使用膜片钳技术研究线粒体的产热能力

摘要

该方法文章详细介绍了使用膜片钳技术测量穿过线粒体内膜的H ⁺ 泄漏的主要步骤，这是一种研究线粒体产热能力的新方法。

摘要

线粒体产热（也称为线粒体解耦）是增加能量消耗以对抗代谢综合征的最有希望的目标之一。产热组织，如棕色和米色脂肪，发展出高度专业化的线粒体用于产热。主要产生ATP的其他组织的线粒体也将高达25%的总线粒体能量产生转化为热量，因此可以对整个身体的生理学产生相当大的影响。线粒体产热不仅对维持体温至关重要，而且可以防止饮食引起的肥胖并减少活性氧（ROS）的产生，以保护细胞免受氧化损伤。由于线粒体产热是细胞代谢的关键调节剂，因此对这一基本过程的机械理解将有助于开发治疗策略，以对抗与线粒体功能障碍相关的许多病理。重要的是，控制线粒体中产热急性激活的精确分子机制定义不清。这种信息的缺乏主要是由于缺乏直接测量解偶联蛋白的方法。最近应用于线粒体的膜片钳方法的发展首次使在线粒体产热起源的现象，通过IMM泄漏H ⁺ 以及负责它的线粒体转运蛋白的第一次生物物理表征，解偶蛋白1（UCP1），棕色和米色脂肪的特异性以及所有其他组织的ADP / ATP转运蛋白（AAC）的直接研究。这种独特的方法将为控制H ⁺ 泄漏和线粒体产热的机制以及如何靶向对抗代谢综合征提供新的见解。本文描述了应用于线粒体的膜片钳方法，通过直接测量通过IMM的H ⁺ 电流来研究其产热能力。

引言

线粒体以细胞的动力而闻名。事实上，它们是化学能ATP的主要来源。鲜为人知的是，线粒体也会产生热量。事实上，每个线粒体不断产生两种类型的能量（ATP和热量），并且两种能量形式之间的良好平衡定义了代谢细胞稳态（图1）。线粒体如何在ATP和热量之间分配能量当然是生物能量学领域最基本的问题，尽管它在很大程度上仍然是未知的。我们确实知道，增加线粒体产热（称为线粒体产热），从而减少ATP的产生会增加能量消耗，这是对抗代谢综合征的最佳方法之一¹。

线粒体产热起源于穿过线粒体内膜（IMM）的H ⁺ 泄漏，导致底物氧化和ATP合成的解耦，从而产生热量，因此称为"线粒体解耦"¹ （图1）。这种H ⁺ 泄漏取决于称为解偶联蛋白（UCP）的线粒体转运蛋白。UCP1是第一个被识别的UCP。它仅以产热组织，棕色脂肪和米色脂肪表达，其中线粒体专门用于产热^2，3，4。UCP在骨骼肌，心脏和肝脏等非脂肪组织中的身份仍然存在争议。这些组织中的线粒体可使约25%的总线粒体能量转化为热量，这可以显着影响整个身体的生理机能¹.除了保持核心体温外，线粒体产热还通过减少卡路里来预防饮食引起的肥胖。此外，它通过线粒体减少活性氧（ROS）的产生，以保护细胞免受氧化损伤¹。因此，线粒体产热参与正常衰老，年龄相关的退行性疾病和其他涉及氧化应激的疾病，例如缺血再灌注。因此，线粒体产热是细胞代谢的强大调节剂，对这一基本过程的机制理解将促进治疗策略的发展，以对抗与线粒体功能障碍相关的许多病理。

线粒体呼吸是第一个揭示线粒体产热在细胞代谢中的关键作用的技术，并且仍然是社区中最受欢迎的^技术1。该技术基于线粒体电子传递链（ETC）对氧消耗量的测量，当线粒体H +泄漏被激活时，线粒体电子传递链^（ETC）会增加。这种技术虽然是工具性的，但不能直接研究IMM¹上的线粒体H ⁺泄漏，因此很难精确识别和表征负责它的蛋白质，特别是在非脂肪组织中，与ATP产生相比，热量产生是次要的。最近，应用于线粒体的膜片钳技术的发展，首次直接研究了各种组织中整个IMM的H ⁺泄漏^5，6，7。

整个IMM的线粒体膜片钳首先由Kirichok等人以可重复的方式^建立。他们描述了2004年使用来自COS-7细胞系⁸的斜面体首次直接测量线粒体钙单递质细胞（MCU）电流。后来，Kirichok实验室显示来自小鼠⁹和果蝇组织9的IMM^的钙电流。其他实验室现在经常使用这种技术来研究MCU^{10，11，12，13，14}的生物物理特性。对钾和氯化物电导率进行全IMM膜片钳分析也是可能的，并且已经在几篇论文中提到过，但尚未成为出版物^6，7，9的主题。2012年报道了对IMM上H ⁺电流的首次测量，来自小鼠棕色脂肪线粒体⁶，以及2017年小鼠米色脂肪线粒体⁷。该电流是由于产热组织的特异性解偶联蛋白UCP1^6，7。2019年发表的最新研究将AAC描述为负责心脏和骨骼肌等非脂肪组织中线粒体H ⁺泄漏的主要蛋白质⁵。

这种独特的方法现在允许对负责线粒体产热的线粒体离子通道和转运蛋白进行直接的高分辨率功能分析。为了促进该方法的扩展并补充其他研究，例如线粒体呼吸，下面描述了测量UCP1和AAC携带的H ⁺ 电流的详细方案。描述了三个重要步骤:1）从小鼠棕色脂肪中分离线粒体以分析UCP1依赖性H ⁺ 电流和从心脏中分离线粒体以分析AAC依赖性H ⁺ 电流，2）用法国压榨机制备斜面体以机械破裂外线粒体膜（OMM），3）整个IMM上UCP1和AAC依赖性H ⁺ 电流的膜片钳记录。

研究方案

所有进行的动物实验程序都符合美国国立卫生研究院的指导方针，并已获得加州大学洛杉矶分校机构动物护理和使用委员会（IACUC）的批准。

注意:线粒体分离程序基于差异离心，并且因组织而异。例如，由于棕色脂肪组织含有极其丰富的脂质，因此在收获线粒体之前，需要额外的步骤才能将细胞碎片和细胞器从脂质相中分离出来。为避免混淆，下面详细介绍了两种线粒体分离程序（一种来自棕色脂肪，另一种来自心脏）。

1. 从小鼠肩胛间棕色脂肪中分离线粒体（改编自Bertholet等人，2020）¹⁵

1. 根据美国兽医医学协会小组和IACUC委员会的建议，使用CO₂ 窒息和随后的宫颈脱位对C57BL / 6雄性小鼠实施安乐死。
2. 将鼠标的腹部朝向桌子放置后，喷洒酒精以清洁和润湿头发（修改自Mann等人，2014）¹⁶。
3. 用镊子抓住皮肤后，在上背部做一个2厘米的切口。
4. 提取小鼠的棕色肩胛间脂肪，该脂肪对应于具有蝴蝶形状¹⁶的双叶器官。
5. 将棕色脂肪转移到35mm培养皿中，其中装有5mL冷隔离缓冲液（表1），先前放置在冰上。
6. 在双筒望远镜下清洁白色脂肪中的棕色脂肪。
7. 将棕色脂肪转移到带有5 mL冷隔离缓冲液（表1）的10 mL烧杯中，将其切成薄片。转移到冰冷的10 mL玻璃均质机（塑料材料聚四氟乙烯（PTFE）杵）中。
8. 使用顶置搅拌器以275转/分钟的受控速度在冰上均匀预切割的组织，轻轻地冲程六次。
9. 在15mL冰冷的锥形管中以8，500× g 在4°C下离心10分钟。丢弃含有脂质相的上清液。
10. 将沉淀重悬于5 mL冰冷分离缓冲液中（表1），并以275旋转/分钟的速度在冰上以6次缓慢冲程均质化悬浮液。
11. 将匀浆物转移到15mL冰冷的锥形管中，并在4°C下以700× g 离心10分钟以沉淀所有细胞核和未破碎的细胞。
12. 将上清液收集在新鲜的15mL管中并将其放在冰上。
13. 将上清液在4°C下以8，500× g 离心10分钟，以获得含有线粒体的沉淀。
14. 将含有线粒体的沉淀重悬于3.8mL冰冷的高渗甘露醇缓冲液中（表2），并将线粒体悬浮液在冰上孵育10-15分钟。

2.从小鼠心脏中分离线粒体（修改自Garg等人，2019）¹⁷

1. 根据美国兽医医学协会小组和IACUC委员会的建议，使用CO₂ 窒息和随后的宫颈脱位对C57BL / 6雄性小鼠实施安乐死。
2. 将鼠标放在背部后，喷洒酒精以清洁和弄湿头发。然后，用镊子抓住皮肤后，在胸部做一个2厘米的切口。
3. 从动物胸部切除心脏并冲洗，用5 mL冷隔离溶液在10 mL烧杯中除去所有血液（表1）。
4. 一旦心脏清除了微量血液，将其转移到另一个含有5 mL冷隔离缓冲液（表1）的10 mL烧杯中，将其切成薄片。然后，转移到冰冷的10 mL玻璃均质机（PTFE杵）中。
5. 使用顶置搅拌器以275转/分钟的受控速度在冰上均匀预切割的组织，轻轻地冲程六次。
6. 将匀浆转移到15mL冰冷的锥形管中，并在4°C下以700× g 离心10分钟至沉淀细胞核和未破碎的细胞。
7. 将上清液收集在新鲜的15mL管中并将其放在冰上。
8. 将上清液在4°C下以8，500× g 离心10分钟，以获得含有线粒体的沉淀。
9. 将线粒体沉淀重悬于3.8mL冰冷的高渗甘露醇缓冲液中（表2），并将线粒体悬浮液在冰上孵育10-15分钟。

3.用法国压榨机制备斜面体，用于OMM的机械破裂。

注:法国压机程序允许从OMM中释放IMM并保持其完整性，包括矩阵和 crista（图 2）¹⁸。线粒体在高渗甘露醇缓冲液中预孵育（表2），并在法式按压过程中承受较低的压力，以避免OMM破裂时IMM的任何剧烈拉伸。

1. 将线粒体 - 高渗 - 甘露醇悬浮液填充到法国压榨机的冷藏迷你压力池（活塞直径3/8"）中（图3A）。
2. 选择法国压榨机的 Medium 模式，并通过迷你压力池将悬浮液压缩在法国压榨机表盘上的110（对于棕色脂肪线粒体）和140压缩为心脏线粒体（〜2，000 psi）。 确保悬浮液以约1滴/秒的速率从迷你压力池中出来。
3. 将滴剂收集在15 mL冰冷锥形管中。
4. 在4°C下以10，500× g 离心悬浮液10分钟。
5. 将mitoplasts沉淀重悬于0.5-2mL冰冷的高渗KCl缓冲液中（表3），并将悬浮液储存在冰上。
   注意:棕色脂肪和心脏斜面体已准备好进行膜片钳记录，并应保持可用约3-6小时。

4. 通过UCP1和AAC^5，7，15泄漏的H ⁺电生理学记录

注:使用以下电生理学设置（图3B）:具有微分干涉对比度（DIC）的倒置显微镜，60倍水浸物镜，隔振表和法拉第笼，支持低噪声记录的标准放大器，用于电生理学设置的标准数字化仪，pClamp 10，显微操纵器，浴参比电极（3 M KCl-琼脂盐桥插入含有银/氯化银颗粒模制的微电极支架内） 进入支架体（在Liu等人2021中描述）¹⁹，灌注室具有0.13毫米玻璃盖玻片底部，连接到重力馈送灌注系统。

1. 在记录当天使用微量移液器拉动硼硅酸盐玻璃丝。在用于生成具有高度再现性的移液器的拉拔器上设置程序²⁰.
   注:此程序设计需要多次尝试才能获得针对 IMM 膜片钳优化的移液器。标准移液器具有渐进式圆锥形的精细吸头。
2. 在拉拔器内插入一根玻璃丝并拉动，从一根硼硅酸盐丝中获得几乎两个相同的贴片移液器。
3. 当移液器在拉动周期之间由于拉拔器的加热盒灯丝老化而变得不一致时，调整程序。
4. 将移液器放在移液器抛光机内，并将吸头放在100倍放大镜下靠近灯丝附近，以进行火抛光。
5. 按压脚踏板几次以加热灯丝，而不会堵塞或损坏尖端曲线。
6. 抛光，直到在填充基于TMA的移液器溶液（四甲基氢氧化铵的TMA， 表4）时获得电阻在25至35 MΩ之间的移液器。
7. 用0.1%明胶预孵育盖玻片（直径5mm，厚度0.1mm）以减少膜塑胶粘附，并在沉积mittoplast悬浮液之前用KCl浴溶液冲洗它们（表5）。
8. 通过将〜35μL浓缩的斜面体悬浮液与500μLKCl浴溶液（表5）混合来制备原始稀释液，并将其置于先前放置在4孔板孔中的盖玻片上。
9. 在冰上孵育15至20分钟，使膜塑性体沉淀在盖玻片上。
10. 用~50μL的KCl浴液完全填充浴槽（表5）。
11. 使用带有弯曲尖端的薄显微切割镊子在腔内转移带有斜面体的盖玻片。
12. 将盖玻片排列在腔室底部。不要灌注腔室以保持膜塑性粒细胞在盖玻片上的稳定。
13. 通过用60倍物镜在显微镜下扫描盖玻片，选择8形的单个非粘性斜面胶。
14. 将移液器溶液（~50μL）加载移液器，并将其置于移液器支架中。
15. 使用显微操作器将移液器带入浴槽溶液中，并在所选的斜面体上方接近它以接近IMM。放大器程序给出了移液器进入浴液后的电阻。将膜电位保持在0 mV，并使用放大器程序中的膜测试命令施加10 mV脉冲。
16. 施加轻微的负压以使用IMM快速产生千兆级（图2B）。
17. 在连接有膜塑料的情况下抬起移液器，使其远离盖玻片，以避免在实验过程中由于移液器漂移而导致的密封破损。
18. 在测试全膜膜结构之前，使用放大器程序中的"膜测试"命令补偿杂散电容瞬变，以便在磨合后获得正确的电容（Cm）测量。
19. 使用放大器程序施加短持续时间（5-15 ms）电压脉冲（250-600 mV），以破坏玻璃移液器下的膜贴片并实现全膜塑料配置（图2C）。成功的闯入反映在电容瞬变的重新出现上。
20. 闯入后，将电容瞬变与放大器程序的膜测试选项拟合，以评估膜电容（反映斜面体的大小）及其访问电阻Ra（反映全斜面体配置的质量）。磨合后，Ra应介于 40 和 80 MΩ 之间。用于膜片钳实验的Mitoplasts（2-6μm尺寸）通常具有0.5-1.1 pF的膜电容。
21. 闯入后，立即通过开始灌注将KCl浴溶液（表5）替换为HEPES浴溶液（表6）。
22. 应用与放大器程序一起设计的850 ms斜坡协议，从-160 mV到+100 mV，间隔为5 s，同时将mitoplast保持在0 mV。该协议适用于UCP1^6，7，15 和AAC⁵ 研究（图4 和 图5）。
    注意:对于 UCP1 和 AAC 相关的 H⁺ 电流测量，建议在 10 kHz 下采集所有电生理数据，并使用驱动放大器和数字化仪的适当软件以 1 kHz 进行滤波。

结果

应用于线粒体的膜片钳方法的发展首次直接研究了通过IMM和线粒体转运蛋白UCP1和AAC的H ⁺ 泄漏。对UCP1和AAC依赖性H⁺ 泄漏的电生理学分析可以提供线粒体产热能力的第一眼。结果部分描述了通过UCP1和AAC测量H ⁺ 泄漏的标准程序。

与 UCP1 相关的 H⁺ 电流测量（图 4）^6，...

讨论

该方法文章旨在介绍最近应用于线粒体的膜片钳技术，这是一种通过负责线粒体产热的IMM直接研究H ⁺ 泄漏的新方法^{5，6，7，15}。该技术不仅限于组织，还可用于分析不同标准人体和细胞模型（如HAP1，COS7，C2C12和MEF细胞）中IMM的H ⁺ 泄漏和其他电导。然而，每个线粒体分离都需要针对每?...

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.1% gelatin	Millipore	ES-006-B
60X water immersion objective, numerical aperture 1.20	Olympus	UPLSAPO60XW
Axopatch 200B amplifier	Molecular Devices
Borosilicate glass capillaries	Sutter Instruments	BF150-86-10
Digidata 1550B Digitizer	Molecular Devices
Faraday cage	Homemade
French Press	Glen Mills	5500-000011
IKA Eurostar PWR CV S1 laboratory overhead stirrer
Inversed Microscope	Olympus	IX71 or IX73
Micro Forge	(Narishige)	MF-830
Micromanupulator MPC-385	Sutter Instruments	FG-MPC325
Microelectrode holder for agar bridge	World Precision Instruments	MEH3F4515
Micropipette Puller	(Sutter Instruments)	P97
Mini Cell for French Press	Glen Mills	5500-FA-004
MIXER IKA 6-2000RPM	Cole Parmer	EW-50705-50
Objective 100X magnification	Nikon  lens	MPlan 100/0.80 ELWD 210/0
pClamp 10	Molecular Devices
Perfusion chamber	Warner Instruments	RC-24E
Potter-Elvehjem homogenizer 10 ml	Wheaton	358039
Refrigerated centrifuge SORVALL X4R PRO-MD	Thermo Scientific	75 009 521
Small round glass coverslips: 5 mm diameter, 0.1 mm thickness	Warner Instruments	640700
Vibration isolation table	Newport	VIS3036-SG2-325A
Chemicals
D-gluconic acid	Sigma Aldrich	G1951
D-mannitol	Sigma Aldrich	M4125
EGTA	Sigma Aldrich	3777
HEPES	Sigma Aldrich	H7523
KCl	Sigma Aldrich	60128
MgCl2	Sigma Aldrich	63068
sucrose	Sigma Aldrich	S7903
TMA	Sigma Aldrich	331635
TrisBase	Sigma Aldrich	T1503
TrisCl	Sigma Aldrich	T3253