O uso da técnica de grampo de remendo para estudar a capacidade termogênica das mitocôndrias

Resumo

Este artigo de método detalha os principais passos na medição do vazamento de H⁺ através da membrana mitocondrial interna com a técnica de patch-clamp, uma nova abordagem para estudar a capacidade termogênica das mitocôndrias.

Resumo

A termogênese mitocondrial (também conhecida como desacoplamento mitocondrial) é uma das metas mais promissoras para aumentar o gasto energético para combater a síndrome metabólica. Tecidos termogênicos como gorduras marrons e bege desenvolvem mitocôndrias altamente especializadas para produção de calor. Mitocôndrias de outros tecidos, que produzem principalmente ATP, também convertem até 25% da produção total de energia mitocondrial em calor e podem, portanto, ter um impacto considerável na fisiologia de todo o corpo. A termogênese mitocondrial não é apenas essencial para manter a temperatura corporal, mas também previne a obesidade induzida pela dieta e reduz a produção de espécies reativas de oxigênio (ROS) para proteger as células contra danos oxidativos. Uma vez que a termogênese mitocondrial é um dos principais reguladores do metabolismo celular, uma compreensão mecanicista desse processo fundamental ajudará no desenvolvimento de estratégias terapêuticas para combater muitas patologias associadas à disfunção mitocondrial. É importante ressaltar que os mecanismos moleculares precisos que controlam a ativação aguda da termogênese nas mitocôndrias são mal definidos. Essa falta de informação deve-se, em grande parte, à escassez de métodos para a medição direta de proteínas desacoplamento. O desenvolvimento recente da metodologia de patch-clamp aplicada às mitocôndrias possibilitou, pela primeira vez, o estudo direto do fenômeno na origem da termogênese mitocondrial, o vazamento de H⁺ através do IMM, e a primeira caracterização biofísica dos transportadores mitocondriais responsáveis por ele, a proteína desacoplamento 1 (UCP1), específica das gorduras marrom e bege, e o transporte ADP/ATP (AAC) para todos os outros tecidos. Esta abordagem única fornecerá novas percepções sobre os mecanismos que controlam o vazamento de H⁺ e a termogênese mitocondrial e como eles podem ser direcionados para combater a síndrome metabólica. Este artigo descreve a metodologia de grampo de remendo aplicada às mitocôndrias para estudar sua capacidade termogênica medindo diretamente as correntes H⁺ através do IMM.

Introdução

Mitocôndrias são famosas por serem a potência da célula. Na verdade, eles são a principal fonte de energia química, ATP. O que é menos conhecido é que mitocôndrias também geram calor. De fato, cada mitocôndria constantemente gera os dois tipos de energias (ATP e calor) e um equilíbrio fino entre as duas formas de energia define homeostase de células metabólicas (Figura 1). Como as mitocôndrias distribuem energia entre ATP e calor é certamente a questão mais fundamental no campo da bioenergetics, embora ainda seja amplamente desconhecida. Sabemos que o aumento da produção de calor mitocondrial (chamada termogênese mitocondrial), e consequentemente reduzir a produção de ATP aumenta o gasto energético e esta é uma das melhores formas de combater a síndrome metabólica¹.

A termogênese mitocondrial origina-se do vazamento de H⁺ através da membrana mitocondrial interna (IMM), levando ao desacoplamento da oxidação do substrato e da síntese de ATP com consequente produção de calor, daí o nome "desacoplamento mitocondrial"¹ (Figura 1). Este vazamento H⁺ depende de transportadores mitocondriais chamados proteínas de desacoplamento (UCPs). A UCP1 foi a primeira UCP identificada. É expressa apenas em tecidos termogênicos, gordura marrom e gordura bege em que mitocôndrias são especializadas para produção de calor ^2,3,4. A identidade da UCP em tecidos não adiposos, como músculo esquelético, coração e fígado, tem permanecido controversa. Mitocôndrias nesses tecidos podem ter cerca de 25% da energia mitocondrial total convertida em calor, o que pode impactar significativamente a fisiologia de todo o corpo¹. Além de manter a temperatura corporal do núcleo, a termogênese mitocondrial também previne a obesidade induzida pela dieta, reduzindo as calorias. Além disso, reduz a produção de espécies reativas de oxigênio (ROS) por mitocôndrias para proteger as células de danos oxidativos¹. Assim, a termogênese mitocondrial está envolvida no envelhecimento normal, distúrbios degenerativos relacionados à idade e outras condições que envolvem estresse oxidativo, como isquemia-reperfusão. Portanto, a termogênese mitocondrial é um poderoso regulador do metabolismo celular, e uma compreensão mecanicista desse processo fundamental promoverá o desenvolvimento de estratégias terapêuticas para combater muitas patologias associadas à disfunção mitocondrial.

A respiração mitocondrial foi a primeira técnica a revelar o papel crucial da termogênese mitocondrial no metabolismo celular e ainda é a mais popular na comunidade¹. Esta técnica é baseada na medição do consumo de oxigênio pela cadeia de transporte de elétrons mitocondrial (ETC) que aumenta quando o vazamento mitocondrial H⁺ é ativado. Esta técnica, embora instrumental, não pode estudar diretamente o vazamento mitocondrial H⁺ através do IMM¹, dificultando assim a identificação e caracterização precisas das proteínas responsáveis por isso, particularmente em tecidos não adiposos em que a produção de calor é secundária em comparação com a produção de ATP. Recentemente, o desenvolvimento da técnica de grampo de remendo aplicada às mitocôndrias, forneceu o primeiro estudo direto do vazamento de H⁺ em todo o IMM em vários tecidos ^5,6,7.

O grampo mitocondrial de toda a IMM foi estabelecido pela primeira vez de forma reprodutível por Kirichok et ^al.8. Eles descreveram a primeira medição direta das correntes mitocondriais de cálcio (MCU) em 2004 usando mitoplastos das linhas celulares COS-7⁸. Mais tarde, o laboratório de Kirichok mostrou correntes de cálcio de IMMs de tecidos de camundongo⁹ e Drosophila ⁹. Outros laboratórios agora usam essa técnica rotineiramente para estudar as propriedades biofísicas da MCU 10,11,12,13,14. A análise completa do grampo de remendo do IMM da condutância de potássio e cloreto também é possível e foi mencionada em vários artigos, mas ainda não foi o tema principal de uma publicação ^6,7,9. A primeira medição das correntes H⁺ em todo o IMM foi relatada em 2012 a partir de mitocôndrias de gordura^{marrom-rato 6}, e de mitocôndrias de gordura bege do rato em 2017⁷. Esta corrente é devido à proteína de desacoplamento específica dos tecidos termogênicos, UCP1 ^6,7. Trabalho recente publicado em 2019 caracterizou a AAC como a principal proteína responsável pelo vazamento mitocondrial H⁺ em tecidos não adiposos, como o coração e o músculo esquelético⁵.

Esta abordagem única agora permite a análise funcional direta de alta resolução dos canais mitocondriais e transportadores responsáveis pela termogênese mitocondrial. Para facilitar a expansão do método e complementar outros estudos como a respiração mitocondrial, um protocolo detalhado é descrito abaixo para medir as correntes H⁺ transportadas pela UCP1 e AAC. Três passos importantes são descritos: 1) isolamento mitocondrial da gordura marrom do rato para analisar a corrente H⁺ dependente de UCP1 e o isolamento mitocondrial do coração para analisar a corrente H⁺ dependente de AAC, 2) preparação de mitoplastos com uma prensa francesa para ruptura mecânica da membrana mitocondrial externa (OMM), 3) gravações de grampos de remendo de UCP1 e correntes H⁺ dependentes de AAC em todo o IMM.

Protocolo

Todos os procedimentos experimentais animais que foram realizados de acordo com as diretrizes dos Institutos Nacionais de Saúde e foram aprovados pelo Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais da Universidade da Califórnia em Los Angeles (IACUC).

NOTA: O procedimento de isolamento mitocondrial é baseado na centrifugação diferencial e varia ligeiramente de tecido para tecido. Por exemplo, uma vez que o tecido adiposo marrom é extremamente rico em lipídios, requer um passo adicional para separar detritos celulares e organelas da fase lipídica antes de colher as mitocôndrias. Para evitar confusão, os dois procedimentos de isolamento mitocondrial (um da gordura marrom e outro do coração) são detalhados abaixo.

1. Isolamento mitocondrial da gordura marrom interscapular do rato (modificado a partir de Bertholet et al. 2020)¹⁵

1. Euthanize C57BL/6 camundongo macho usando asfixia de CO₂ e posterior luxação cervical, conforme recomendado pelo American Veterinary Medical Association Panel e pelo Comitê IACUC.
2. Depois de posicionar o rato com a barriga de frente para a mesa, pulverize o álcool para limpar e molhar o cabelo (modificado de Mann et al., 2014)¹⁶.
3. Faça uma incisão de 2 cm na parte superior das costas depois de agarrar a pele com pinças.
4. Extrair a gordura interscapular marrom do rato que corresponde a um órgão de dois lobed com uma forma de borboleta¹⁶.
5. Transfira a gordura marrom para uma placa de Petri de 35 mm cheia de 5 mL de tampão de isolamento frio (Tabela 1) previamente colocada no gelo.
6. Limpe a gordura marrom da gordura branca sob um binóculo.
7. Transfira a gordura marrom para um béquer de 10 mL com 5 mL de tampão de isolamento frio (Tabela 1) para cortá-la em pedaços finos. Transfira para o homogeneizador de vidro de 10 mL refrigerado ao gelo (material plástico politetrafluororetileno (PTFE).
8. Use um agitador aéreo para homogeneizar o tecido pré-cortado no gelo com seis golpes suaves a uma velocidade controlada de 275 rotações/min.
9. Centrifugar o homogeneizar a 8.500 x g por 10 min a 4 °C em um tubo cônico gelado de 15 mL. Descarte o supernatante contendo a fase lipídica.
10. Resuspenda a pelota em 5 mL de tampão de isolamento gelado (Tabela 1) e homogeneize, uma segunda vez, a suspensão no gelo com seis golpes lentos a uma velocidade de 275 rotação/min.
11. Transfira o homogene de homogeneização em um tubo cônico gelado de 15 mL e centrifuse-o a 700 x g por 10 min a 4 °C para pelotar todos os núcleos e células ininterruptas.
12. Colete o supernatante em um tubo fresco de 15 mL e coloque-o no gelo.
13. Centrifugar o supernante a 8.500 x g por 10 min a 4 °C para obter uma pelota contendo mitocôndrias.
14. Pelota resuspend contendo mitocôndrias em 3,8 mL de tampão hipertônico-mannitol frio (Tabela 2) e incubar a suspensão mitocondrial no gelo por 10-15 min.

2. Isolamento mitocondrial do coração do rato (modificado a partir de Garg et al. 2019)¹⁷

1. Euthanize C57BL/6 camundongo macho usando asfixia de CO₂ e posterior luxação cervical, conforme recomendado pelo American Veterinary Medical Association Panel e pelo Comitê IACUC.
2. Depois de posicionar o rato nas costas, pulverize o álcool para limpar e molhar o cabelo. Em seguida, faça uma incisão de 2 cm no tórax depois de agarrar a pele com pinças.
3. Disseque o coração do peito do animal e enxágue-o para remover todo o sangue em um béquer de 10 mL com 5 mL da solução de isolamento frio (Tabela 1).
4. Uma vez que o coração tenha sido limpo de vestígios de sangue, transfira-o para outro béquer de 10 mL contendo 5 mL de tampão de isolamento frio (Tabela 1) para cortá-lo em pedaços finos. Em seguida, transfira para um homogeneizador de vidro de 10 mL refrigerado ao gelo (pilão PTFE).
5. Use um agitador aéreo para homogeneizar o tecido pré-cortado no gelo com seis golpes suaves a uma velocidade controlada de 275 rotações/min.
6. Transfira o homogene de homogeneização para um tubo cônico gelado de 15 mL e centrifuá-lo a 700 x g por 10 min a 4 °C para pelotas de núcleos e células ininterruptas.
7. Colete o supernatante em um tubo fresco de 15 mL e coloque-o no gelo.
8. Centrifugar o supernante a 8.500 x g por 10 min a 4 °C para obter uma pelota contendo mitocôndrias.
9. Resuspend a pelota mitocondrial em 3,8 mL de tampão hipertônico-mannitol frio (Tabela 2) e incubar a suspensão mitocondrial no gelo por 10-15 min.

3. Preparação de mitoplastos com uma Prensa Francesa para ruptura mecânica do OMM.

NOTA: O procedimento de imprensa francês permite que o IMM seja liberado do OMM com sua integridade preservada, incluindo a matriz e a crista (Figura 2)¹⁸. Mitocôndrias são pré-incubadas em um tampão hipertônico-mannitol (Tabela 2) e submetidas a uma pressão menor durante o procedimento de imprensa francês para evitar qualquer alongamento drástico do IMM quando o OMM é rompido.

1. Encha a suspensão mitocondrial-hipertônico-mannitol em uma mini célula de pressão refrigerada (diâmetro do pistão 3/8") da prensa francesa (Figura 3A).
2. Selecione o modo médio da Imprensa Francesa e comprima a suspensão através da mini célula de pressão a 110 no mostrador da Imprensa Francesa para as mitocôndrias de gordura marrom e a 140 para as mitocôndrias cardíacas (~2.000 psi).  Certifique-se de que a suspensão saia da mini célula de pressão a uma taxa de cerca de 1 drop/s.
3. Colete as gotas em um tubo cônico refrigerado a gelo de 15 mL.
4. Centrifugar a suspensão a 10.500 x g por 10 min a 4 °C.
5. Resuspenda a pelota de mitoplastos em 0,5-2 mL de tampão hipertônico-kcl frio (Tabela 3) e armazene a suspensão no gelo.
   NOTA: Gordura marrom e mitoplastos cardíacos estão prontos para gravações de grampos de remendo e devem permanecer utilizáveis por cerca de 3-6 h.

4. Gravações eletrofisiológicas de H⁺ vazam através de UCP1 e AAC ^5,7,15

NOTA: Utilize a seguinte configuração eletrofisiológica (Figura 3B): microscópio invertido com contraste de interferência diferencial (DIC), objetivo de imersão de água de 60x, mesa de isolamento de vibração e uma gaiola Faraday, um amplificador padrão que suporta gravações de baixo ruído, um digitalizador padrão usado para configuração eletrofisiológica, pClamp 10, um micromanipulador, eletrodo de referência de banho (ponte de sal de 3 M KCl-gar inserida dentro de um suporte de microeletríno contendo uma pelota de cloreto de prata/prata moldada no corpo do titular (descrito em Liu et al. 2021)¹⁹, câmara de perfusão com fundo de deslizamento de vidro de 0,13 mm, conectado a um sistema de perfusão alimentado pela gravidade.

1. Puxe os filamentos de vidro borossilicato no dia da gravação usando um puxador de micropipette. Coloque um programa no puxador usado para gerar pipetas com alto grau de reprodutibilidade²⁰.
   NOTA: Este projeto do programa requer várias tentativas de obter pipetas otimizadas para o grampo de remendo IMM. Uma pipeta padrão tem pontas finas com uma forma cônica progressiva.
2. Insira um filamento de vidro dentro do puxador e puxe para obter quase duas pipetas de remendo idênticas de um filamento borossilicato.
3. Ajuste o programa quando as pipetas se tornarem inconsistentes entre os ciclos de puxar devido ao envelhecimento do filamento da caixa de aquecimento do puxador.
4. Posicione a pipeta dentro do polidor de pipeta e coloque a ponta perto do filamento sob a ampliação de 100x para poli-la.
5. Pressione o pedal do pé várias vezes para aquecer o filamento sem entupir ou danificar a curva da ponta.
6. Polonês até que as pipetas com resistência entre 25 e 35 MΩ sejam obtidas quando preenchidas com solução de pipeta baseada em TMA (TMA para hidróxido de tetrametilamônio, Tabela 4).
7. Tampas pré-incubadas (5 mm de diâmetro, 0,1 mm de espessura) com gelatina de 0,1% para reduzir a adesão mitoplasta e enxágüe-as com a solução de banho KCl (Tabela 5) antes de depositar a suspensão mitoplastia.
8. Prepare uma diluição crua misturando ~35 μL da suspensão mitoplastia concentrada com 500 μL da solução de banho KCl (Tabela 5) e coloque-a em tampas previamente colocadas em um poço de uma placa de 4 poços.
9. Incubar no gelo por 15 a 20 minutos para mitoplastos para sedimentos na mancha de cobertura.
10. Encha completamente a câmara de banho com ~50 μL da solução de banho KCl (Tabela 5).
11. Transfira um deslizamento com mitoplastos dentro da câmara usando pinças finas de microdisseção com uma ponta dobrada.
12. Organize a tampa na parte inferior da câmara. Não perfunda a câmara para manter os mitoplastos estáveis na tampa.
13. Escolha um mitoplasto não adesivo individual na forma de 8, escaneando o deslizamento sob o microscópio com um objetivo de 60x.
14. Carregue a pipeta com a solução de pipeta (~50 μL) e coloque-a no porta-pipetas.
15. Traga a pipeta para a solução de banho com um micromanipulador e aproxime-a logo acima do mitoplasto selecionado para chegar perto do IMM. O programa do amplificador dá a resistência da pipeta uma vez que está na solução de banho. Segure o potencial da membrana a 0 mV e aplique pulsos de 10 mV usando o comando de teste de membrana no programa do amplificador.
16. Aplique uma leve pressão negativa para criar rapidamente um gigaseal com o IMM (Figura 2B).
17. Levante a pipeta com o mitoplasto ligado para mantê-los longe da tampa para evitar a quebra da vedação devido à deriva da pipeta durante o experimento.
18. Compense os transitórios de capacitância perdida com o comando "teste de membrana" no programa do amplificador antes de testar toda a configuração mitoplastia para obter uma medição correta de capacitância (Cm) para a membrana mitoplasta após a invasão.
19. Aplique pulsos de tensão de curta duração (5-15 ms) (250-600 mV) com o programa do amplificador para romper o patch de membrana sob a pipeta de vidro e alcançar a configuração de mitoplasto inteiro (Figura 2C). A invasão bem sucedida é refletida pelo reaparecimento dos transitórios de capacitância.
20. Após a invasão, encaixe os transitórios de capacitância com a opção de teste de membrana do programa do amplificador para avaliar a capacitância da membrana (refletindo o tamanho do mitoplasto) e sua resistência de acesso Ra (refletindo a qualidade da configuração de mitoplasto total). Após a invasão, Ra deve estar entre 40 e 80 MΩ. Mitoplastos (2-6 μm de tamanho) usados para experimentos com grampos de remendo normalmente têm capacitâncias de membrana de 0,5-1,1 pF.
21. Imediatamente após o arrombamento, substitua a solução de banho KCl (Tabela 5) pela solução de banho HEPES (Tabela 6) iniciando a perfusão.
22. Aplique um protocolo de rampa de 850 ms projetado com o programa do amplificador, de -160 mV a +100 mV com intervalo de 5 s, mantendo o mitoplast a 0 mV. Este protocolo funciona para os estudos UCP1 ^6,7,15 e AAC⁵ (Figura 4 e Figura 5).
    NOTA: Recomenda-se que as medições de corrente H⁺ dependentes de UCP1 e AAC adquiram todos os dados eletrofisiológicos a 10 kHz e filtram a 1 kHz usando software adequado que conduz o amplificador e o digitalizador.

Resultados

O desenvolvimento da metodologia de grampo de remendo aplicado às mitocôndrias proporcionou o primeiro estudo direto do vazamento de H⁺ através do IMM e dos transportadores mitocondriais, UCP1 e AAC, responsáveis por isso. A análise eletrofisiológica dos vazamentos H⁺ dependentes de UCP1 e AAC pode fornecer um primeiro olhar da capacidade termogênica das mitocôndrias. A seção de resultados descreve os procedimentos padrão para medir o vazamento de H⁺ via UCP1 e AAC.

Discussão

Este artigo de método visa apresentar a técnica de grampo de remendo recentemente aplicada às mitocôndrias, uma nova abordagem para estudar diretamente o vazamento de H⁺ através do IMM responsável pela termogênese mitocondrial 5,6,7,15. Esta técnica não se limita aos tecidos e também pode ser usada para analisar vazamento de H⁺ e outras conduções do IMM em dife...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.1% gelatin	Millipore	ES-006-B
60X water immersion objective, numerical aperture 1.20	Olympus	UPLSAPO60XW
Axopatch 200B amplifier	Molecular Devices
Borosilicate glass capillaries	Sutter Instruments	BF150-86-10
Digidata 1550B Digitizer	Molecular Devices
Faraday cage	Homemade
French Press	Glen Mills	5500-000011
IKA Eurostar PWR CV S1 laboratory overhead stirrer
Inversed Microscope	Olympus	IX71 or IX73
Micro Forge	(Narishige)	MF-830
Micromanupulator MPC-385	Sutter Instruments	FG-MPC325
Microelectrode holder for agar bridge	World Precision Instruments	MEH3F4515
Micropipette Puller	(Sutter Instruments)	P97
Mini Cell for French Press	Glen Mills	5500-FA-004
MIXER IKA 6-2000RPM	Cole Parmer	EW-50705-50
Objective 100X magnification	Nikon  lens	MPlan 100/0.80 ELWD 210/0
pClamp 10	Molecular Devices
Perfusion chamber	Warner Instruments	RC-24E
Potter-Elvehjem homogenizer 10 ml	Wheaton	358039
Refrigerated centrifuge SORVALL X4R PRO-MD	Thermo Scientific	75 009 521
Small round glass coverslips: 5 mm diameter, 0.1 mm thickness	Warner Instruments	640700
Vibration isolation table	Newport	VIS3036-SG2-325A
Chemicals
D-gluconic acid	Sigma Aldrich	G1951
D-mannitol	Sigma Aldrich	M4125
EGTA	Sigma Aldrich	3777
HEPES	Sigma Aldrich	H7523
KCl	Sigma Aldrich	60128
MgCl2	Sigma Aldrich	63068
sucrose	Sigma Aldrich	S7903
TMA	Sigma Aldrich	331635
TrisBase	Sigma Aldrich	T1503
TrisCl	Sigma Aldrich	T3253