使用双氟比度显微镜测量巨无素体的pH值、重度化学和降解能力

摘要

我们描述了测量活细胞中单个巨细胞体中的pH值、氧化事件和蛋白质消化的方案。强调双氟比显微镜及其提供的优势，而不是基于人群的技术。

摘要

近年来，巨脊细胞病领域发展迅速。巨脊细胞增多已成为先天免疫细胞维持有机体平衡和免疫的中心机制。同时，与其家庭静止作用相反，它也可以驱动各种病理学，包括癌症和病毒感染。与其他内分泌模式不同，为研究巨细胞体成熟性而开发的工具仍然不发达。在这里，协议描述了新开发的工具，用于研究早期和成熟的巨皮诺体的流明中的氧化物环境。介绍了在评估pH值、活性氧物种的产生以及活细胞中单个巨细胞的流明内的降解能力时使用比例荧光显微镜的方法。单个细胞器测量具有揭示空间异质性的优势，而空间异质性往往因基于人口的方法而消失。强调双荧光比显微镜的基本原则，包括探头选择、仪器、校准和单细胞对人群的方法。

引言

巨细胞增多症是指将大量细胞外液体吸收到膜结合的细胞质细胞体中，称为巨细胞体^1、2。这是一个高度保守的过程，由自由生活的单细胞生物，如阿米巴Dictyostelium孢子执行。^3，以及安托佐安⁴和元子^2。在大多数细胞中，巨脊细胞增多是一种诱发事件。细胞表面受体的结合诱导了作用素驱动的等离子膜延伸（称为褶皱）的突出。其中一小部分褶皱，通过一些不为人知的机制，密封在他们的远角提示形成巨无边（虽然超出了本方法论文的范围，对巨脊细胞增多的机制进行详细审查，请参阅参考文献^{1，2，5，6，7）。}细胞外刺激诱导巨脊细胞增多，往往是可溶性生长因子^5，8。因此，宏脊细胞事件允许摄入细胞外物质，细胞可以从中获得有用的代谢物，以促进生长。不幸的是，这种营养输送途径也可以驱动病理学。某些癌细胞会产生突变，导致持续或构成性巨脊细胞增多。营养物质的连续输送有助于癌细胞不受控制的增殖，并且与特别具有攻击性的肿瘤^{9、10、11、12、13}有关。同样，病毒可以诱导巨脊细胞增多，从而获得宿主细胞，从而推动病毒病理学^14。

巨脊细胞增多症也起到维持对病原体免疫力的作用。某些先天免疫细胞，如巨噬细胞和树突状细胞，通过巨细胞细胞增多症^{6、15、16进行}细胞外液体的构成和侵略性采样。这种巨细胞细胞增多的模式是令人难以置信的活跃，一个单一的树突状细胞可以吞噬自己与细胞外液体的体积相当于它自己的重量每小时^17。尽管有这种构成采样，巨噬细胞和树突状细胞并没有像肿瘤细胞那样无法控制地复制，相反，它们似乎处理细胞外物质的方式可以提取信息，以告知存在或确实不存在潜在威胁。信息提取为 i） 病原体相关的分子模式，可以通过细胞内病原体识别受体和 ii） 短段氨基酸，可以加载到主要组织相容性分子上，由自适应免疫系统的细胞筛选^{16，18，19。}病原体是否颠覆了免疫细胞信息处理的途径，目前尚不清楚。

尽管这些定义明确和关键的作用，为宏脊柱侧体在维持免疫力和平衡，与其他更常见的研究模式的内分泌，很少的宏观皮诺索的内部（发光）工作是已知的。开发标准化的协议和工具来研究巨脊质素的发光生物化学，不仅有助于我们更好地了解它们独特的生物学，而且将提供见解，可用于新的治疗策略，包括药物输送^20。这种方法手稿将侧重于最近开发的工具，在单一细胞层解剖巨细胞素的发光生物化学的各个方面。

荧光素可用于测量细胞器的特定生物化学，如果 i） 它们优先划分到兴趣隔间和/或 ii） 它们根据兴趣参数进行光谱变化。例如，在 pH 的情况下，荧光弱碱基，如青紫橙、新月紫罗兰和莱索跟踪染料优先积聚在酸性有机体中。因此，它们的相对强度是标记的细胞器是酸性的粗略迹象。其他pH响应荧光素，如荧光素、pHrodo和环丙烯，在与质子结合时会发生光谱变化（图1A-C）。因此，对pH敏感的荧光素的荧光发射的变化可以提供pH值的有用近似值。然而，单氟的使用存在一些缺点。例如，焦点平面的变化、光模糊和单个细胞体积的变化，在巨细胞体²¹中很常见，可诱发单个荧光素的荧光强度变化，而这不能轻易纠正^为22。因此，单波长评估虽然有助于可视化酸性隔间，但纯粹是定性的。

更定量的方法是瞄准参数敏感的荧光，以及参考荧光素到感兴趣的细胞器。参考荧光对细胞内的生化变化（图1D-F）理想情况下不敏感，因此可用于纠正焦点平面、风琴体积的变化，以及在某种程度上光出血^23。使用这种称为双荧光比的方法，可以通过生成参数敏感荧光的荧光排放与参考荧光的比例来实现校正。

在这里，协议将利用双氟比度成像原理来测量大皮诺索体内的pH值、氧化事件和蛋白质降解。在每种情况下，都会选择对兴趣参数和参考氟磷敏感的荧光素。为了将荧光素专门针对巨皮诺索，它们将共价耦合到70kDa dextran，优先地整合到大皮诺索²⁴中。所有检测将在 Raw264.7 细胞中执行，但可以适应其他细胞类型。在可能的情况下，荧光比将根据参考曲线校准以获得绝对值。重要的是，所有测量将在活细胞中进行，以便对巨细胞体的亮度环境进行动态和定量评估。

在选择pH敏感荧光时，必须权衡一些考虑因素。第一个是荧光素的pK_a，它表示探测器最敏感的pH值范围。如果假定在形成后不久，巨氨酸体的pH值将接近细胞外介质（+pH 7.2），并且它将通过与晚期内分泌体和溶酶体（+pH 5.0）的相互作用逐渐酸化，那么应选择具有pK_a的探针，该探针在该范围内是敏感的（图2C）。氟氟素的pK_a为6.4，在这个范围内具有最佳敏感性。它已被广泛用于测量其他类似的细胞器，如噬菌体，并将成为荧光在这份手稿^22，25选择。作为氟的参考，将使用四甲基钠胺，这是麻木不仁的pH值（图1E）。其他氟，如普罗多和环丙烯可以替代荧光素，其中荧光素的光谱特性确实与其他实验变量匹配。一些建议参考氟为 pHrodo 和环孢子 5e 显示在图 1中。

第二个考虑因素是将这两种荧光素专门针对巨皮诺体的方法。70 kDa大小的Dextran，其水动力学半径约为7纳米，不粘在细胞上，并纳入巨无霸，但不是单体涂层坑或洞穴，因此标记巨无霸（图2A和图3A，B）16，24，26。在本协议中，荧光素标签的 70 kDa dextran 和四甲基钠 （TMR） 标记的 70 kDa dextran 将分别用作 pH 敏感和参考探头。

在先天免疫细胞中，巨脊细胞增多和噬菌体病是外源物质内化加工和随后向适应性^{免疫反应细胞}呈现的两条主要途径。对噬菌体和巨皮诺体流明的氧化化学进行仔细和协调的控制，对于外源材料的上下文特定处理至关重要。也许在噬菌体中研究最充分的氧化事件调节器是NADPH氧化酶，这是一种大型多亚子综合体，在噬菌体²⁸的流明内产生大量的活性氧物种（ROS）。事实上，其活性是适当抗原处理在噬菌体^29，30的核心。然而，尚未探索大皮诺体膜上NADPH氧化酶的活性。

在此协议中，H2DCFDA 苏奇尼米尔酯用于测量宏皮诺体内的氧化事件。这是一种经过改良的荧光素（2'，7'-二氯二氢氟氯乙烯二甲酸酯），其减少形式是极小的荧光。氧化后，其荧光排放显著增加。然而，值得注意的是，H2DCFDA的一个重要警告 - 因为它是基于荧光素，它的荧光也淬火在酸性隔间，并必须注意控制这个变量时，设计实验^28。与pH值测量方法类似，H2DCFDA苏奇尼米尔酯将共价连接到70kDa dextran，TMR标签的70kDa dextran将用作参考氟（图3A）。

荧光椭圆蛋白将用于测量宏皮诺索体内的蛋白质降解。这里使用的椭圆形布明被密集地标有自淬火的 4，4-二氟-4 波拉-3a，4a-迪亚扎-s-indacene （BODIPY） FL 染料。消化后，强荧光染料标签肽被解放。由于椭圆形布明不能轻易结合到 70 kDa dextran，带有 TMR 标记为 70 kDa dextran 的细胞和流体相椭圆形布明将共同孵育。TMR 信号将用于在成像后分析期间生成宏氨对数面膜，从消化的椭圆形布明中释放的信号将在掩膜内测量（图 3B）。

研究方案

1. 细胞制备

1. 在 37 °C 下生长 Raw264.7 细胞，在 RPMI 中生长 5% CO₂ 至 70% 的汇合，辅以 10% 热灭活血清。
2. 在检测前一天，种子 Raw264.7 细胞的密度为 5 x 10⁴ 细胞，每井在 96 井板。确保每口井都含有 100 μL 的生长介质。确保 96 井板有黑色侧面和玻璃底进行成像。
   注:这里，96井板用于成像。96井板允许使用相对于较大的成像室的少量细胞和试剂。但是，可以使用任何专为成像活细胞设计的腔室，并相应地放大试剂。
3. 在检测当天，检查油井是否至少为 70% 的汇流。

2. 测量巨氨糖体 pH 值

1. 准备第 1 节中的单元格。
2. 在 37 °C 下用 100 微升 HBSS 清洗所有油井。
3. 每口井均加满 100 微升 HBSS，含 0.025 毫克/mL TMR 标签的 70 kDa dextran 和 0.025 毫克/毫升荧光素标签 70 kDa dextran。
4. 将细胞放入设置为 37 °C 的孵化器中 15 分钟。
5. 从孵化器中取出细胞，用 100 微升 HBSS 将细胞洗 6 倍。
6. 在 37 °C 下用 100 微升的 HBSS 填充每口井。
7. 将板放在显微镜上，加热舞台和室。
8. 根据需要调整每个荧光的激发/发射参数。
   注:使用荧光片和单独的显微镜设置，图像采集的理想条件会有所不同。在这里，图像是在莱卡SP5激光扫描共聚焦显微镜上获得的。TMR 对 543 激光线感到兴奋，发射量从 610 nm 收集到 650 nm。荧光素对488激光线感到兴奋，发射量从500纳米收集到550纳米。使用了 63 倍的浸油目标，并以 0.5 μm 间隔获得了 10 μm Z 体积。
9. 从每口井中获取图像，在每口井之间的荧光之间交替。
10. 首次收购后，检查整个板块是否所有油井都保持集中。
11. 以所需的时间长度以 1-15 分钟间隔获取每口井的图像。

3. 大皮诺体pH值的 原位 校准

1. 在图像采集过程中，准备 1 L 富含钾 （K⁺富） 溶液，其中含有 140 mM KCl、1 mM MgCl_2、1mM CaCl₂和 5 mM 葡萄糖。用 25 m HEPES（从 1 M、pH 7.2 库存溶液中）和单独的 400 mL 体积与 25 m MES（从 0.5 M、pH 6.0 库存溶液）补充 K⁺富丽的溶液的 400 mL 体积。
2. 根据需要，使用 10 M HCl 或 10 M KOH 将 25mM HEPES 缓冲的 K⁺富含溶液的 50 mL aliquot 调整为 pH 7.5。
3. 根据需要，使用 10 M HCl 或 10 M KOH 调整三个独立的 50 mL 的 K⁺富资源解决方案，缓冲 25mM MES 至 pH 6.5、pH 5.5 和 pH 5.0。
   注意:醋酸-醋酸缓冲液可能更适合低pH解决方案。
4. 图像采集完成后，从包含电池的 96 井板中取出 HBS，代之以 pH 7.5 的 K⁺富含溶液。
5. 将尼古丁添加到 10 μg/mL 的最终浓度中。
   注:尼日尔辛是一个电离子体，交换K⁺ H⁺。通过将 K⁺ 富集溶液的 K⁺浓度设置为接近细胞溶胶 K⁺ 浓度值，可以确保尼贾尼辛将巨氨酸素的 pH 夹紧到细胞醇的 pH 值，而细胞醇又反映了校准缓冲器的 pH 值。
6. 将板放回显微镜上，使用与上述相同的采集设置获取每口井的图像。
7. 每个校准缓冲区重复步骤 3.5 和 3.6。

4. 宏皮奥体pH值的数据分析

1. 使用 FIJI 软件，从 TMR 和荧光素通道减去背景。
2. 在 TMR 通道上生成掩码。要生成掩码，请通过选择 "调整>阈值>应用"将图像转换为二进制图像。接下来，突出二进制图像，并选择 编辑>选择>创建掩码。
3. 将其应用于 TMR 和荧光素图像。为此，突出显示屏蔽并选择 编辑>选择>创建选择。单击 TMR 图像并按 移位 + E 将面膜应用到 TMR 通道。同样，单击荧光素图像并按 移位 + E 将面膜应用到 OB 通道。
4. 记录口罩内每个宏皮质体的 TMR 和荧光素强度。
5. 从时间过程开始，每次时间点重复步骤 4.1-4.3。
6. 重复步骤 4.1-4.3，用于现场校准 中捕获的 图像。
7. 将荧光素强度除以 TMR 强度以生成荧光素:TMR 比率。
8. 将 pH 值与荧光素对比绘制:校准图像的 TMR 比率。
9. 将曲线与校准数据相配合。
10. 将时间过程中每个时间点的数据进行国际交互，以获得绝对 pH 值。

5. 测量巨噬体中的氧化事件

1. 准备第 1 节中的单元格。
2. 在检测前一天，准备H2DCFDA苏奇尼米尔酯标记70kDa dextran通过重新暂停10毫克70千达德克斯特拉氨基在1 mL 0.1M碳酸氢钠溶液（pH 8.3）。将 1 毫克的 H2DCFDA 苏奇尼米尔酯添加到德克斯特兰-氨基溶液中，孵育 1 小时。调和 H2dcfda 标签 70 kda 德克斯特兰对 Pbs 。不要存储超过 1 天，因为 H2DCFDA 标记的 70 kDa dextran 会在存储时氧化。
3. 在检测当天，在 37 °C 下用 100 μL 的 HBSS 清洗所有油井。
4. 每口井均加满 100 微升 HBSS，内含 0.025 毫克/mL TMR 标签的 70 kDa dextran 和 0.025 毫克/毫升的 H2DCFDA 标签 70 kDa dextran。
5. 将细胞放入设置为 37 °C 的孵化器中 15 分钟。
6. 从孵化器中取出细胞，用 100 μL 的 HBSS 将细胞洗 6 倍。
7. 在 37 °C 下用 100 微升的 HBSS 填充每口井。
8. 将板放在显微镜上加热阶段和腔室，并根据需要调整每个荧光片的激发/发射参数。
   注:使用荧光片和单独的显微镜设置，图像采集的理想条件会有所不同。在这里，图像是在莱卡SP5激光扫描共聚焦显微镜上获得的。TMR 对 543 激光线感到兴奋，发射量从 610 nm 收集到 650 nm。H2DCFDA 对 488 激光线感到兴奋，发射量从 500 nm 收集到 550 nm。使用了 63 倍的浸油目标，并以 0.5 μm 间隔获得 10 μm Z 体积。
9. 从每口井中获取图像，在每口井之间的荧光之间交替。
10. 首次收购后，检查所有油井是否在整个板块中保持集中。
11. 以所需的时间长度以 1-15 分钟间隔获取每口井的图像。

6. 巨皮诺体内氧化事件的数据分析

1. 使用 FIJI 软件，从 TMR 和 H2DCFDA 通道中减去背景。
2. 在 TMR 通道上生成掩码。要生成掩码，请通过选择 "调整>阈值>应用"将图像转换为二进制图像。接下来，突出二进制图像，并选择 编辑>选择>创建掩码。
3. 将面罩应用于 TMR 和 H2DCFDA 图像。为此，突出显示屏蔽并选择 编辑>选择>创建选择。单击 TMR 图像并按 移位 + E 将面膜应用到 TMR 通道。同样，单击 H2DCFDA 图像并按 移位 + E 将面罩应用到 H2DCFDA 通道。
4. 记录口罩内每个巨氨糖体的 TMR 和 H2DCFDA 强度。
5. 从时间过程开始，每次时间点重复步骤 4.1-4.3。
6. 将 H2DCFDA 强度除以 TMR 强度，生成 H2DCFDA:TMR 比率。
7. 绘制 H2DCFDA:TMR 与时间的比率。

7. 测量巨细胞体内的蛋白质消化

1. 准备第 1 节中的单元格。
2. 在检测当天，在 37 °C 下用 100 μL HBSS 清洗所有油井。
3. 溶解 BODIPY 标签的椭圆形布明，浓度为 4 毫克/毫升。
4. 每口井均加满100微升HBSS，含0.025毫克/毫升TMR标签的70 kDa dextran和0.2毫克/毫升的BODIPY标签椭圆形布明。
5. 将细胞放入设置为 37 °C 的孵化器中 15 分钟。
6. 从孵化器中取出细胞，用 100 μL 的 HBSS 将细胞洗 6 倍。
7. 在 37 °C 下用 100 微升的 HBSS 填充每口井。
8. 将板放在显微镜上加热阶段和腔室，并根据需要调整每个荧光片的激发/发射参数。
   注:使用荧光片和单独的显微镜设置，图像采集的理想条件会有所不同。在这里，图像是在莱卡SP5激光扫描共聚焦显微镜上获得的。TMR 对 543 激光线感到兴奋，发射量从 610 nm 收集到 650 nm。BODIPY 对 488 激光线感到兴奋，其发射量从 500 nm 收集到 550 nm。使用了 63 倍的浸油目标，并以 0.5 μm 间隔获得了 10 μm Z 体积。
9. 从每口井中获取图像，在每口井之间的荧光之间交替。
10. 首次收购后，检查所有油井是否在整个板块中保持集中。
11. 以所需的时间长度以 1-15 分钟间隔获取每口井的图像。

8. 巨噬细胞内蛋白质消化的数据分析

1. 使用 FIJI 软件，从 TMR 和 BODIPY 通道中减去背景。
2. 在 TMR 通道上生成一个掩码，并将其应用于 TMR 和 BODIPY 图像，如上述步骤 6.2 和 6.3（图 3B）。
3. 记录口罩内每个宏皮素的 TMR 和 BODIPY 强度。
4. 从时间过程开始，每次时间点重复步骤 4.1-4.3。
5. 将 BODIPY 强度除以 TMR 强度以生成 BODIPY:TMR 比率。
6. 绘制 BODIPY:TMR 与时间的比率。

结果

在测量巨氨酸体pH值时，有一段时间不能测量酸化的动态。此期间对应于 dextran 加载阶段（图 2C中的灰盒和图 3CD中的灰盒），并且会因所使用的细胞类型而异。加载阶段的长度将随细胞的宏观皮诺细胞活性和（ii） 所用仪器的灵敏度而变化。建议在每个实验开始时调整此周期，以便荧光素和 TMR 通道的噪声比大于 4:1。在未经治疗的细胞中?...

讨论

虽然在巨噬细胞、成纤维细胞甚至Dictyostelium spp中，对于宏观脊细胞吸收的低透率和高通量测量有许多协议。^{3，7，31，32，33}， 很少尝试测量这些动态舱的发光生物化学。这可能是由于探针的缺乏，可以有效地瞄准大皮诺体隔间，同时避免其他内分泌隔间。这里描述的...

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Black-walled 96 well plate	PerkinElmer	6005430
CypHer5e, NHS ester	Cytiva	PA15401
Dextran-amino 70 kDa	Invitrogen	D1862
DQ-ovalbumin	Invitrogen	D12053
FITC-dextran 70 kDa	Invitrogen	D1823
HBSS	Gibco	14287
Nigericin	Sigma Aldrich	N7143
OxyBurst Green-SE	Invitrogen	D2935
pHrodo Red, SE	Invitrogen	P36600
Raw264.7 cells	ATCC	TIB-71
RPMI medium	Gibco	11875093
SP5 Confocal Microscope	Leica	-
TRITC-dextran 70 kDa	Invitrogen	D1819
u-Dish	Ibidi	81156