השימוש בטכניקת המהדק טלאי כדי לחקור את היכולת התרמוגנית של המיטוכונדריה

Summary

מאמר שיטה זה מפרט את השלבים העיקריים במדידת דליפת H⁺ על פני הממברנה המיטוכונדריאלית הפנימית באמצעות טכניקת הידוק טלאי, גישה חדשה לחקר היכולת התרמוגנית של המיטוכונדריה.

Abstract

תרמוגנזה מיטוכונדריאלית (הידועה גם בשם uncoupling מיטוכונדריאלי) היא אחד היעדים המבטיחים ביותר להגדלת הוצאות האנרגיה כדי להילחם בתסמונת המטבולית. רקמות תרמוגניות כגון שומנים חומים ובז 'מפתחות מיטוכונדריה מיוחדת מאוד לייצור חום. מיטוכונדריה של רקמות אחרות, המייצרות בעיקר ATP, ממירות גם הן עד 25% מכלל ייצור האנרגיה המיטוכונדרית לחום ולכן יכולות להשפיע באופן ניכר על הפיזיולוגיה של הגוף כולו. תרמוגנזה מיטוכונדריאלית לא רק חיונית לשמירה על טמפרטורת הגוף, אלא גם מונעת השמנת יתר הנגרמת על ידי דיאטה ומפחיתה את הייצור של מיני חמצן תגובתי (ROS) כדי להגן על התאים מפני נזק חמצוני. מאחר שתרמוגנזה מיטוכונדריאלית היא מווסת מרכזי של חילוף החומרים התאי, הבנה מכניסטית של תהליך בסיסי זה תסייע בפיתוח אסטרטגיות טיפוליות למאבק בפתולוגיות רבות הקשורות לתפקוד לקוי של המיטוכונדריה. חשוב לציין שהמנגנונים המולקולריים המדויקים השולטים בהפעלה חריפה של תרמוגנזה במיטוכונדריה מוגדרים בצורה גרועה. מחסור זה במידע נובע במידה רבה ממחסור בשיטות למדידה ישירה של חלבונים שאינם מתחברים. ההתפתחות האחרונה של מתודולוגיית מהדקי טלאים המיושמת על המיטוכונדריה אפשרה, לראשונה, את המחקר הישיר של התופעה במקור התרמוגנזה המיטוכונדרית, דליפת H⁺ דרך ה-IMM, ואת האפיון הביופיזי הראשון של מובילי מיטוכונדריה האחראים לכך, את החלבון הלא-משתף פעולה 1 (UCP1), ספציפי לשומנים חומים ובז', ואת טרנספורטר ADP/ATP (AAC) לכל הרקמות האחרות. גישה ייחודית זו תספק תובנות חדשות על המנגנונים השולטים בדליפת H⁺ ובתרמוגנזה מיטוכונדריאלית וכיצד ניתן למקד אותם כדי להילחם בתסמונת המטבולית. מאמר זה מתאר את מתודולוגיית הידוק הטלאים המיושמת על המיטוכונדריה כדי לחקור את היכולת התרמוגנית שלהן על ידי מדידה ישירה של זרמי H⁺ באמצעות ה-IMM.

Introduction

המיטוכונדריה מפורסמים בהיותם תחנת הכוח של התא. ואכן, הם המקור העיקרי לאנרגיה כימית, ATP. מה שפחות ידוע הוא כי המיטוכונדריה גם לייצר חום. למעשה, כל מיטוכונדריה מייצרת כל הזמן את שני סוגי האנרגיות (ATP וחום) ואיזון עדין בין שתי צורות האנרגיה מגדיר הומאוסטזיס של תאים מטבוליים (איור 1). כיצד המיטוכונדריה מפיצה אנרגיה בין ATP לחום היא ללא ספק השאלה הבסיסית ביותר בתחום הביו-אנרגיה, אם כי היא עדיין לא ידועה במידה רבה. אנו כן יודעים שהגדלת ייצור החום המיטוכונדריאלי (הנקראת תרמוגנזה מיטוכונדריאלית), וכתוצאה מכך הפחתת ייצור ה-ATP מגדילה את ההוצאה האנרגטית וזו אחת הדרכים הטובות ביותר להילחם בתסמונת מטבולית¹.

תרמוגנזה מיטוכונדריאלית מקורה בדליפת H⁺ על פני הממברנה המיטוכונדרית הפנימית (IMM), מה שמוביל לניתוק של חמצון המצע וסינתזת ATP עם ייצור כתוצאה מכך של חום, ומכאן השם "uncoupling המיטוכונדריאלי"¹ (איור 1). דליפה זו של H⁺ תלויה במובילים מיטוכונדריאליים הנקראים חלבונים לא משתפים פעולה (UCPs). UCP1 היה ה-UCP הראשון שזוהה. זה בא לידי ביטוי רק ברקמות תרמוגניות, שומן חום, ושומן בז 'שבו המיטוכונדריה מתמחים בייצור חום ^2,3,4. הזהות של UCP ברקמות שאינן שומן כגון שרירי השלד, הלב והכבד, נותרה שנויה במחלוקת. המיטוכונדריה ברקמות אלה יכולה להיות כ -25% מכלל האנרגיה המיטוכונדרית המומרת לחום, אשר יכול להשפיע באופן משמעותי על הפיזיולוגיה של כל הגוף¹. מלבד שמירה על טמפרטורת הגוף הבסיסית, תרמוגנזה מיטוכונדריאלית גם מונעת השמנת יתר הנגרמת על ידי דיאטה על ידי הפחתת קלוריות. בנוסף, הוא מפחית את הייצור של מיני חמצן תגובתי (ROS) על ידי מיטוכונדריה כדי להגן על תאים מפני נזק חמצוני¹. לפיכך, תרמוגנזה מיטוכונדריאלית מעורבת בהזדקנות תקינה, בהפרעות ניווניות הקשורות לגיל ובמצבים אחרים המערבים עקה חמצונית, כגון איסכמיה-רפרפוזיה. לכן, תרמוגנזה מיטוכונדריאלית היא מווסת רב עוצמה של חילוף החומרים התאי, והבנה מכניסטית של תהליך בסיסי זה תקדם את הפיתוח של אסטרטגיות טיפוליות כדי להילחם בפתולוגיות רבות הקשורות לתפקוד לקוי של המיטוכונדריה.

נשימה מיטוכונדריאלית הייתה הטכניקה הראשונה שחשפה את התפקיד המכריע של תרמוגנזה מיטוכונדריאלית בחילוף החומרים התאי והיא עדיין הפופולרית ביותר בקהילה¹. טכניקה זו מבוססת על מדידת צריכת החמצן על ידי שרשרת הובלת האלקטרונים המיטוכונדרית (ETC) הגוברת כאשר מופעלת דליפת H⁺ מיטוכונדריאלית. טכניקה זו, למרות שהיא אינסטרומנטלית, אינה יכולה לחקור באופן ישיר דליפת H⁺ מיטוכונדריאלית על פני IMM¹, ובכך הופכת את הזיהוי והאפיון המדויקים של החלבונים האחראים לכך לקשה, במיוחד ברקמות שאינן שומן שבהן ייצור החום הוא משני בהשוואה לייצור ATP. לאחרונה, הפיתוח של טכניקת הידוק הטלאי המיושמת על המיטוכונדריה, סיפק את המחקר הישיר הראשון של דליפת H⁺ על פני כל ה-IMM ברקמות שונות ^5,6,7.

מהדק הטלאים המיטוכונדריאלי של כל ה-IMM הוקם לראשונה בצורה ניתנת לשחזור על ידי Kirichok et ^al.8. הם תיארו את המדידה הישירה הראשונה של זרמי חד-פורטר סידן מיטוכונדריאלי (MCU) בשנת 2004 באמצעות מיטופלסטים מקווי תאים COS-7⁸. מאוחר יותר, מעבדת קיריצ'וק הראתה זרמי סידן מהודעות מיידיות של רקמות עכבר⁹ ודרוזופילה ⁹. מעבדות אחרות משתמשות כיום באופן שגרתי בטכניקה זו כדי לחקור את התכונות הביופיזיות של MCU 10,11,12,13,14. ניתוח מדבקת IMM שלם של מוליכות אשלגן וכלוריד אפשרי גם הוא והוזכר במספר מאמרים אך עדיין לא היה הנושא העיקרי של פרסום ^6,7,9. המדידה הראשונה של זרמי H⁺ ברחבי ה-IMM דווחה בשנת 2012 ממיטוכונדריה⁶ של שומן חום עכבר, וממיטוכונדריה של שומן בז' בעכבר בשנת 2017⁷. זרם זה נובע מחלבון ה-uncoupling הספציפי של רקמות תרמוגניות, UCP1 ^6,7. עבודות שפורסמו לאחרונה בשנת 2019 אפיינו את AAC כחלבון העיקרי האחראי לדליפת H⁺ מיטוכונדריאלית ברקמות שאינן שומן כגון הלב ושרירי השלד⁵.

גישה ייחודית זו מאפשרת כעת ניתוח פונקציונלי ישיר ברזולוציה גבוהה של תעלות היונים המיטוכונדריה והמובילים האחראים על תרמוגנזה מיטוכונדריאלית. כדי להקל על הרחבת השיטה ולהשלים מחקרים אחרים כגון נשימה מיטוכונדריאלית, מתואר להלן פרוטוקול מפורט למדידת זרמי H⁺ הנישאים על ידי UCP1 ו- AAC. שלושה שלבים חשובים מתוארים: 1) בידוד מיטוכונדריאלי משומן חום עכברי כדי לנתח זרם H⁺ תלוי UCP1 ובידוד מיטוכונדריאלי מהלב כדי לנתח זרם H⁺ תלוי AAC, 2) הכנת מיטופלסטים עם מכבש צרפתי לקרע מכני של הממברנה המיטוכונדרית החיצונית (OMM), 3) הקלטות מהדק טלאי של זרמי UCP1 ו-H⁺ התלויים ב-AAC על פני כל ה-IMM.

Protocol

כל ההליכים הניסוייים בבעלי חיים שבוצעו תואמים את הנחיות המכונים הלאומיים לבריאות ואושרו על ידי הוועדה המוסדית לטיפול ושימוש בבעלי חיים של אוניברסיטת קליפורניה בלוס אנג'לס (IACUC).

הערה: הליך הבידוד המיטוכונדריאלי מבוסס על צנטריפוגה דיפרנציאלית ומשתנה מעט מרקמה לרקמה. לדוגמה, מכיוון שרקמת השומן החום עשירה מאוד בשומנים, היא דורשת צעד נוסף כדי להפריד בין פסולת תאים ואברונים לבין שלב השומנים לפני קצירת המיטוכונדריה. כדי למנוע בלבול, שני הליכי הבידוד המיטוכונדריאליים (אחד מהשומן החום והשני מהלב) מפורטים להלן.

1. בידוד מיטוכונדריאלי משומן חום בין-סקפולרי של עכברים (שונה מ-Bertholet et al. 2020)¹⁵

1. המתת עכבר זכר C57BL/6 באמצעות חנק CO₂ ונקע צוואר הרחם לאחר מכן, כפי שהומלץ על ידי פאנל האיגוד הווטרינרי האמריקאי וועדת IACUC.
2. לאחר מיקום העכבר עם בטנו מול השולחן, יש לרסס אלכוהול כדי לנקות ולהרטיב את השיער (שונה מ- Mann et al., 2014)¹⁶.
3. בצעו חתך של 2 ס"מ בגב העליון לאחר שתפסו את העור בפינצטה.
4. הוציאו את השומן הבין-סקפולרי החום של העכבר המתאים לאיבר בעל שתי אונות עם צורת פרפר¹⁶.
5. מעבירים את השומן החום לצלחת פטרי בקוטר 35 מ"מ במילוי 5 מ"ל של מאגר בידוד קר (טבלה 1) שהונח בעבר על קרח.
6. נקו את השומן החום מהשומן הלבן מתחת למשקפת.
7. מעבירים את השומן החום לכוס של 10 מ"ל עם 5 מ"ל של מאגר בידוד קר (טבלה 1) כדי לחתוך אותו לחתיכות דקות. העברה להומוגנייזר זכוכית 10 מ"ל מקורר קרח (חומר פלסטי פוליטטראפלואורואתילן (PTFE) מזיקים).
8. השתמשו במערבל תקורה כדי ליצור הומוגניות של הרקמה החתוכה מראש על קרח עם שש משיכות עדינות במהירות מבוקרת של 275 סיבובים לדקה.
9. צנטריפוגה ההומוגנאט ב 8,500 x g במשך 10 דקות ב 4 °C ב 4 °C ב 15 מ"ל צינור חרוטי קר כקרח. יש להשליך את ה-supernatant המכיל את שלב השומנים.
10. החיזרו את הכדור ב-5 מ"ל של חיץ בידוד קר כקרח (טבלה 1) והומוגניזציה, בפעם השנייה, את ההשעיה על הקרח עם שש משיכות איטיות במהירות של 275 סיבוב לדקה.
11. מעבירים את ההומוגנאט בצינור חרוטי קר כקרח של 15 מ"ל וצנטריפוגות שלו ב-700 x גרם למשך 10 דקות ב-4 מעלות צלזיוס כדי לכדור את כל הגרעינים והתאים הלא שבורים.
12. אספו את ה-supernatant בצינור טרי של 15 מ"ל והניחו אותו על קרח.
13. צנטריפוגה את הסופרנטנט ב 8,500 x g במשך 10 דקות ב 4 °C כדי לקבל גלולה המכילה מיטוכונדריה.
14. גלולת Resuspend המכילה מיטוכונדריה ב-3.8 מ"ל של חיץ היפרטוני-מניטול קר כקרח (טבלה 2) ומדגירה את התרחיף המיטוכונדריה על קרח למשך 10-15 דקות.

2. בידוד מיטוכונדריאלי מלב העכבר (שונה מ- Garg et al. 2019)¹⁷

1. המתת עכבר זכר C57BL/6 באמצעות חנק CO₂ ונקע צוואר הרחם לאחר מכן, כפי שהומלץ על ידי פאנל האיגוד הווטרינרי האמריקאי וועדת IACUC.
2. לאחר הצבת העכבר על גבו, יש לרסס אלכוהול כדי לנקות ולהרטיב את השיער. לאחר מכן, בצע חתך של 2 ס"מ על בית החזה לאחר אחיזת העור בפינצטה.
3. נתחו את הלב מהחזה של החיה ושטפו אותו כדי להסיר את כל הדם בכוס של 10 מ"ל עם 5 מ"ל של תמיסת הבידוד הקר (טבלה 1).
4. לאחר שהלב נוקה מעקבות של דם, העבירו אותו לכוס נוספת של 10 מ"ל המכילה 5 מ"ל של מאגר בידוד קר (טבלה 1) כדי לקצוץ אותו לחתיכות דקות. לאחר מכן, העבר להומוגנייזר זכוכית 10 מ"ל מקורר קרח (הדברת PTFE).
5. השתמשו במערבל תקורה כדי ליצור הומוגניות של הרקמה החתוכה מראש על קרח עם שש משיכות עדינות במהירות מבוקרת של 275 סיבובים לדקה.
6. מעבירים את ההומוגנאט לצינור חרוטי קר כקרח של 15 מ"ל וצנטריפוגות שלו ב-700 x גרם למשך 10 דקות ב-4 מעלות צלזיוס לגרעיני כדוריות ולתאים לא שבורים.
7. אספו את ה-supernatant בצינור טרי של 15 מ"ל והניחו אותו על קרח.
8. צנטריפוגה את הסופרנטנט ב 8,500 x g במשך 10 דקות ב 4 °C כדי לקבל גלולה המכילה מיטוכונדריה.
9. בצעו שימוש חוזר בכדור המיטוכונדריאלי ב-3.8 מ"ל של חיץ היפרטוני-מניטול קר כקרח (טבלה 2) והדגירו את התרחיף המיטוכונדריאלי על קרח למשך 10-15 דקות.

3. הכנת מיטופלסטים עם מכבש צרפתי לקרע מכני של ה- OMM.

הערה: הליך העיתונות הצרפתית מאפשר לשחרר את ה-IMM מה-OMM כאשר שלמותו נשמרת, כולל המטריצה וה-crista (איור 2)¹⁸. המיטוכונדריה מודגרת מראש במאגר היפרטוני-מניטול (טבלה 2) ונתונה ללחץ נמוך יותר במהלך הליך העיתונות הצרפתית כדי למנוע כל מתיחה דרסטית של ה-IMM כאשר ה-OMM נקרע.

1. מלאו את תרחיף המיטוכונדריה-היפרטוני-מניטול לתוך תא לחץ מיני מקורר (קוטר בוכנה 3/8 אינץ') של העיתונות הצרפתית (איור 3A).
2. בחר את מצב Medium של העיתונות הצרפתית ודחס את המתלים דרך תא הלחץ המיני ב-110 בחוגה של העיתונות הצרפתית עבור המיטוכונדריה של השומן החום וב-140 עבור המיטוכונדריה של הלב (כ-2,000 psi).  ודאו שהמתלים יוצאים מתא הלחץ הזעיר בקצב של כ-1 טיפה לשנייה.
3. אסוף את הטיפות בצינור חרוטי מצונן קרח של 15 מ"ל.
4. צנטריפוגה את המתלים ב 10,500 x g במשך 10 דקות ב 4 °C (64 °F).
5. בצעו שימוש חוזר בכדור המיטופלסטים ב-0.5-2 מ"ל של חיץ היפרטוני-KCl קר כקרח (טבלה 3) ואחסנו את ההשעיה על קרח.
   הערה: שומן חום ומיטופלסטים של לב מוכנים להקלטות מהדקי טלאים וצריכים להישאר שמישים במשך כ-3-6 שעות.

4. הקלטות אלקטרופיזיולוגיות של דליפת H⁺ דרך UCP1 ו-AAC ^5,7,15

הערה: השתמש במערך האלקטרופיזיולוגי הבא (איור 3B): מיקרוסקופ הפוך עם ניגודיות התאבכות דיפרנציאלית (DIC), 60x מטרת טבילת מים, טבלת בידוד רטט וכלוב פאראדיי, מגבר סטנדרטי התומך בהקלטות רעש נמוך, דיגיטציה סטנדרטית המשמשת להתקנה אלקטרופיזיולוגית, pClamp 10, מיקרומניפולטור, אלקטרודת ייחוס אמבטיה (3 M KCl-agar גשר מלח שהוכנס בתוך מחזיק מיקרואלקטרודה המכיל כדור כלוריד כסוף/כסוף מעוצב לתוך גוף המחזיק (המתואר ב- Liu et al. 2021)¹⁹, תא פרפוזיה עם תחתית כיסוי זכוכית 0.13 מ"מ, המחובר למערכת פרפוזיה הניזונה מכוח הכבידה.

1. משוך את חוטי הזכוכית הבורוסיליקטים ביום ההקלטה באמצעות מושך מיקרופיפט. הגדר תוכנית על המושך המשמש ליצירת פיפטות עם רמה גבוהה של שכפול²⁰.
   הערה: תכנון תוכנית זה דורש מספר ניסיונות להשיג פיפטות המותאמות למהדק התיקון של IMM. לפיפטה סטנדרטית יש קצוות עדינים עם צורה חרוטית מתקדמת.
2. הכנס חוט זכוכית אחד בתוך המושך ומשך כדי להשיג כמעט שתי פיפטות טלאי זהות מחוט בורוסיליקט אחד.
3. התאם את התוכנית כאשר פיפטות הופכות להיות לא עקביות בין מחזורי משיכה עקב הזדקנות של חוט תיבת החימום של המושך.
4. מקמו את הפיפטה בתוך מלטש הפיפטה והניחו את הקצה ליד החוט מתחת להגדלה של פי 100 כדי ללטש אותו.
5. לחץ על דוושת כף הרגל מספר פעמים כדי לחמם את החוט מבלי לסתום או לפגוע בעקומת הקצה.
6. פיפטות פולניות עם התנגדות בין 25 ל-35 MΩ מתקבלות כאשר הן מתמלאות בתמיסת פיפטה מבוססת TMA (TMA עבור טטרה-מתילמוניום הידרוקסיד, טבלה 4).
7. קדם-דגירה של כיסויים (קוטר 5 מ"מ, עובי 0.1 מ"מ) עם 0.1% ג'לטין כדי להפחית את הידבקות המיטופלסט ולשטוף אותם בתמיסת האמבטיה KCl (טבלה 5) לפני הפקדת תרחיף המיטופלסט.
8. מכינים דילול גולמי על ידי ערבוב של כ-35 μL של תרחיף המיטופלסט המרוכז עם 500 μL של תמיסת האמבטיה KCl (טבלה 5) ומניחים אותה על כיסויים שהונחו בעבר בבאר של צלחת בעלת 4 בארות.
9. דגירה על קרח במשך 15 עד 20 דקות עבור מיטופלסטים למשקעים על הכיסוי.
10. מלאו את תא האמבטיה לחלוטין בכ-50 μL של תמיסת האמבטיה KCl (טבלה 5).
11. העבר כיסוי עם מיטופלסטים בתוך התא באמצעות פינצטה מיקרו-דיסקטיבית דקה עם קצה כפוף.
12. מסדרים את הכיסוי בתחתית החדר. אין להחדיר את החדר כדי לשמור על יציבות המיטופלסטים על הכיסוי.
13. בחר מיטופלסט בודד שאינו דבק בצורת 8 על ידי סריקת הכיסוי מתחת למיקרוסקופ עם מטרה של פי 60.
14. טענו את הפיפטה בתמיסת הפיפטה (כ-50 μL) והניחו אותה במחזיק הפיפטה.
15. הביאו את הפיפטה לתמיסת האמבטיה עם מיקרומניפולטור והתקרבו אליה ממש מעל המיטופלסט שנבחר כדי להתקרב ל-IMM. תוכנית המגבר נותנת את ההתנגדות של הפיפטה ברגע שהיא בתמיסת האמבטיה. החזק את פוטנציאל הממברנה ב- 0 mV והחיל פולסים של 10 mV באמצעות פקודת בדיקת הממברנה בתוכנית המגבר.
16. הפעילו לחץ שלילי קל כדי ליצור במהירות ג'יגאזאל עם ה-IMM (איור 2B).
17. הגבירו את הפיפטה עם המיטופלסט המחובר כדי להרחיק אותם מהכיסוי כדי למנוע את שבירת האטמים עקב סחף הפיפטה במהלך הניסוי.
18. הפיצו את חולפי הקיבולים המשוטטים באמצעות הפקודה "בדיקת ממברנה" בתוכנית המגבר לפני בדיקת תצורת המיטופלסט כולו כדי לקבל מדידת קיבוליות (Cm) נכונה עבור קרום המיטופלסט לאחר הפריצה.
19. החל פולסים של מתח קצר-טווח (5-15 אלפיות השנייה) (250-600 mV) עם תוכנית המגבר כדי לקרוע את תיקון הממברנה מתחת לפיפטת הזכוכית ולהשיג את תצורת המיטופלסט השלמה (איור 2C). פריצה מוצלחת משתקפת על ידי הופעתם המחודשת של ארעי הקיבול.
20. לאחר הפריצה, התאם את ארעי הקיבול עם אפשרות בדיקת הממברנה של תוכנית המגבר כדי להעריך את קיבוליות הממברנה (המשקפת את גודל המיטופלסט) ואת התנגדות הגישה שלו Ra (המשקפת את איכות תצורת המיטופלסט השלם). לאחר הפריצה, Ra צריך להיות בין 40 ל 80 MΩ. למיטופלסטים (בגודל 2-6 מיקרומטר) המשמשים לניסויים בהידוק טלאי יש בדרך כלל קיבוליות ממברנה של 0.5-1.1 pF.
21. מיד לאחר הפריצה, החליפו את תמיסת האמבטיה KCl (טבלה 5) בתמיסת האמבטיה HEPES (טבלה 6) על ידי הפעלת הזלוף.
22. החל פרוטוקול רמפה של 850 אלפיות השנייה שתוכנן עם תוכנית המגבר, החל מ-160 mV- ועד +100 mV עם מרווח של 5 שניות, תוך החזקת המיטופלסט ב-0 mV. פרוטוקול זה עובד עבור מחקרי UCP1 ^6,7,15 ו-AAC⁵ (איור 4 ואיור 5).
    הערה: מומלץ למדידות זרם H⁺ תלויות UCP1 ו-AAC לרכוש את כל הנתונים האלקטרופיזיולוגיים ב-10 קילוהרץ ולסנן ב-1 קילוהרץ באמצעות תוכנה מתאימה המניעה את המגבר והדיגיטציה.

תוצאות

פיתוח מתודולוגיית הידוק התיקון המיושמת על המיטוכונדריה סיפק את המחקר הישיר הראשון של דליפת H⁺ דרך ה-IMM והמובילים המיטוכונדריים, UCP1 ו-AAC, האחראים לכך. הניתוח האלקטרופיזיולוגי של דליפות H⁺ תלויות UCP1 ו-AAC יכול לספק מבט ראשון על היכולת התרמוגנית של המיטוכונדריה. סעיף התוצאות מתאר את ה...

Discussion

מאמר שיטה זה נועד להציג את טכניקת מהדק הטלאי שיושמה לאחרונה על המיטוכונדריה, גישה חדשה לחקר ישיר של דליפת H⁺ דרך ה-IMM האחראית על תרמוגנזה מיטוכונדריאלית 5,6,7,15. טכניקה זו אינה מוגבלת לרקמות וניתן להשתמש בה גם כדי לנת?...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.1% gelatin	Millipore	ES-006-B
60X water immersion objective, numerical aperture 1.20	Olympus	UPLSAPO60XW
Axopatch 200B amplifier	Molecular Devices
Borosilicate glass capillaries	Sutter Instruments	BF150-86-10
Digidata 1550B Digitizer	Molecular Devices
Faraday cage	Homemade
French Press	Glen Mills	5500-000011
IKA Eurostar PWR CV S1 laboratory overhead stirrer
Inversed Microscope	Olympus	IX71 or IX73
Micro Forge	(Narishige)	MF-830
Micromanupulator MPC-385	Sutter Instruments	FG-MPC325
Microelectrode holder for agar bridge	World Precision Instruments	MEH3F4515
Micropipette Puller	(Sutter Instruments)	P97
Mini Cell for French Press	Glen Mills	5500-FA-004
MIXER IKA 6-2000RPM	Cole Parmer	EW-50705-50
Objective 100X magnification	Nikon  lens	MPlan 100/0.80 ELWD 210/0
pClamp 10	Molecular Devices
Perfusion chamber	Warner Instruments	RC-24E
Potter-Elvehjem homogenizer 10 ml	Wheaton	358039
Refrigerated centrifuge SORVALL X4R PRO-MD	Thermo Scientific	75 009 521
Small round glass coverslips: 5 mm diameter, 0.1 mm thickness	Warner Instruments	640700
Vibration isolation table	Newport	VIS3036-SG2-325A
Chemicals
D-gluconic acid	Sigma Aldrich	G1951
D-mannitol	Sigma Aldrich	M4125
EGTA	Sigma Aldrich	3777
HEPES	Sigma Aldrich	H7523
KCl	Sigma Aldrich	60128
MgCl2	Sigma Aldrich	63068
sucrose	Sigma Aldrich	S7903
TMA	Sigma Aldrich	331635
TrisBase	Sigma Aldrich	T1503
TrisCl	Sigma Aldrich	T3253