Die Verwendung der Patch-Clamp-Technik zur Untersuchung der thermogenen Kapazität von Mitochondrien

Zusammenfassung

Dieser ^{Methodenartikel} beschreibt die wichtigsten Schritte bei der Messung des H + -Lecks über die innere mitochondriale Membran mit der Patch-Clamp-Technik, einem neuen Ansatz zur Untersuchung der thermogenen Kapazität von Mitochondrien.

Zusammenfassung

Die mitochondriale Thermogenese (auch bekannt als mitochondriale Entkopplung) ist eines der vielversprechendsten Ziele für die Erhöhung des Energieverbrauchs zur Bekämpfung des metabolischen Syndroms. Thermogene Gewebe wie braune und beige Fette entwickeln hochspezialisierte Mitochondrien zur Wärmeerzeugung. Mitochondrien anderer Gewebe, die primär ATP produzieren, wandeln ebenfalls bis zu 25% der gesamten mitochondrialen Energieproduktion in Wärme um und können daher einen erheblichen Einfluss auf die Physiologie des gesamten Körpers haben. Die mitochondriale Thermogenese ist nicht nur für die Aufrechterhaltung der Körpertemperatur unerlässlich, sondern beugt auch ernährungsbedingter Fettleibigkeit vor und reduziert die Produktion von reaktiven Sauerstoffspezies (ROS), um Zellen vor oxidativen Schäden zu schützen. Da die mitochondriale Thermogenese ein Schlüsselregulator des Zellstoffwechsels ist, wird ein mechanistisches Verständnis dieses grundlegenden Prozesses bei der Entwicklung therapeutischer Strategien zur Bekämpfung vieler Pathologien im Zusammenhang mit mitochondrialer Dysfunktion helfen. Wichtig ist, dass die genauen molekularen Mechanismen, die die akute Aktivierung der Thermogenese in Mitochondrien steuern, schlecht definiert sind. Dieser Mangel an Informationen ist weitgehend auf einen Mangel an Methoden zur direkten Messung von entkoppelnden Proteinen zurückzuführen. Die jüngste Entwicklung der Patch-Clamp-Methodik, die auf Mitochondrien angewendet wurde, ermöglichte zum ersten Mal die direkte Untersuchung des Phänomens am Ursprung der mitochondrialen Thermogenese, H + -Leck durch das IMM und die erste biophysikalische Charakterisierung der dafür verantwortlichen mitochondrialen Transporter, des Entkopplungsproteins 1 (UCP1), spezifisch für braune und beige Fette, und des ADP / ^{ATP-Transporters} (AAC) für alle anderen Gewebe. Dieser einzigartige Ansatz wird neue Einblicke in die Mechanismen liefern, die H ^{+ -} Leck und mitochondriale Thermogenese kontrollieren und wie sie zur Bekämpfung des metabolischen Syndroms eingesetzt werden können. Dieses Papier beschreibt die Patch-Clamp-Methodik, die auf Mitochondrien angewendet wird, um ihre thermogene Kapazität durch direkte Messung von H ^{+ -} Strömen durch das IMM zu untersuchen.

Einleitung

Mitochondrien sind berühmt dafür, das Kraftwerk der Zelle zu sein. In der Tat sind sie die wichtigste Quelle chemischer Energie, ATP. Weniger bekannt ist, dass Mitochondrien auch Wärme erzeugen. Tatsächlich erzeugt jedes Mitochondrium ständig die beiden Arten von Energien (ATP und Wärme) und ein feines Gleichgewicht zwischen den beiden Energieformen definiert die metabolische Zellhomöostase (Abbildung 1). Wie Mitochondrien Energie zwischen ATP und Wärme verteilen, ist sicherlich die grundlegendste Frage auf dem Gebiet der Bioenergetik, obwohl sie noch weitgehend unbekannt ist. Wir wissen, dass die Erhöhung der mitochondrialen Wärmeproduktion (mitochondriale Thermogenese genannt) und folglich die Verringerung der ATP-Produktion den Energieverbrauch erhöht, und dies ist eine der besten Möglichkeiten, das metabolische Syndrom zu bekämpfen¹.

Die mitochondriale Thermogenese entsteht durch H+-Leck über die innere mitochondriale Membran (IMM), was zu einer Entkopplung der Substratoxidation und der ^ATP-Synthese mit anschließender Wärmeerzeugung führt, daher der Name "mitochondriale Entkopplung"1 (Abbildung 1^). Dieses H ^{+ -}Leck hängt von mitochondrialen Transportern ab, die als Entkopplungsproteine (UCPs) bezeichnet werden. UCP1 war der erste identifizierte UCP. Es wird nur in thermogenen Geweben, braunem Fett und beigefarbenem Fett exprimiert, in denen Mitochondrien auf die Wärmeerzeugung spezialisiert sind ^2,3,4. Die Identität von UCP in Nicht-Fettgeweben wie Skelettmuskulatur, Herz und Leber ist umstritten geblieben. Mitochondrien in diesen Geweben können etwa 25% der gesamten mitochondrialen Energie in Wärme umgewandelt werden, was die Physiologie des gesamten Körpers erheblich beeinflussen kann¹. Neben der Aufrechterhaltung der Körperkerntemperatur verhindert die mitochondriale Thermogenese auch ernährungsbedingte Fettleibigkeit durch Reduzierung der Kalorien. Darüber hinaus reduziert es die Produktion von reaktiven Sauerstoffspezies (ROS) durch Mitochondrien, um Zellen vor oxidativen Schäden^{zu schützen 1}. So ist die mitochondriale Thermogenese an normalem Altern, altersbedingten degenerativen Erkrankungen und anderen Erkrankungen mit oxidativem Stress wie Ischämie-Reperfusion beteiligt. Daher ist die mitochondriale Thermogenese ein starker Regulator des Zellstoffwechsels, und ein mechanistisches Verständnis dieses grundlegenden Prozesses wird die Entwicklung therapeutischer Strategien zur Bekämpfung vieler Pathologien im Zusammenhang mit mitochondrialer Dysfunktion fördern.

Die mitochondriale Atmung war die erste Technik, die die entscheidende Rolle der mitochondrialen Thermogenese im Zellstoffwechsel aufdeckte und ist immer noch die beliebteste in der Gemeinschaft¹. Diese Technik basiert auf der Messung des Sauerstoffverbrauchs durch die mitochondriale Elektronentransportkette (ETC), die zunimmt, wenn das mitochondriale H^+-Leck aktiviert wird. Diese Technik, obwohl instrumentell, kann nicht direkt mitochondrialen H + -Lecks über das IMM¹ untersuchen, wodurch die genaue Identifizierung und Charakterisierung der dafür verantwortlichen Proteine erschwert wird, insbesondere in Nicht-Fettgeweben, in denen die Wärmeproduktion im Vergleich zur ^{ATP-Produktion} sekundär ist. Vor kurzem lieferte die Entwicklung der Patch-Clamp-Technik, die auf Mitochondrien angewendet wurde, die erste direkte Studie des H ^{+ -}Lecks über das gesamte IMM in verschiedenen Geweben ^5,6,7.

Die mitochondriale Patch-Klemme des gesamten IMM wurde erstmals reproduzierbar von Kirichok et ^al.8 etabliert. Sie beschrieben die erste direkte Messung von mitochondrialen Calcium-Uniporter-Strömen (MCU) im Jahr 2004 mit Mitoplasten aus COS-7-Zelllinien⁸. Später zeigte das Kirichok-Labor Kalziumströme aus IMMs von Maus 9 und Drosophila Gewebe^9. Andere Labore verwenden diese Technik nun routinemäßig, um die biophysikalischen Eigenschaften der MCU ^{10,11,12,13,14} zu untersuchen. Die gesamte IMM-Patch-Clamp-Analyse des Kalium- und Chloridleitwerts ist ebenfalls möglich und wurde in mehreren Artikeln erwähnt, war aber noch nicht das Hauptthema einer Veröffentlichung ^6,7,9. Die erste Messung der H ⁺ -Ströme im gesamten IMM wurde 2012 von Maus-Braunfett-Mitochondrien⁶ und von Maus-Beigefett-Mitochondrien im Jahr 2017⁷ berichtet. Dieser Strom ist auf das spezifische Entkopplungsprotein thermogener Gewebe, UCP1^6,7, zurückzuführen. Jüngste Arbeiten, die 2019 veröffentlicht wurden, charakterisierten AAC als das Hauptprotein, das für das mitochondriale H + -Leck in Nicht-Fettgeweben wie Herz ^{und Skelettmuskulatur verantwortlich ist 5}.

Dieser einzigartige Ansatz ermöglicht nun die direkte hochauflösende Funktionsanalyse der mitochondrialen Ionenkanäle und Transporter, die für die mitochondriale Thermogenese verantwortlich sind. Um die Erweiterung der Methode zu erleichtern und andere Studien wie die mitochondriale Atmung zu ergänzen, wird im Folgenden ein detailliertes Protokoll zur Messung der H ^{+ -}Ströme beschrieben, die von UCP1 und AAC übertragen werden. Drei wichtige Schritte werden beschrieben: 1) mitochondriale Isolierung von braunem Mausfett zur Analyse des UCP1-abhängigen H + -Stroms und der mitochondrialen Isolierung vom Herzen, um den AAC-abhängigen H + -Strom zu analysieren, 2) Vorbereitung von Mitoplasten mit einer französischen Presse für den mechanischen Bruch der äußeren mitochondrialen Membran (^OMM), 3) Patch-Clamp-Aufnahmen von UCP1- und AAC-abhängigen H ^{+ -}Strömen über das gesamte IMM.

Protokoll

Alle durchgeführten Tierversuchsverfahren entsprechen den Richtlinien der National Institutes of Health und wurden vom University of California Los Angeles Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) genehmigt.

HINWEIS: Das mitochondriale Isolationsverfahren basiert auf differentieller Zentrifugation und variiert leicht von Gewebe zu Gewebe. Da beispielsweise braunes Fettgewebe extrem reich an Lipiden ist, ist ein zusätzlicher Schritt erforderlich, um Zelltrümmer und Organellen aus der Lipidphase zu trennen, bevor die Mitochondrien geerntet werden. Um Verwirrung zu vermeiden, werden die beiden mitochondrialen Isolationsverfahren (eines aus dem braunen Fett und das andere aus dem Herzen) im Folgenden beschrieben.

1. Mitochondriale Isolierung von interskapulärem braunem Fett der Maus (modifiziert von Bertholet et al. 2020)¹⁵

1. Euthanasieren Sie die männliche C57BL/6-Maus mit CO 2-Asphyxie und anschließender Zervixdislokation, wie vom American Veterinary Medical Association Panel und dem IACUC-Komitee empfohlen.
2. Nachdem Sie die Maus mit dem Bauch zum Tisch hin positioniert haben, sprühen Sie Alkohol ein, um das Haar zu reinigen und zu benetzen (modifiziert von Mann et al., 2014)¹⁶.
3. Machen Sie einen Schnitt von 2 cm im oberen Rücken, nachdem Sie die Haut mit einer Pinzette greifen.
4. Extrahieren Sie das braune Kreuzblattfett der Maus, das einem zweilappigen Organ mit einer Schmetterlingsform^{entspricht 16}.
5. Das braune Fett in eine 35 mm große Petrischale geben, die mit 5 ml kaltem Isolationspuffer gefüllt war (Tabelle 1), die zuvor auf Eis gelegt wurde.
6. Reinigen Sie das braune Fett vom weißen Fett unter einem Fernglas.
7. Geben Sie das braune Fett in ein 10-ml-Becherglas mit 5 ml kaltem Isolationspuffer (Tabelle 1), um es in dünne Stücke zu schneiden. Auf den eisgekühlten 10 ml Glashomogenisator (Kunststoffmaterial Polytetrafluorethylen (PTFE) Stößel) übertragen.
8. Verwenden Sie einen Überkopfrührer, um das vorgeschnittene Gewebe auf Eis mit sechs sanften Strichen bei einer kontrollierten Geschwindigkeit von 275 Umdrehungen/min zu homogenisieren.
9. Das Homogenat bei 8.500 x g für 10 min bei 4 °C in einem eiskalten 15 ml eiskalten konischen Röhrchen zentrifugieren. Verwerfen Sie den Überstand, der die Lipidphase enthält.
10. Schwebe das Pellet in 5 ml eiskaltem Isolationspuffer (Tabelle 1) und homogenisiere die Suspension auf Eis ein zweites Mal mit sechs langsamen Hüben bei einer Geschwindigkeit von 275 Umdrehungen/min.
11. Übertragen Sie das Homogenat in ein 15 ml eiskaltes konisches Röhrchen und zentrifugieren Sie es bei 700 x g für 10 min bei 4 °C, um alle Kerne und ungebrochenen Zellen zu pelletieren.
12. Sammeln Sie den Überstand in einem frischen 15-ml-Schlauch und legen Sie ihn auf Eis.
13. Zentrifugieren Sie den Überstand bei 8.500 x g für 10 min bei 4 °C, um ein Pellet mit Mitochondrien zu erhalten.
14. Resuspendieren Sie das mitochondrienhaltige Pellet in 3,8 ml eiskaltem hypertonischem Mannitolpuffer (Tabelle 2) und inkubieren Sie die mitochondriale Suspension 10-15 min lang auf Eis.

2. Mitochondriale Isolierung vom Mausherzen (modifiziert von Garg et al. 2019)¹⁷

1. Euthanasieren Sie die männliche C57BL/6-Maus mit CO 2-Asphyxie und anschließender Zervixdislokation, wie vom American Veterinary Medical Association Panel und dem IACUC-Komitee empfohlen.
2. Nachdem Sie die Maus auf dem Rücken positioniert haben, sprühen Sie Alkohol, um das Haar zu reinigen und zu benetzen. Machen Sie dann einen 2 cm langen Schnitt am Thorax, nachdem Sie die Haut mit einer Pinzette erfasst haben.
3. Sezieren Sie das Herz aus der Brust des Tieres und spülen Sie es ab, um das gesamte Blut in einem 10-ml-Becherglas mit 5 ml der kalten Isolationslösung zu entfernen (Tabelle 1).
4. Sobald das Herz von Blutspuren befreit wurde, geben Sie es in ein anderes 10-ml-Becherglas mit 5 ml kaltem Isolationspuffer (Tabelle 1), um es in dünne Stücke zu schneiden. Dann auf einen eisgekühlten 10-ml-Glashomogenisator (PTFE-Stößel) übertragen.
5. Verwenden Sie einen Überkopfrührer, um das vorgeschnittene Gewebe auf Eis mit sechs sanften Strichen bei einer kontrollierten Geschwindigkeit von 275 Umdrehungen/min zu homogenisieren.
6. Überführen Sie das Homogenat in ein 15 ml eiskaltes konisches Rohr und zentrifugieren Sie es bei 700 x g für 10 min bei 4 °C auf Pelletkerne und ungebrochene Zellen.
7. Sammeln Sie den Überstand in einem frischen 15-ml-Schlauch und legen Sie ihn auf Eis.
8. Zentrifugieren Sie den Überstand bei 8.500 x g für 10 min bei 4 °C, um ein Pellet mit Mitochondrien zu erhalten.
9. Resuspendiert das mitochondriale Pellet in 3,8 ml eiskaltem hypertonischem Mannitolpuffer (Tabelle 2) und inkubiert die mitochondriale Suspension auf Eis für 10-15 min.

3. Vorbereitung von Mitoplasten mit einer französischen Presse für den mechanischen Bruch des OMM.

HINWEIS: Das französische Presseverfahren ermöglicht es, das IMM unter Wahrung seiner Integrität aus dem OMM zu entlassen, einschließlich der Matrix und der Crista (Abbildung 2)¹⁸. Mitochondrien werden in einem hypertonen Mannitolpuffer vorinkubiert (Tabelle 2) und während des French Press-Verfahrens einem niedrigeren Druck ausgesetzt, um eine drastische Dehnung des IMM beim Bruch des OMM zu vermeiden.

1. Füllen Sie die mitochondrial-hypertonische Mannitol-Suspension in eine gekühlte Mini-Druckzelle (Kolbendurchmesser 3/8") der französischen Presse (Abbildung 3A).
2. Wählen Sie den Medium-Modus der French Press und komprimieren Sie die Aufhängung durch die Mini-Druckzelle bei 110 auf dem Zifferblatt der French Press für die braunen Fettmitochondrien und bei 140 für die Herzmitochondrien (~ 2.000 psi).  Stellen Sie sicher, dass die Aufhängung mit einer Rate von etwa 1 Tropfen / s aus der Mini-Druckzelle kommt.
3. Sammeln Sie die Tropfen in einem 15 ml eisgekühlten konischen Röhrchen.
4. Zentrifen Sie die Suspension bei 10.500 x g für 10 min bei 4 °C.
5. Resuspendiert das Mitoplastenpellet in 0,5-2 ml eiskaltem Hypertonik-KCl-Puffer (Tabelle 3) und lagert die Suspension auf Eis.
   HINWEIS: Braunes Fett und Herzmitoplasten sind bereit für Patch-Clamp-Aufnahmen und sollten für ca. 3-6 h verwendbar bleiben.

4. Elektrophysiologische Aufzeichnungen von H⁺ Leck durch UCP1 und ^{AAC 5,7,15}

HINWEIS: Verwenden Sie den folgenden elektrophysiologischen Aufbau (Abbildung 3B): inverses Mikroskop mit differentiellem Interferenzkontrast (DIC), 60-faches Wassertauchobjektiv, Schwingungsisolationstisch und Faradayscher Käfig, ein Standardverstärker für rauscharme Aufnahmen, ein Standard-Digitizer für die elektrophysiologische Einrichtung, pClamp 10, ein Mikromanipulator, Badreferenzelektrode (3 M KCl-Agar-Salzbrücke, die in einen Mikroelektrodenhalter eingeführt wird, der ein Silber / Silberchlorid-Pellet enthält, das geformt ist in den Halterkörper (beschrieben in Liu et al. 2021)¹⁹, Perfusionskammer mit einem 0,13 mm großen Glasdeckelboden, verbunden mit einem schwerkraftgespeisten Perfusionssystem.

1. Ziehen Sie die Borosilikatglasfilamente am Tag der Aufnahme mit einem Mikropipettenabzieher ab. Stellen Sie ein Programm auf dem Abzieher ein, der zum Erzeugen von Pipetten mit einem hohen Grad an Reproduzierbarkeit^{verwendet wird 20}.
   HINWEIS: Dieses Programmdesign erfordert mehrere Versuche, um Pipetten zu erhalten, die für die IMM-Patch-Klemme optimiert sind. Eine Standardpipette hat feine Spitzen mit einer progressiven konischen Form.
2. Führen Sie ein Glasfilament in den Abzieher ein und ziehen Sie, um fast zwei identische Patchpipetten aus einem Borosilikatfilament zu erhalten.
3. Passen Sie das Programm an, wenn Pipetten aufgrund der Alterung des Heizkastenfilaments des Abziehers zwischen den Zugzyklen inkonsistent werden.
4. Positionieren Sie die Pipette im Inneren des Pipettenpolierers und platzieren Sie die Spitze in der Nähe des Filaments unter 100-facher Vergrößerung, um sie feuerpolieren.
5. Drücken Sie mehrmals auf das Fußpedal, um das Filament zu erwärmen, ohne die Spitzenkurve zu verstopfen oder zu beschädigen.
6. Polieren, bis Pipetten mit einem Widerstand zwischen 25 und 35 MΩ erhalten werden, wenn sie mit TMA-basierter Pipettenlösung gefüllt werden (TMA für Tetramethylammoniumhydroxid, Tabelle 4).
7. Vorinkubieren Sie Deckgläser (5 mm Durchmesser, 0,1 mm Dicke) mit 0,1% Gelatine, um die Mitoplast-Adhäsion zu reduzieren, und spülen Sie sie mit der KCl-Badelösung (Tabelle 5) ab, bevor Sie die Mitoplast-Suspension abscheiden.
8. Bereiten Sie eine Rohverdünnung vor, indem Sie ~ 35 μL der konzentrierten Mitoplastsuspension mit 500 μL der KCl-Badelösung mischen (Tabelle 5) und legen Sie sie auf Deckgläser, die zuvor in einer Vertiefung einer 4-Well-Platte platziert wurden.
9. 15 bis 20 Minuten auf Eis inkubieren, damit Mitoplasten auf dem Deckglas sedimentieren können.
10. Füllen Sie die Badekammer vollständig mit ~50 μL der KCl-Badelösung (Tabelle 5).
11. Übertragen Sie ein Deckglas mit Mitoplasten innerhalb der Kammer mit einer dünnen Mikrodissektionspinzette mit einer gebogenen Spitze.
12. Ordnen Sie das Deckglas am Boden der Kammer an. Durchbluten Sie die Kammer nicht, um die Mitoplasten auf dem Deckglas stabil zu halten.
13. Wählen Sie einen individuellen nicht klebenden Mitoplast in Form von 8, indem Sie das Deckglas unter dem Mikroskop mit einem 60-fachen Objektiv scannen.
14. Beladen Sie die Pipette mit der Pipettenlösung (~50 μL) und legen Sie sie in den Pipettenhalter.
15. Bringen Sie die Pipette mit einem Mikromanipulator in die Badlösung und nähern Sie sich ihr direkt über dem ausgewählten Mitoplasten, um sich dem IMM zu nähern. Das Verstärkerprogramm gibt den Widerstand der Pipette an, sobald sie sich in der Badlösung befindet. Halten Sie das Membranpotential bei 0 mV und wenden Sie 10 mV-Impulse mit dem Membrantestbefehl im Verstärkerprogramm an.
16. Üben Sie einen leichten Unterdruck aus, um mit dem IMM schnell eine Gigaseal zu erstellen (Abbildung 2B).
17. Heben Sie die Pipette mit dem Mitoplast an, um sie vom Deckglas fernzuhalten, um den Dichtungsbruch aufgrund der Pipettendrift während des Experiments zu vermeiden.
18. Kompensieren Sie die Streukapazitätstransienten mit dem Befehl "Membrantest" im Verstärkerprogramm, bevor Sie die Gesamt-Mitoplast-Konfiguration testen, um nach dem Einbruch eine korrekte Kapazitätsmessung (Cm) für die Mtironenmembran zu erhalten.
19. Wenden Sie kurzzeitige (5-15 ms) Spannungsimpulse (250-600 mV) mit dem Verstärkerprogramm an, um das Membranpflaster unter der Glaspipette zu brechen und die Gesamt-Mitoplast-Konfiguration zu erreichen (Abbildung 2C). Der erfolgreiche Einbruch spiegelt sich im Wiederauftreten von Kapazitätstransienten wider.
20. Passen Sie nach dem Einbruch die Kapazitätstransienten mit der Membrantestoption des Verstärkerprogramms an, um die Membrankapazität (die die Größe des Mitoplasts widerspiegelt) und seinen Zugangswiderstand Ra (der die Qualität der Gesamt-Mitoplast-Konfiguration widerspiegelt) zu beurteilen. Nach dem Einbruch sollte Ra zwischen 40 und 80 MΩ liegen. Mitoplasten (2-6 μm groß), die für Patch-Clamp-Experimente verwendet werden, haben typischerweise Membrankapazitäten von 0,5-1,1 pF.
21. Ersetzen Sie unmittelbar nach dem Einbruch die KCl-Badelösung (Tabelle 5) durch die HEPES-Badelösung (Tabelle 6), indem Sie die Perfusion starten.
22. Wenden Sie ein 850-ms-Rampenprotokoll an, das mit dem Verstärkerprogramm entwickelt wurde, von -160 mV bis +100 mV mit einem Intervall von 5 s, während Sie den Mitoplast bei 0 mV halten. Dieses Protokoll funktioniert für UCP1 ^6,7,15- und AAC ^5-Studien (Abbildung 4 und Abbildung 5).
    HINWEIS: Für UCP1- und AAC-abhängige H⁺ -Strommessungen wird empfohlen, alle elektrophysiologischen Daten bei 10 kHz zu erfassen und bei 1 kHz mit geeigneter Software zu filtern, die den Verstärker und den Digitizer antreibt.

Ergebnisse

Die Entwicklung der Patch-Clamp-Methodik, die auf Mitochondrien angewendet wird, lieferte die erste direkte Untersuchung des H ^{+ -} Lecks durch das IMM und die dafür verantwortlichen mitochondrialen Transporter UCP1 und AAC. Die elektrophysiologische Analyse von UCP1- und AAC-abhängigen H⁺ -Leckagen kann einen ersten Blick auf die thermogene Kapazität von Mitochondrien werfen. Im Abschnitt "Ergebnisse" werden die Standardverfahren zur Messung von H^+- Lecks über UCP1 und AAC beschrieben...

Diskussion

Dieser Methodenartikel zielt darauf ab, die Patch-Clamp-Technik vorzustellen, die kürzlich auf Mitochondrien angewendet wurde, einen neuen Ansatz zur direkten Untersuchung von H ^{+ -}Leck durch das IMM, das für die mitochondriale Thermogenese verantwortlich ist 5,6,7,15. Diese Technik ist nicht auf Gewebe beschränkt und kann auch zur Analyse von H + -Lecks und anderen Leitwerten des...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.1% gelatin	Millipore	ES-006-B
60X water immersion objective, numerical aperture 1.20	Olympus	UPLSAPO60XW
Axopatch 200B amplifier	Molecular Devices
Borosilicate glass capillaries	Sutter Instruments	BF150-86-10
Digidata 1550B Digitizer	Molecular Devices
Faraday cage	Homemade
French Press	Glen Mills	5500-000011
IKA Eurostar PWR CV S1 laboratory overhead stirrer
Inversed Microscope	Olympus	IX71 or IX73
Micro Forge	(Narishige)	MF-830
Micromanupulator MPC-385	Sutter Instruments	FG-MPC325
Microelectrode holder for agar bridge	World Precision Instruments	MEH3F4515
Micropipette Puller	(Sutter Instruments)	P97
Mini Cell for French Press	Glen Mills	5500-FA-004
MIXER IKA 6-2000RPM	Cole Parmer	EW-50705-50
Objective 100X magnification	Nikon  lens	MPlan 100/0.80 ELWD 210/0
pClamp 10	Molecular Devices
Perfusion chamber	Warner Instruments	RC-24E
Potter-Elvehjem homogenizer 10 ml	Wheaton	358039
Refrigerated centrifuge SORVALL X4R PRO-MD	Thermo Scientific	75 009 521
Small round glass coverslips: 5 mm diameter, 0.1 mm thickness	Warner Instruments	640700
Vibration isolation table	Newport	VIS3036-SG2-325A
Chemicals
D-gluconic acid	Sigma Aldrich	G1951
D-mannitol	Sigma Aldrich	M4125
EGTA	Sigma Aldrich	3777
HEPES	Sigma Aldrich	H7523
KCl	Sigma Aldrich	60128
MgCl2	Sigma Aldrich	63068
sucrose	Sigma Aldrich	S7903
TMA	Sigma Aldrich	331635
TrisBase	Sigma Aldrich	T1503
TrisCl	Sigma Aldrich	T3253