוחר יותר.
5. לנתח את העורק הראשי הפנימי (ICA) ולהניח קליפ מיקרו וסקולרי על זה, 5 מ"מ מעל bifurcation. הקפד לא לפגוע בעצב הוואגל.
6. חותכים חור קטן לתוך ECA בין קשירה הדוקה ורופפת; תיזהר לא לחתוך את כל ECA.
7. הציגו את חוט ההסתה וקדמותו לכיוון ה- CCA. הדק את הקשירה הרופפת ב- ECA סביב הלומן כדי לאבטח בקרוב את חוט התנוחה במצב זה ולהימנע מדימום בעת הסרת קליפ המיקרו-וסקולרי.
8. הסר את קליפ microvascular ולהכניס את חוט דרך ICA עד המקור של MCA הוא הגיע על ידי זיהוי ירידה חדה (>80%) בזרימת הדם המוחי כפי שנמדד על ידי דופלר לייזר. תקן את חוט במצב זה על ידי הידוק נוסף של הקשר סביב ECA.
   הערה: כאשר חוט הולך לכיוון המתאים, הוא מתקדם בצורה חלקה, ואין לצפות בהתנגדות.
9. הקלט ערכי דופלר לייזר לפני ואחרי הכנסת חוט.
10. הסר את המפסק ולהעביר את השריר sternomastoid ואת בלוטות submandibular לפני תפירת הפצע. הסר את גשושית דופלר לייזר, ומניחים את החיה בתא התאוששות ב 37 °C (1 שעה (עד להסרת חוט).

4. דגם MCAo חולף (רפרפוזיה)

1. להרגיז את העכבר על ידי הצבתו בתא האינדוקציה עם קצב זרימת איזופלוראן של 4% עד להפסקת תנועת הגוף הספונטנית והוויבריס.
2. יש למרוח משחת עיניים של דקסנתנול על שתי העיניים.
3. מניחים את העכבר במצב נוטה באזור הפעולה עם חוטמו במסכת ההרדמה. לשמור על ריכוז איזופלוראן ב 4% במשך דקה נוספת, ולאחר מכן להפחית אותו ולשמור אותו ב 2%. תקן את כפותיה של החיה עם סרט הדבקה.
4. הכנס את גשושית דופלר הלייזר למחזיק הגשוש.
5. הסר את התפר הפצע, להשתמש במלקחיים כדי למשוך את העור ואת בלוטות submandibular לגזרים. השתמש במפסקים כדי למשוך בעדינות את שריר החזה ולחשוף את השדה הכירורגי.
6. שחררו את תיל ה-ECA המהדק את הסיב, ומושכים בעדינות את חוט ההנעה. הימנע מפגיעה בציפוי גומי הסיליקון של חוט במהלך ההסרה.
7. קשרו היטב את תיל ECA.
8. אשר את העלייה בזרימת הדם המוחית במכשיר דופלר הלייזר (>80% מהערך ההתחלתי לפני reperfusion).
9. הקלט ערכי דופלר לייזר לפני ואחרי הסרת חוט.
10. פתח את קשירת החולף לפני ההסמכה מה- CCA.
11. הסר את המפסק, ולהעביר את השריר סטרנומסטטואיד ואת בלוטות submandibular לפני תפירת הפצע. מניחים את החיה בתא התאוששות ב 37 °C (50 °F) עבור 1 שעה כדי להתאושש מהרדמה.
12. לאחר ההחלמה, החזירו את העכברים לכלובים שלהם בחדר מבוקר טמפרטורה.
13. שמור על בעלי החיים על ידי הוספת כדורי מזון רטוב הידרוג'ל בצלחות פטרי קטנות על רצפת הכלוב עד היום 3 לאחר הניתוח.
14. הזריקו שמן כל 12 שעות ל-3 ד' לאחר הניתוח (4 מ"ג/ק"ג קרפפן ו-0.1 מ"ג/ק"ג בופרנורפין).

5. מבצע מזויף

1. בצע את כל ההליכים כמתואר לעיל, כולל קשירת העורקים והכנסת חוט (שלבים 1-3.7).
2. הסר את חוט מיד לאחר הכנסתו. לאחר מכן, מניחים את החיה בתא ההתאוששות למשך שעה.
3. מניחים את החיה באזור הניתוח שוב, ולהסיר את קשירת ארעית של CCA כדי להבטיח שיקום זרימת דם מוחית מלאה.
4. לתל את הפצע, ולהניח את החיה בתא התאוששות ב 37 °C (50 °F) עבור 1 שעה להתאושש הרדמה. לאחר ההחלמה, החזירו את העכברים לכלובים שלהם בחדר מבוקר טמפרטורה.
5. שמור על בעלי החיים על ידי הוספת כדורי מזון רטוב הידרוג'ל בצלחות פטרי קטנות על רצפת הכלוב עד היום 3 לאחר הניתוח.
6. הזריקו שמן כל 12 שעות ל-3 ד' לאחר הניתוח (4 מ"ג/ק"ג קרפפן ו-0.1 מ"ג/ק"ג בופרנורפין).

6. נוירוסקופ

1. בצע את Neuroscore תמיד באותו זמן של היום, ולהשתמש בבגדים כירורגיים כדי לשמור על "ריח נייטרלי" בין מנתחים בודדים.
2. תן לעכברים לנוח במשך 30 דקות בחדר עם כלוב "פתוח" לפני הבדיקה.
3. שים לב לכל פריט בטבלה 1 ובטבלה 2 במשך 30 s.

7. זלוף תוך-לבבי

1. הכן מזרק 20 מ"ל המכיל תמיסת מלח חוצץ פוספט (PBS)-הפרין (2 U/mL) והנח אותו 1 מ 'מעל הספסל כדי להקל על זלוף מונחה כבידה. (אופציונלי: לבצע זלוף תוך-לבבי עם 4% paraformaldehyde (PFA) באמצעות מזרק 20 מ"ל המכיל 4% PFA ב- PBS, pH 7.4).
2. הזריקו אינtrperitoneally 100 μL של קטמין וקסילאצין (120 ו 16 מ"ג / קילוגרם משקל גוף, בהתאמה). המתן 5 דקות ואשר את הפסקת תנועת הגוף הספונטנית והוויבריס.
3. תקן את החיה בתנוחת עלון, ולחטא את פני השטח של גוף הבטן עם 70% אתנול.
4. הפוך 3 ס"מ ארוך ין לתוך הבטן; חותכים את הסרעפת, הצלעות ודק האשכים כדי לדמיין את הלב לחלוטין.
5. לעשות קיסם קטן באטריום הימני, ולהכניס את צינורית זלוף לתוך החדר השמאלי.
6. לטבול עם 20 מ"ל של PBS-הפרין.
7. לאחר זלוף, לערוף את ראש החיה ולהסיר את המוח.
8. להקפיא את המוח על אבקת קרח יבש ולאחסן ב -80 °C (80 °F) עד לשימוש נוסף.

8. נפח אוטם

1. עבור cryosectioning, להשתמש cryostat לחתוך את המוח לחלקים בעובי 20 מיקרומטר כל 400 מיקרומטר. מקם את המקטעים בשקופיות ואחסן את השקופיות ב- −80 °C (70 °F) עד לשימוש.
2. כתם סגול קרסיל (קורות)
   1. הכן את פתרון הכתמים על ידי ערבוב וחימום (60 °C) 0.5 גרם של אצטט CV ב 500 מ"ל של H₂O עד הגבישים נמסים. לאחר שהתמיסה התקררה, יש לאחסן אותו בבקבוק כהה. מחממים ל-60 מעלות ומסננים לפני כל שימוש.
   2. תן לשקופיות להתייבש בטמפרטורת החדר במשך 30 דקות. לטבול אותם 95% אתנול במשך 15 דקות, ב 70% אתנול במשך 1 דקות, ולאחר מכן ב 50% אתנול במשך 1 דקות.
   3. לטבול את המגלשות במים מזוקקים במשך 2 דקות; לרענן את המים המזוקקים ולהניח את המגלשות במים במשך 1 דקות. לאחר מכן, לטבול את השקופיות בתמיסת כתמים מחומם מראש במשך 10 דקות ב 60 °C (70 °F). לשטוף את המגלשות פעמיים במים מזוקקים במשך 1 דקות.
   4. לטבול את השקופיות ב 95% אתנול במשך 2 דקות. מניחים אותם ב 100% אתנול במשך 5 דקות; לרענן את 100% אתנול ומניחים את השקופיות שוב באתנול במשך 2 דקות. לאחר מכן, לכסות את השקופיות עם מדיום הרכבה.
   5. ניתוח (איור 4C)
      1. סרוק את השקופיות וניתח את אמצעי האחסון העקיף של האוטם בשיטת סוונסון¹² כדי לתקן בצקת באמצעות המשוואה הבאה:
         (אזור איסכמי) = (אזור איסכמי)-((חצי הכדור ipsilateral)-(חצי הכדור contralateral))

תוצאות

המודל המתואר כאן הוא שינוי של מודל שבץ "חוט" נפוץ, אשר מורכב החדרת חוט מצופה סיליקון דרך ECA כדי לחסום באופן חולף את מקורו של MCA (איור 1). לאחר הסרת חוט, רק זרימת הדם ב- ECA נפסקת לצמיתות, ומאפשרת recanalization מלא של CCA ו- ICA. זה מאפשר reperfusion נאות של המוח (איור 2), בדומה למצב ש?...

Discussion

הפרוטוקול הנוכחי מתאר מודל שבץ ניסיוני המבוסס על הסכם הקונצנזוס של קונסורציום מחקר רב מרכזי גרמני ("ImmunoStroke") כדי להקים מודל MCAo ארעי סטנדרטי. מודל MCAo החולף שהוקם על ידי החדרת חוט מצופה סיליקון דרך ECA למקור ה- MCA הוא אחד מדגמי השבץ הנפוצים ביותר להשגת רפרופוזיה עורקית לאחר תקופת חסימה מופרדת. ל...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
45° ramp	H&S Kunststofftechnik		height: 18 cm
5/0 threat	Pearsalls	10C103000
5 mL Syringe	Braun
Acetic Acid	Sigma Life Science	695092
Anesthesia system for isoflurane	Drager
Bepanthen pomade	Bayer
C57Bl/6J mice	Charles River	000664
Clamp	FST	12500-12
Clip	FST	18055-04
Clip holder	FST	18057-14
Cotons	NOBA Verbondmitel Danz	974116
Cresyl violet	Sigma Life Science	C5042-10G
Cryostat	Thermo Scientific CryoStarNX70
Ethanol 70%	CLN Chemikalien Laborbedorf	521005
Ethanol 96%	CLN Chemikalien Laborbedorf	522078
Ethanol 99%	CLN Chemikalien Laborbedorf	ETO-5000-99-1
Filaments	Doccol	602112PK5Re
Fine 45 angled forceps	FST	11251-35
Fine forceps	FST	11252-23
Fine Scissors	FST	14094-11
Glue	Orechseln	BSI-112
Hardener Glue	Drechseln & Mehr	BSI-151
Heating blanket	FHC DC Temperature Controller
Isoflurane	Abbot	B506
Isopentane	Fluka	59070
Ketamine	Inresa Arzneimittel GmbH
Laser Doppler	Perimed	PF 5010 LDPM, Periflux System 5000
Laser Doppler probe	Perimed	91-00123
Phosphate Buffered Saline pH: 7.4	Apotheke Innestadt Uni Munchen	P32799
Recovery chamber	Mediheat
Roti-Histokit mounting medium	Roth	6638.1
Saline solution	Braun	131321
Scalpel	Feather	02.001.30.011
Silicon-coated filaments	Doccol	602112PK5Re
Stereomicropscope	Leica	M80
Superfrost Plus Slides	Thermo Scientific	J1800AMNZ
Vannas Spring Scissors	FST	15000-00
Xylacine	Albrecht