L’utilisation de la technique Patch-Clamp pour étudier la capacité thermogénique des mitochondries

Résumé

Cet article sur la méthode détaille les principales étapes de la mesure de la fuite H⁺ à travers la membrane mitochondriale interne avec la technique patch-clamp, une nouvelle approche pour étudier la capacité thermogénique des mitochondries.

Résumé

La thermogenèse mitochondriale (également connue sous le nom de découplage mitochondrial) est l’une des cibles les plus prometteuses pour augmenter la dépense énergétique afin de lutter contre le syndrome métabolique. Les tissus thermogéniques tels que les graisses brunes et beiges développent des mitochondries hautement spécialisées pour la production de chaleur. Les mitochondries d’autres tissus, qui produisent principalement de l’ATP, convertissent également jusqu’à 25% de la production totale d’énergie mitochondriale en chaleur et peuvent donc avoir un impact considérable sur la physiologie de tout le corps. La thermogenèse mitochondriale est non seulement essentielle pour maintenir la température corporelle, mais prévient également l’obésité induite par l’alimentation et réduit la production d’espèces réactives de l’oxygène (ROS) pour protéger les cellules des dommages oxydatifs. Étant donné que la thermogenèse mitochondriale est un régulateur clé du métabolisme cellulaire, une compréhension mécaniste de ce processus fondamental aidera au développement de stratégies thérapeutiques pour lutter contre de nombreuses pathologies associées au dysfonctionnement mitochondrial. Il est important de noter que les mécanismes moléculaires précis qui contrôlent l’activation aiguë de la thermogenèse dans les mitochondries sont mal définis. Ce manque d’information est en grande partie dû à une pénurie de méthodes pour la mesure directe des protéines de découplage. Le développement récent de la méthodologie patch-clamp appliquée aux mitochondries a permis, pour la première fois, l’étude directe du phénomène à l’origine de la thermogenèse mitochondriale, de la fuite H⁺ à travers l’IMM, et de la première caractérisation biophysique des transporteurs mitochondriaux qui en sont responsables, la protéine de découplage 1 (UCP1), spécifique des graisses brunes et beiges, et le transporteur ADP/ATP (AAC) pour tous les autres tissus. Cette approche unique fournira de nouvelles informations sur les mécanismes qui contrôlent les fuites H⁺ et la thermogenèse mitochondriale et sur la façon dont ils peuvent être ciblés pour lutter contre le syndrome métabolique. Cet article décrit la méthodologie patch-clamp appliquée aux mitochondries pour étudier leur capacité thermogénique en mesurant directement les courants H⁺ à travers l’IMM.

Introduction

Les mitochondries sont célèbres pour être la centrale électrique de la cellule. En effet, ils sont la principale source d’énergie chimique, l’ATP. Ce que l’on sait moins, c’est que les mitochondries génèrent également de la chaleur. En fait, chaque mitochondrie génère constamment les deux types d’énergies (ATP et chaleur) et un équilibre fin entre les deux formes d’énergie définit l’homéostasie cellulaire métabolique (Figure 1). Comment les mitochondries distribuent l’énergie entre l’ATP et la chaleur est certainement la question la plus fondamentale dans le domaine de la bioénergétique, bien qu’elle soit encore largement inconnue. Nous savons que l’augmentation de la production de chaleur mitochondriale (appelée thermogenèse mitochondriale) et, par conséquent, la réduction de la production d’ATP augmentent la dépense énergétique et c’est l’un des meilleurs moyens de lutter contre le syndrome métabolique¹.

La thermogenèse mitochondriale provient d’une fuite de H⁺ à travers la membrane mitochondriale interne (IMM), conduisant au découplage de l’oxydation du substrat et de la synthèse de l’ATP avec la production conséquente de chaleur, d’où le nom de « découplage mitochondrial »¹ (Figure 1). Cette fuite H⁺ dépend de transporteurs mitochondriaux appelés protéines de découplage (UCP). UCP1 a été le premier UCP identifié. Il n’est exprimé que dans les tissus thermogéniques, la graisse brune et la graisse beige dans lesquels les mitochondries sont spécialisées pour la production de chaleur ^2,3,4. L’identité de l’UCP dans les tissus non adipeux tels que les muscles squelettiques, le cœur et le foie est restée controversée. Les mitochondries dans ces tissus peuvent avoir environ 25% de l’énergie mitochondriale totale convertie en chaleur, ce qui peut avoir un impact significatif sur la physiologie de tout le corps¹. En plus de maintenir la température corporelle centrale, la thermogenèse mitochondriale prévient également l’obésité induite par l’alimentation en réduisant les calories. De plus, il réduit la production d’espèces réactives de l’oxygène (ROS) par les mitochondries pour protéger les cellules des dommages oxydatifs¹. Ainsi, la thermogenèse mitochondriale est impliquée dans le vieillissement normal, les troubles dégénératifs liés à l’âge et d’autres conditions impliquant un stress oxydatif, telles que l’ischémie-reperfusion. Par conséquent, la thermogenèse mitochondriale est un puissant régulateur du métabolisme cellulaire, et une compréhension mécaniste de ce processus fondamental favorisera le développement de stratégies thérapeutiques pour lutter contre de nombreuses pathologies associées au dysfonctionnement mitochondrial.

La respiration mitochondriale a été la première technique à révéler le rôle crucial de la thermogenèse mitochondriale dans le métabolisme cellulaire et reste la plus populaire dans la communauté¹. Cette technique est basée sur la mesure de la consommation d’oxygène par la chaîne de transport d’électrons mitochondriaux (ETC) qui augmente lorsque la fuite mitochondriale H⁺ est activée. Cette technique, bien qu’instrumentale, ne peut pas étudier directement la fuite mitochondriale H⁺ à travers l’IMM¹, ce qui rend difficile l’identification et la caractérisation précises des protéines qui en sont responsables, en particulier dans les tissus non adipeux dans lesquels la production de chaleur est secondaire par rapport à la production d’ATP. Récemment, le développement de la technique patch-clamp appliquée aux mitochondries a fourni la première étude directe de la fuite H⁺ sur l’ensemble de l’IMM dans divers tissus ^5,6,7.

Le patch-clamp mitochondrial de l’ensemble de l’IMM a été établi pour la première fois de manière reproductible par Kirichok et ^al.8. Ils ont décrit la première mesure directe des courants mitochondriaux d’uniporteur de calcium (MCU) en 2004 à l’aide de mitoplastes des lignées cellulaires COS-7⁸. Plus tard, le laboratoire Kirichok a montré les courants de calcium des IMM de souris⁹ et des tissus de la drosophile ⁹. D’autres laboratoires utilisent maintenant régulièrement cette technique pour étudier les propriétés biophysiques du MICROCONTRÔLEUR 10,11,12,13,14. L’analyse complète de la conductance du potassium et du chlorure par patch-clamp IMM est également possible et a été mentionnée dans plusieurs articles, mais n’a pas encore fait l’objet principal d’une publication ^6,7,9. La première mesure des courants H⁺ à travers l’IMM a été rapportée en 2012 à partir de mitochondries de graisse brune^{de souris 6}, et de mitochondries de graisse beige de souris en 2017⁷. Ce courant est dû à la protéine de découplage spécifique des tissus thermogéniques, UCP1 ^6,7. Des travaux récents publiés en 2019 ont caractérisé la CAA comme la principale protéine responsable de la fuite mitochondriale de H⁺ dans les tissus non adipeux tels que le cœur et le muscle squelettique⁵.

Cette approche unique permet maintenant l’analyse fonctionnelle directe à haute résolution des canaux ioniques mitochondriaux et des transporteurs responsables de la thermogenèse mitochondriale. Pour faciliter l’expansion de la méthode et compléter d’autres études telles que la respiration mitochondriale, un protocole détaillé est décrit ci-dessous pour mesurer les courants H⁺ transportés par UCP1 et AAC. Trois étapes importantes sont décrites : 1) isolement mitochondrial de la graisse brune de souris pour analyser le courant H⁺ dépendant de l’UCP1 et isolement mitochondrial du cœur pour analyser le courant H⁺ dépendant de l’AAC, 2) préparation des mitoplastes avec une Français Pression pour la rupture mécanique de la membrane mitochondriale externe (OMM), 3) enregistrements patch-clamp des courants UCP1 et AAC-dépendants H⁺ sur l’ensemble de l’IMM.

Protocole

Toutes les procédures expérimentales sur les animaux qui ont été effectuées sont conformes aux directives des National Institutes of Health et ont été approuvées par le Comité institutionnel de soins et d’utilisation des animaux de l’Université de Californie à Los Angeles (IACUC).

REMARQUE: La procédure d’isolement mitochondrial est basée sur la centrifugation différentielle et varie légèrement d’un tissu à l’autre. Par exemple, comme le tissu adipeux brun est extrêmement riche en lipides, il nécessite une étape supplémentaire pour séparer les débris cellulaires et les organites de la phase lipidique avant de récolter les mitochondries. Pour éviter toute confusion, les deux procédures d’isolement mitochondrial (l’une de la graisse brune et l’autre du cœur) sont détaillées ci-dessous.

1. Isolement mitochondrial de la graisse brune interscapulaire de souris (modifié à partir de Bertholet et al. 2020)¹⁵

1. Euthanasier la souris mâle C57BL/6 en utilisant l’asphyxie au CO₂ et la luxation cervicale subséquente, comme recommandé par le panel de l’American Veterinary Medical Association et le comité de l’IACUC.
2. Après avoir positionné la souris avec son ventre face à la table, vaporisez de l’alcool pour nettoyer et mouiller les cheveux (modifié à partir de Mann et al., 2014)¹⁶.
3. Faites une incision de 2 cm dans le haut du dos après avoir saisi la peau avec une pince à épiler.
4. Extraire la graisse interscapulaire brune de la souris qui correspond à un organe à deux lobes avec une forme de papillon¹⁶.
5. Transférer la graisse brune dans une boîte de Petri de 35 mm remplie de 5 mL de tampon d’isolement à froid (tableau 1) préalablement placée sur de la glace.
6. Nettoyez la graisse brune de la graisse blanche sous une jumelle.
7. Transférer la graisse brune dans un bécher de 10 mL avec 5 mL de tampon d’isolation à froid (tableau 1) pour la couper en morceaux minces. Transférer dans l’homogénéisateur de verre de 10 mL réfrigéré à la glace (pilon en polytétrafluoroéthylène (PTFE) en matière plastique).
8. Utilisez un agitateur aérien pour homogénéiser le tissu prédécoupé sur la glace avec six coups doux à une vitesse contrôlée de 275 rotations / min.
9. Centrifuger l’homogénat à 8 500 x g pendant 10 min à 4 °C dans un tube conique glacé de 15 mL. Jeter le surnageant contenant la phase lipidique.
10. Remettre en suspension la pastille dans 5 mL de tampon d’isolation glacé (tableau 1) et homogénéiser, une deuxième fois, la suspension sur glace à six coups lents à une vitesse de rotation de 275/min.
11. Transférer l’homogénat dans un tube conique glacé de 15 mL et le centrifuger à 700 x g pendant 10 min à 4 °C pour granuler tous les noyaux et cellules ininterrompues.
12. Recueillir le surnageant dans un tube frais de 15 ml et le placer sur de la glace.
13. Centrifuger le surnageant à 8 500 x g pendant 10 min à 4 °C pour obtenir une pastille contenant des mitochondries.
14. Remettre en suspension la pastille contenant des mitochondries dans 3,8 mL de tampon hypertonique-mannitol glacé (tableau 2) et incuber la suspension mitochondriale sur de la glace pendant 10 à 15 min.

2. Isolement mitochondrial du cœur de la souris (modifié à partir de Garg et al. 2019)¹⁷

1. Euthanasier la souris mâle C57BL/6 en utilisant l’asphyxie au CO₂ et la luxation cervicale subséquente, comme recommandé par le panel de l’American Veterinary Medical Association et le comité de l’IACUC.
2. Après avoir positionné la souris sur le dos, vaporisez de l’alcool pour nettoyer et mouiller les cheveux. Ensuite, faites une incision de 2 cm sur le thorax après avoir saisi la peau avec une pince à épiler.
3. Disséquer le cœur de la poitrine de l’animal et le rincer pour enlever tout le sang dans un bécher de 10 mL avec 5 mL de la solution d’isolement à froid (tableau 1).
4. Une fois que le cœur a été débarrassé des traces de sang, transférez-le dans un autre bécher de 10 mL contenant 5 mL de tampon d’isolement à froid (tableau 1) pour le couper en morceaux minces. Ensuite, transférer dans un homogénéisateur en verre de 10 mL réfrigéré à la glace (pilon PTFE).
5. Utilisez un agitateur aérien pour homogénéiser le tissu prédécoupé sur la glace avec six coups doux à une vitesse contrôlée de 275 rotations / min.
6. Transférer l’homogénat dans un tube conique glacé de 15 mL et le centrifuger à 700 x g pendant 10 min à 4 °C pour les granuler dans les noyaux de granulés et les cellules ininterrompues.
7. Recueillir le surnageant dans un tube frais de 15 ml et le placer sur de la glace.
8. Centrifuger le surnageant à 8 500 x g pendant 10 min à 4 °C pour obtenir une pastille contenant des mitochondries.
9. Remettre en suspension la pastille mitochondriale dans 3,8 mL de tampon hypertonique-mannitol glacé (tableau 2) et incuber la suspension mitochondriale sur de la glace pendant 10 à 15 min.

3. Préparation des mitoplastes avec une presse Français pour rupture mécanique de l’OMM.

REMARQUE : La procédure de presse Français permet de libérer l’IMM de l’OMM avec son intégrité préservée, y compris la matrice et le crista (Figure 2)¹⁸. Les mitochondries sont pré-incubées dans un tampon hypertonique-mannitol (tableau 2) et soumises à une pression plus faible pendant la procédure de presse Français pour éviter tout étirement drastique de l’IMM lorsque l’OMM est rompu.

1. Remplissez la suspension mitochondriale-hypertonique-mannitol dans une mini-cellule de pression réfrigérée (diamètre du piston 3/8 ») de la presse Français (Figure 3A).
2. Sélectionnez le mode Moyen de la Français Appuyez et comprimez la suspension à travers la mini cellule de pression à 110 sur le cadran de la Français Pressez pour les mitochondries de graisse brune et à 140 pour les mitochondries cardiaques (~2 000 psi).  Assurez-vous que la suspension sort de la mini cellule de pression à une vitesse d’environ 1 goutte / s.
3. Recueillir les gouttes dans un tube conique glacé de 15 mL.
4. Centrifuger la suspension à 10 500 x g pendant 10 min à 4 °C.
5. Remettre en suspension la pastille de mitoplastes dans 0,5 à 2 mL de tampon hypertonique-KCl glacé (tableau 3) et conserver la suspension sur de la glace.
   REMARQUE: Les mitoplastes de graisse brune et de cœur sont prêts pour les enregistrements de patch-clamp et devraient rester utilisables pendant environ 3-6 h.

4. Enregistrements électrophysiologiques des fuites H⁺ à travers UCP1 et AAC ^5,7,15

REMARQUE: Utilisez la configuration électrophysiologique suivante (Figure 3B): microscope inversé avec contraste d’interférence différentielle (DIC), objectif d’immersion dans l’eau 60x, table d’isolation des vibrations et cage de Faraday, amplificateur standard prenant en charge les enregistrements à faible bruit, numériseur standard utilisé pour la configuration électrophysiologique, pClamp 10, micromanipulateur, électrode de référence de bain (pont de sel KCl-agar de 3 M inséré dans un support de microélectrode contenant une pastille d’argent / chlorure d’argent moulée dans le corps du support (décrit dans Liu et al. 2021)¹⁹, chambre de perfusion avec un fond de couvercle en verre de 0,13 mm, relié à un système de perfusion alimenté par gravité.

1. Tirez les filaments de verre borosilicate le jour de l’enregistrement à l’aide d’un extracteur de micropipette. Réglez un programme sur l’extracteur utilisé pour générer des pipettes avec un haut degré de reproductibilité²⁰.
   REMARQUE: Cette conception de programme nécessite plusieurs tentatives pour obtenir des pipettes optimisées pour la pince de patch IMM. Une pipette standard a des pointes fines avec une forme conique progressive.
2. Insérez un filament de verre dans l’extracteur et tirez pour obtenir presque deux pipettes de patch identiques à partir d’un filament borosilicate.
3. Ajustez le programme lorsque les pipettes deviennent incohérentes entre les cycles de traction en raison du vieillissement du filament de la boîte chauffante de l’extracteur.
4. Placez la pipette à l’intérieur de la polisseuse à pipette et placez la pointe près du filament sous un grossissement de 100x pour la polir au feu.
5. Appuyez plusieurs fois sur la pédale pour chauffer le filament sans obstruer ou endommager la courbe de pointe.
6. Polir jusqu’à ce que des pipettes ayant une résistance comprise entre 25 et 35 MΩ soient obtenues lorsqu’elles sont remplies d’une solution de pipette à base de TMA (TMA pour l’hydroxyde de tétraméthylammonium, tableau 4).
7. Pré-incuber des couvercles (5 mm de diamètre, 0,1 mm d’épaisseur) avec 0,1% de gélatine pour réduire l’adhérence du mitoplast et les rincer avec la solution de bain KCl (Tableau 5) avant de déposer la suspension de mitoplast.
8. Préparer une dilution brute en mélangeant ~35 μL de la suspension de mitoplast concentrée avec 500 μL de la solution de bain KCl (tableau 5) et placez-la sur des couvercles préalablement placés dans un puits d’une plaque à 4 puits.
9. Incuber sur de la glace pendant 15 à 20 min pour que les mitoplastes sédimentent sur la couche de couverture.
10. Remplissez complètement la chambre de bain avec environ 50 μL de la solution de bain KCl (tableau 5).
11. Transférer un couvercle avec des mitoplastes à l’intérieur de la chambre à l’aide d’une pince à microdissection mince avec une pointe pliée.
12. Disposez le couvercle au bas de la chambre. Ne perfuser pas la chambre pour garder les mitoplastes stables sur le couvercle.
13. Choisissez un mitoplaste individuel non adhésif de la forme de 8 en scannant le couvercle sous le microscope avec un objectif 60x.
14. Chargez la pipette avec la solution de pipette (~50 μL) et placez-la dans le porte-pipette.
15. Apportez la pipette dans la solution de bain avec un micromanipulateur et approchez-la juste au-dessus du mitoplast sélectionné pour vous rapprocher de l’IMM. Le programme d’amplification donne la résistance de la pipette une fois qu’elle est dans la solution de bain. Maintenez le potentiel de la membrane à 0 mV et appliquez des impulsions de 10 mV à l’aide de la commande de test de membrane dans le programme d’amplification.
16. Appliquez une légère pression négative pour créer rapidement une gigaseal avec l’IMM (Figure 2B).
17. Soulevez la pipette avec le mitoplast attaché pour les tenir à l’écart du couvercle afin d’éviter la rupture du joint due à la dérive de la pipette pendant l’expérience.
18. Compenser les transitoires de capacité parasites avec la commande « test de membrane » dans le programme d’amplification avant de tester la configuration de l’ensemble du mitoplast pour obtenir une mesure correcte de la capacité (Cm) pour la membrane mitoplast après l’effraction.
19. Appliquez des impulsions de tension de courte durée (5-15 ms) (250-600 mV) avec le programme d’amplification pour rompre le patch membranaire sous la pipette en verre et obtenir la configuration du mitoplast entier (Figure 2C). Le rodage réussi se reflète dans la réapparition de transitoires de capacité.
20. Après l’effraction, équipez les transitoires de capacité avec l’option de test de membrane du programme d’amplification pour évaluer la capacité de la membrane (reflétant la taille du mitoplast) et sa résistance d’accès Ra (reflétant la qualité de la configuration du mitoplast entier). Après l’effraction, Ra doit être compris entre 40 et 80 MΩ. Les mitoplastes (de 2 à 6 μm) utilisés pour les expériences de patch-clamp ont généralement des capacités membranaires de 0,5 à 1,1 pF.
21. Immédiatement après l’effraction, remplacer la solution de bain KCl (tableau 5) par la solution de bain HEPES (tableau 6) en démarrant la perfusion.
22. Appliquez un protocole de rampe de 850 ms conçu avec le programme amplificateur, de -160 mV à +100 mV avec un intervalle de 5 s, tout en maintenant le mitoplaste à 0 mV. Ce protocole fonctionne pour les études UCP1 ^6,7,15 et AAC⁵ (Figure 4 et Figure 5).
    REMARQUE: Il est recommandé pour les mesures de courant H⁺ dépendant de l’UCP1 et de l’AAC d’acquérir toutes les données électrophysiologiques à 10 kHz et de filtrer à 1 kHz à l’aide d’un logiciel adéquat pilotant l’amplificateur et le numériseur.

Résultats

Le développement de la méthodologie patch-clamp appliquée aux mitochondries a fourni la première étude directe de la fuite H⁺ à travers l’IMM et les transporteurs mitochondriaux, UCP1 et AAC, qui en sont responsables. L’analyse électrophysiologique des fuites H⁺ dépendantes de l’UCP1 et de l’AAC peut fournir un premier aperçu de la capacité thermogénique des mitochondries. La section des résultats décrit les procédures standard pour mesurer ^{les fuites H+} via UCP1 et ...

Discussion

Cet article sur la méthode vise à présenter la technique patch-clamp récemment appliquée aux mitochondries, une nouvelle approche pour étudier directement la fuite H⁺ à travers l’IMM responsable de la thermogenèse mitochondriale ^5,6,7,15. Cette technique ne se limite pas aux tissus et peut également être utilisée pour analyser les fuites H⁺ et d’autres condu...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.1% gelatin	Millipore	ES-006-B
60X water immersion objective, numerical aperture 1.20	Olympus	UPLSAPO60XW
Axopatch 200B amplifier	Molecular Devices
Borosilicate glass capillaries	Sutter Instruments	BF150-86-10
Digidata 1550B Digitizer	Molecular Devices
Faraday cage	Homemade
French Press	Glen Mills	5500-000011
IKA Eurostar PWR CV S1 laboratory overhead stirrer
Inversed Microscope	Olympus	IX71 or IX73
Micro Forge	(Narishige)	MF-830
Micromanupulator MPC-385	Sutter Instruments	FG-MPC325
Microelectrode holder for agar bridge	World Precision Instruments	MEH3F4515
Micropipette Puller	(Sutter Instruments)	P97
Mini Cell for French Press	Glen Mills	5500-FA-004
MIXER IKA 6-2000RPM	Cole Parmer	EW-50705-50
Objective 100X magnification	Nikon  lens	MPlan 100/0.80 ELWD 210/0
pClamp 10	Molecular Devices
Perfusion chamber	Warner Instruments	RC-24E
Potter-Elvehjem homogenizer 10 ml	Wheaton	358039
Refrigerated centrifuge SORVALL X4R PRO-MD	Thermo Scientific	75 009 521
Small round glass coverslips: 5 mm diameter, 0.1 mm thickness	Warner Instruments	640700
Vibration isolation table	Newport	VIS3036-SG2-325A
Chemicals
D-gluconic acid	Sigma Aldrich	G1951
D-mannitol	Sigma Aldrich	M4125
EGTA	Sigma Aldrich	3777
HEPES	Sigma Aldrich	H7523
KCl	Sigma Aldrich	60128
MgCl2	Sigma Aldrich	63068
sucrose	Sigma Aldrich	S7903
TMA	Sigma Aldrich	331635
TrisBase	Sigma Aldrich	T1503
TrisCl	Sigma Aldrich	T3253