Использование метода patch-clamp для изучения термогенной способности митохондрий

Резюме

В этой статье подробно описываются основные этапы измерения утечки H⁺ через внутреннюю митохондриальную мембрану с помощью метода пластырного зажима, нового подхода к изучению термогенной способности митохондрий.

Аннотация

Митохондриальный термогенез (также известный как митохондриальное разъединение) является одной из наиболее перспективных целей для увеличения расхода энергии для борьбы с метаболическим синдромом. Термогенные ткани, такие как коричневые и бежевые жиры, развивают узкоспециализированные митохондрии для производства тепла. Митохондрии других тканей, которые в первую очередь вырабатывают АТФ, также преобразуют до 25% от общего производства митохондриальной энергии в тепло и могут, следовательно, оказывать значительное влияние на физиологию всего организма. Митохондриальный термогенез не только необходим для поддержания температуры тела, но также предотвращает ожирение, вызванное диетой, и снижает выработку активных форм кислорода (АФК) для защиты клеток от окислительного повреждения. Поскольку митохондриальный термогенез является ключевым регулятором клеточного метаболизма, механистическое понимание этого фундаментального процесса поможет в разработке терапевтических стратегий борьбы со многими патологиями, связанными с митохондриальной дисфункцией. Важно отметить, что точные молекулярные механизмы, которые контролируют острую активацию термогенеза в митохондриях, плохо определены. Этот недостаток информации во многом связан с нехваткой методов прямого измерения разъединяющихся белков. Недавняя разработка методологии пластырного зажима, применяемой к митохондриям, позволила впервые непосредственно изучить явление, лежащее в основе митохондриального термогенеза, утечку H⁺ через ИММ, и первую биофизическую характеристику митохондриальных транспортеров, ответственных за него, разъединяющего белка 1 (UCP1), специфичного для бурых и бежевых жиров, и транспортера АДФ/АТФ (AAC) для всех других тканей. Этот уникальный подход даст новое представление о механизмах, которые контролируют утечку H ⁺ и митохондриальный термогенез, и о том, как они могут быть нацелены на борьбу с метаболическим синдромом. В этой статье описывается методология зажимов, применяемая к митохондриям для изучения их термогенной способности путем непосредственного измерения токов H⁺ через IMM.

Введение

Митохондрии славятся тем, что являются электростанцией клетки. Действительно, они являются основным источником химической энергии, АТФ. Что менее известно, так это то, что митохондрии также генерируют тепло. Фактически, каждая митохондрия постоянно генерирует два типа энергий (АТФ и тепло), а тонкий баланс между двумя энергетическими формами определяет метаболический гомеостаз клеток (рисунок 1). Как митохондрии распределяют энергию между АТФ и теплом, безусловно, является самым фундаментальным вопросом в области биоэнергетики, хотя он до сих пор в значительной степени неизвестен. Мы знаем, что увеличение производства митохондриального тепла (называемое митохондриальным термогенезом) и, следовательно, снижение производства АТФ увеличивает расход энергии, и это один из лучших способов борьбы с метаболическим синдромом¹.

Митохондриальный термогенез возникает из-за утечки H⁺ через внутреннюю митохондриальную мембрану (IMM), что приводит к разъединению окисления субстрата и синтеза АТФ с последующим производством тепла, отсюда и название «митохондриальное разъединение»¹ (рисунок 1). Эта утечка H⁺ зависит от митохондриальных транспортеров, называемых разъединяющими белками (UCP). UCP1 был первым идентифицированным UCP. Он выражается только в термогенных тканях, буром жире и бежевом жире, в которых митохондрии специализируются на производстве тепла ^2,3,4. Идентичность UCP в нежировых тканях, таких как скелетные мышцы, сердце и печень, остается спорной. Митохондрии в этих тканях могут иметь около 25% общей митохондриальной энергии, преобразованной в тепло, что может значительно повлиять на физиологию всего тела¹. Помимо поддержания температуры тела, митохондриальный термогенез также предотвращает ожирение, вызванное диетой, уменьшая калории. Кроме того, он уменьшает выработку активных форм кислорода (АФК) митохондриями для защиты клеток от окислительного повреждения¹. Таким образом, митохондриальный термогенез участвует в нормальном старении, возрастных дегенеративных расстройствах и других состояниях, связанных с окислительным стрессом, таких как ишемия-реперфузия. Поэтому митохондриальный термогенез является мощным регулятором клеточного метаболизма, и механистическое понимание этого фундаментального процесса будет способствовать разработке терапевтических стратегий борьбы со многими патологиями, связанными с митохондриальной дисфункцией.

Митохондриальное дыхание было первым методом, раскрывшим решающую роль митохондриального термогенеза в клеточном метаболизме и до сих пор является самым популярным в сообществе¹. Этот метод основан на измерении потребления кислорода митохондриальной цепью переноса электронов (ETC), которая увеличивается при активации утечки митохондриального H⁺. Этот метод, хотя и инструментальный, не может непосредственно изучать утечку митохондриального H⁺ через IMM¹, тем самым затрудняя точную идентификацию и характеристику белков, ответственных за него, особенно в нежировых тканях, в которых производство тепла является вторичным по сравнению с производством АТФ. Недавно разработка метода пластыря-зажима, применяемого к митохондриям, обеспечила первое прямое исследование утечки H⁺ по всему ИММ в различных тканях ^5,6,7.

Митохондриальный пластырь-зажим всего ИММ был впервые установлен воспроизводимым способом Kirichok et ^al.8. Они описали первое прямое измерение токов митохондриального юнипортера кальция (MCU) в 2004 году с использованием митопластов из клеточных линий COS-7⁸. Позже лаборатория Kirichok показала токи кальция из IMM тканей мыши⁹ и дрозофилы ⁹. Другие лаборатории в настоящее время регулярно используют этот метод для изучения биофизических свойств MCU 10,11,12,13,14. Анализ проводимости калия и хлорида также возможен и упоминался в нескольких статьях, но еще не был основным предметом публикации ^6,7,9. Первое измерение токов H⁺ через IMM было зарегистрировано в 2012 году из митохондрий бурого жира мыши⁶ и из митохондрий мышиного бежевого жира в 2017^{году 7}. Этот ток обусловлен специфическим разъединяющим белком термогенных тканей UCP1 ^6,7. Недавняя работа, опубликованная в 2019 году, охарактеризовала AAC как основной белок, ответственный за утечку митохондриального H⁺ в нежировых тканях, таких как сердце и скелетные мышцы⁵.

Этот уникальный подход теперь позволяет проводить прямой функциональный анализ с высоким разрешением митохондриальных ионных каналов и транспортеров, ответственных за митохондриальный термогенез. Чтобы облегчить расширение метода и дополнить другие исследования, такие как митохондриальное дыхание, ниже описан подробный протокол измерения токов H⁺ , переносимых UCP1 и AAC. Описаны три важных шага: 1) выделение митохондрий из мышиного бурого жира для анализа UCP1-зависимого тока H⁺ и митохондриальная изоляция от сердца для анализа AAC-зависимого тока H⁺ , 2) подготовка митопластов с помощью френч-пресса для механического разрыва внешней митохондриальной мембраны (OMM), 3) записи зажимов UCP1 и AAC-зависимых токов H⁺ по всему ИММ.

протокол

Все экспериментальные процедуры на животных, которые были выполнены, соответствуют руководящим принципам Национального института здравоохранения и были одобрены Калифорнийским университетом Лос-Анджелесского институционального комитета по уходу за животными и их использованию (IACUC).

ПРИМЕЧАНИЕ: Процедура выделения митохондрий основана на дифференциальном центрифугировании и незначительно варьируется от ткани к ткани. Например, поскольку коричневая жировая ткань чрезвычайно богата липидами, требуется дополнительный шаг для отделения клеточного мусора и органелл от липидной фазы перед сбором митохондрий. Чтобы избежать путаницы, две процедуры изоляции митохондрий (одна из бурого жира, а другая из сердца) подробно описаны ниже.

1. Митохондриальная изоляция из мышиного межлопастного бурого жира (модифицированная из Bertholet et al. 2020)¹⁵

1. Усыпление самцов мышей C57BL/6 с использованием асфиксии_CO2 и последующего вывиха шейки матки, как рекомендовано Группой Американской ветеринарной медицинской ассоциации и Комитетом IACUC.
2. Расположив мышь брюхом лицом к столу, распылите спирт для очистки и намокания волос (модифицировано из Mann et al., 2014)¹⁶.
3. Сделайте разрез 2 см в верхней части спины после захвата кожи пинцетом.
4. Извлеките коричневый межлопаточный жир мыши, соответствующий двухлопастному органу с формой бабочки¹⁶.
5. Переложите бурый жир в чашку Петри толщиной 35 мм, заполненную 5 мл буфера холодной изоляции (таблица 1), предварительно помещенную на лед.
6. Очистите бурый жир от белого жира в бинокль.
7. Переложите бурый жир в стакан объемом 10 мл с 5 мл буфера холодной изоляции (таблица 1), чтобы измельчить его на тонкие кусочки. Переложить на охлажденный льдом гомогенизатор стекла 10 мл (пестик из полиэтилена политетрафторэтилена (ПТФЭ)).
8. Используйте верхнюю мешалку для гомогенизации предварительно разрезанной ткани на льду шестью мягкими ударами с контролируемой скоростью 275 оборотов в минуту.
9. Центрифугировать гомогенат при 8 500 х г в течение 10 мин при 4 °C в ледяной конической трубке объемом 15 мл. Отбросьте супернатант, содержащий липидную фазу.
10. Повторно суспендировать гранулу в 5 мл ледяного изоляционного буфера (табл. 1) и гомогенизировать, во второй раз, суспензию на льду шестью медленными ходами со скоростью 275 оборотов/мин.
11. Переложите гомогенат в 15 мл ледяной конической трубки и центрифугируйте его при 700 х г в течение 10 мин при 4 °C до гранул всех ядер и неразрывных клеток.
12. Соберите супернатант в свежую трубку объемом 15 мл и поместите на лед.
13. Центрифугируют супернатант при 8,500 х г в течение 10 мин при 4°С с получением гранулы, содержащей митохондрии.
14. Повторно суспендировать гранулы, содержащие митохондрии в 3,8 мл ледяного гипертонико-маннитольного буфера (табл. 2) и инкубировать митохондриальную суспензию на льду в течение 10-15 мин.

2. Митохондриальная изоляция от сердца мыши (модифицировано из Garg et al. 2019)¹⁷

1. Усыпление самцов мышей C57BL/6 с использованием асфиксии_CO2 и последующего вывиха шейки матки, как рекомендовано Группой Американской ветеринарной медицинской ассоциации и Комитетом IACUC.
2. После размещения мыши на спине распылите спирт, чтобы очистить и намочить волосы. Затем сделайте разрез 2 см на грудной клетке после захвата кожи пинцетом.
3. Рассекните сердце из груди животного и промойте его, чтобы удалить всю кровь в стакане объемом 10 мл с 5 мл раствора для холодного выделения (таблица 1).
4. После того, как сердце очищено от следов крови, перенесите его на другой стакан объемом 10 мл, содержащий 5 мл буфера холодной изоляции (таблица 1), чтобы измельчить его на тонкие кусочки. Затем переложить на охлажденный льдом стеклянный гомогенизатор 10 мл (пестик из PTFE).
5. Используйте верхнюю мешалку для гомогенизации предварительно разрезанной ткани на льду шестью мягкими ударами с контролируемой скоростью 275 оборотов в минуту.
6. Переложите гомогенат в 15 мл ледяной конической трубки и центрифугируйте его при 700 х г в течение 10 мин при 4 °C к ядрам гранул и неразрывным клеткам.
7. Соберите супернатант в свежую трубку объемом 15 мл и поместите на лед.
8. Центрифугируют супернатант при 8,500 х г в течение 10 мин при 4°С с получением гранулы, содержащей митохондрии.
9. Повторно суспендируют митохондриальную гранулу в 3,8 мл ледяного гипертонико-маннитольного буфера (таблица 2) и инкубируют митохондриальную суспензию на льду в течение 10-15 мин.

3. Подготовка митопластов френч-прессом для механического разрыва ОММ.

ПРИМЕЧАНИЕ: Французская процедура прессования позволяет освободить IMM от OMM с сохранением его целостности, включая матрицу и crista (рисунок 2)¹⁸. Митохондрии предварительно инкубируют в гипертонально-маннитольный буфер (таблица 2) и подвергают более низкому давлению во время процедуры френч-прессования, чтобы избежать резкого растяжения ИММ при разрыве ОММ.

1. Заполните митохондриально-гипертоническую-маннитольную суспензию в охлажденную мини-ячейку давления (диаметр поршня 3/8") френч-пресса (рисунок 3А).
2. Выберите средний режим френч-пресса и сожмите суспензию через мини-ячейку давления при 110 на циферблате френч-пресса для митохондрий бурого жира и при 140 для митохондрий сердца (~ 2000 фунтов на квадратный дюйм).  Убедитесь, что суспензия выходит из мини-напорной ячейки со скоростью около 1 капли / с.
3. Соберите капли в 15 мл охлажденной льдом конической трубки.
4. Центрифугировать суспензию при 10 500 х г в течение 10 мин при 4 °C.
5. Повторно суспендируют гранулы митопластов в 0,5-2 мл ледяного буфера Hypertonic-KCl (таблица 3) и хранят суспензию на льду.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Митопласты бурого жира и сердца готовы к записи зажимов и должны оставаться пригодными для использования в течение примерно 3-6 ч.

4. Электрофизиологические записи утечки H⁺ через UCP1 и AAC ^5,7,15

ПРИМЕЧАНИЕ: Используйте следующую электрофизиологическую установку (рисунок 3B): инвертированный микроскоп с дифференциальным интерференционным контрастом (DIC), объектив погружения в воду 60x, стол виброизоляции и клетку Фарадея, стандартный усилитель, поддерживающий малошумные записи, стандартный дигитайзер, используемый для электрофизиологической установки, pClamp 10, микроманипулятор, опорный электрод ванны (солевой мост 3 M KCl-agar, вставленный в держатель микроэлектрода, содержащий гранулу хлорида серебра / серебра в корпус держателя (описанный в Liu et al. 2021)¹⁹, перфузионная камера с 0,13 мм стеклянным покровным дном, соединенным с гравитационной перфузионной системой.

1. Потяните боросиликатные стеклянные нити в день записи с помощью съемника микропипетки. Установите программу на съемник, используемый для генерации пипеток с высокой степенью воспроизводимости²⁰.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Эта конструкция программы требует нескольких попыток получить пипетки, оптимизированные для патч-зажима IMM. Стандартная пипетка имеет тонкие наконечники с прогрессивной конической формой.
2. Вставьте одну стеклянную нить в съемник и потяните, чтобы получить почти две одинаковые патч-пипетки из одной боросиликатной нити.
3. Отрегулируйте программу, когда пипетки становятся непоследовательными между циклами вытягивания из-за старения нити нагревательной коробки съемника.
4. Поместите пипетку внутрь полировальной машины и поместите наконечник рядом с нитью накаливания под 100-кратным увеличением, чтобы отполировать ее огнем.
5. Нажмите ножную педаль несколько раз, чтобы нагреть нить накала, не забивая и не повреждая кривую наконечника.
6. Полируйте до тех пор, пока не будут получены пипетки с сопротивлением от 25 до 35 МОм при заполнении раствором пипетки на основе ТМА (ТМА для гидроксида тетраметиламмония, таблица 4).
7. Предварительно инкубировать обшивки (диаметр 5 мм, толщина 0,1 мм) с 0,1% желатином для уменьшения адгезии митопласта и промыть их раствором для ванны KCl (таблица 5) перед нанесением суспензии митопласта.
8. Готовят сырое разбавление путем смешивания ~35 мкл концентрированной суспензии митопласта с 500 мкл раствора для ванны KCl (таблица 5) и помещают его на крышки, предварительно помещенные в колодец из 4-луночной пластины.
9. Инкубировать на льду в течение 15-20 мин для митопластов до осадка на покровном листе.
10. Заполните камеру ванны полностью ~50 мкл раствора для ванны KCl (таблица 5).
11. Перенесите крышку с митопластами в камеру с помощью тонкого микродиссекционного пинцета с изогнутым наконечником.
12. Расположите крышку в нижней части камеры. Не перфузируйте камеру, чтобы митопласты оставались стабильными на крышке.
13. Выберите индивидуальный неадгезивный митопласт в форме 8, отсканировав крышку под микроскопом с 60-кратным объективом.
14. Загрузите пипетку раствором пипетки (~50 мкл) и поместите ее в держатель пипетки.
15. Поднесите пипетку в раствор ванны с помощью микроманипулятора и подойдите к ней чуть выше выбранного митопласта, чтобы приблизиться к ИММ. Программа усилителя дает сопротивление пипетки, как только она находится в растворе ванны. Удерживайте мембранный потенциал на уровне 0 мВ и подавайте импульсы 10 мВ с помощью команды мембранного теста в программе усилителя.
16. Примените небольшое отрицательное давление, чтобы быстро создать гигазиал с помощью IMM (рисунок 2B).
17. Поднимите пипетку с прикрепленным митопластом, чтобы держать их подальше от крышки, чтобы избежать поломки уплотнения из-за дрейфа пипетки во время эксперимента.
18. Компенсируйте блуждающие емкостные переходные процессы с помощью команды «мембранный тест» в программе усилителя перед тестированием конфигурации всего митопласта для получения правильного измерения емкости (Cm) для мембраны митопласта после взлома.
19. Примените кратковременные (5-15 мс) импульсы напряжения (250-600 мВ) с помощью программы усилителя, чтобы разорвать мембранный пластырь под стеклянной пипеткой и достичь конфигурации всего митопласта (рисунок 2C). Успешная обкатка отражается повторным появлением емкостных переходных процессов.
20. После обкатки установите емкостные переходные процессы с помощью опции мембранного теста программы усилителя для оценки емкости мембраны (отражающей размер митопласта) и его сопротивления доступу Ra (отражающего качество конфигурации всего митопласта). После обкатки Ra должен составлять от 40 до 80 МОм. Митопласты (размером 2-6 мкм), используемые для экспериментов с зажимами, обычно имеют мембранные емкости 0,5-1,1 пФ.
21. Сразу после обрыва замените раствор для ванны KCl (таблица 5) раствором для ванны HEPES (таблица 6), начав перфузию.
22. Применяйте протокол рампы 850 мс, разработанный с помощью программы усилителя, от -160 мВ до +100 мВ с интервалом 5 с, удерживая митопласт на 0 мВ. Этот протокол работает для исследований UCP1 ^6,7,15 и AAC⁵ (рисунок 4 и рисунок 5).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Для UCP1 и AAC-зависимых измерений тока H⁺ рекомендуется получать все электрофизиологические данные на частоте 10 кГц и фильтровать на частоте 1 кГц с использованием соответствующего программного обеспечения, приводящего в действие усилитель и дигитайзер.

Результаты

Разработка методологии пластырного зажима, применяемой к митохондриям, обеспечила первое прямое исследование утечки H⁺ через IMM и митохондриальные транспортеры, UCP1 и AAC, которые отвечают за нее. Электрофизиологический анализ UCP1- и AAC-зависимых Утечек H⁺ может дать первый взгл?...

Обсуждение

Эта статья о методе направлена на то, чтобы представить метод зажимов, недавно примененный к митохондриям, новый подход к непосредственному изучению утечки H⁺ через IMM, ответственный за митохондриальный термогенез ^5,6,7,15.

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.1% gelatin	Millipore	ES-006-B
60X water immersion objective, numerical aperture 1.20	Olympus	UPLSAPO60XW
Axopatch 200B amplifier	Molecular Devices
Borosilicate glass capillaries	Sutter Instruments	BF150-86-10
Digidata 1550B Digitizer	Molecular Devices
Faraday cage	Homemade
French Press	Glen Mills	5500-000011
IKA Eurostar PWR CV S1 laboratory overhead stirrer
Inversed Microscope	Olympus	IX71 or IX73
Micro Forge	(Narishige)	MF-830
Micromanupulator MPC-385	Sutter Instruments	FG-MPC325
Microelectrode holder for agar bridge	World Precision Instruments	MEH3F4515
Micropipette Puller	(Sutter Instruments)	P97
Mini Cell for French Press	Glen Mills	5500-FA-004
MIXER IKA 6-2000RPM	Cole Parmer	EW-50705-50
Objective 100X magnification	Nikon  lens	MPlan 100/0.80 ELWD 210/0
pClamp 10	Molecular Devices
Perfusion chamber	Warner Instruments	RC-24E
Potter-Elvehjem homogenizer 10 ml	Wheaton	358039
Refrigerated centrifuge SORVALL X4R PRO-MD	Thermo Scientific	75 009 521
Small round glass coverslips: 5 mm diameter, 0.1 mm thickness	Warner Instruments	640700
Vibration isolation table	Newport	VIS3036-SG2-325A
Chemicals
D-gluconic acid	Sigma Aldrich	G1951
D-mannitol	Sigma Aldrich	M4125
EGTA	Sigma Aldrich	3777
HEPES	Sigma Aldrich	H7523
KCl	Sigma Aldrich	60128
MgCl2	Sigma Aldrich	63068
sucrose	Sigma Aldrich	S7903
TMA	Sigma Aldrich	331635
TrisBase	Sigma Aldrich	T1503
TrisCl	Sigma Aldrich	T3253