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Resumo

Descrevemos protocolos para medir pH, eventos oxidativos e digestão de proteínas em macropinosos individuais em células vivas. Uma ênfase é colocada na microscopia metométrica de dupla fluorofora e nas vantagens que oferece sobre técnicas de base populacional.

Resumo

Nos últimos anos, o campo da macropinocitose cresceu rapidamente. A macropinocistose emergiu como um mecanismo central pelo qual as células imunes inatas mantêm a homeostase e a imunidade do organismo. Simultaneamente, e ao contrário de seu papel homeostático, também pode conduzir várias patologias, incluindo câncer e infecções virais. Ao contrário de outros modos de endocitose, as ferramentas desenvolvidas para estudar a maturação de macropinossomos permanecem subdesenvolvidas. Aqui o protocolo descreve ferramentas recém-desenvolvidas para estudar o ambiente redox dentro do lúmen de macropinosos precoces e maduros. Metodologias para o uso de microscopia de fluorescência métrica ratiorada na avaliação do pH, produção de espécies reativas de oxigênio e a capacidade degradante dentro do lúmen de macropinosos individuais em células vivas são descritas. Medidas únicas de organela oferecem a vantagem de revelar a heterogeneidade espacial, que muitas vezes se perde com abordagens de base populacional. A ênfase é colocada nos princípios básicos da microscopia multiscopia multiscopia multiscopia fluoroforatométrica, incluindo seleção de sondas, instrumentação, calibração e métodos unicelulares versus populações.

Introdução

Macropinocistose refere-se à absorção de grandes quantidades de fluido extracelular em organelas citoplasmáticas ligadas à membrana chamadas macropinossomos1,2. É um processo altamente conservado realizado por organismos unicelulares de vida livre, como a ameba Dictyostelium spp. 3, assim como anthozoans4 e metazoanos2. Na maioria das células, a macropinocitose é um evento induzido. A ligadura dos receptores de superfície celular induz a saliência de extensões de membrana plasmática movidas por actina, referidas como babados. Uma fração desses babados, por algum mecanismo mal compreendido, sela em suas pontas distais para formar macropinossomos (embora além do escopo deste artigo de métodos, para revisões detalhadas sobre a mecânica da macropinocitose, consulte as referências1,2,5,6,7). O estímulo extracelular que induz a macropinocitose é, na maioria dasvezes,um fator de crescimento solúvel5,8. Assim, o evento macropinocítico permite a ingestão de um bolus de material extracelular do qual a célula pode derivar metabólitos úteis para facilitar o crescimento. Infelizmente, esse caminho para o parto de nutrientes também pode impulsionar a patologia. Certas células cancerígenas abrigam mutações que resultam em macropinotose contínua ou constitutiva. A entrega contínua de nutrientes facilita a proliferação descontrolada de células cancerosas e tem sido associada a tumores particularmente agressivos9,10,11,12,13. Da mesma forma, os vírus podem induzir a macropinocitose a ter acesso às células hospedeiras, conduzindo assim a patologia viral14.

A macropinocistose também funciona na manutenção da imunidade aos patógenos. Certas células imunes inatas, como macrófagos e células dendríticas, envolvem-se na amostragem constitutiva e agressiva do fluido extracelular via macropinocistose6,15,16. Este modo de macropinocistose é incrivelmente ativo, e uma única célula dendrítica pode engorgar-se com um volume de fluido extracelular equivalente ao seu próprio peso a cada hora17. Apesar dessa amostragem constitutiva, macrófagos e células dendríticas não se replicam incontrolavelmente como as células tumorais, em vez disso, parecem processar o material extracelular de tal forma que as informações podem ser extraídas para informar sobre a presença, ou mesmo ausência, de ameaças potenciais. As informações são extraídas como i) padrões moleculares associados ao patógeno que podem ser lidos por receptores de reconhecimento de patógenos intracelulares e ii) pequenos trechos de aminoácidos que podem ser carregados em moléculas de histocompatibilidade principal para triagem por células do sistema imunológico adaptativo16,18,19. Não está claro se os patógenos subvertem esse caminho para o processamento de informações por células imunes.

Apesar desses papéis bem definidos e críticos para a macropinocistose tanto na manutenção da imunidade quanto na homeostase e em contraste com outros modos mais comumente estudados de endocitose, pouco dos trabalhos internos (luminosos) dos macropinossos são conhecidos. O desenvolvimento de protocolos e ferramentas padronizadas para estudar a bioquímica luminal dos macropinossos não só nos ajudará a entender melhor sua biologia única, mas fornecerá insights que podem ser aproveitados para novas estratégias terapêuticas, incluindo o fornecimento de medicamentos20. Este manuscrito metodu em ferramentas recentemente desenvolvidas para dissecar, no nível único da organela, vários aspectos da bioquímica luminal dos macropinossomos.

Fluoroforos podem ser usados para medir bioquímicas específicas de organelas se i) eles particionam preferencialmente no compartimento de interesse e/ou ii) sofrem alterações espectrais em resposta ao parâmetro de interesse. Por exemplo, no caso do pH, bases fracas fluorescentes, como laranja acridina, violeta cresyl, e os corantes LysoTracker se acumulam preferencialmente em organelas ácidas. Portanto, sua intensidade relativa é uma indicação aproximada de que a organela rotulada é ácida. Outros fluoroforos responsivos ao pH, como fluoresceína, pHrodo e cypHer5e, sofrem alterações espectrais ao se vincularem a prótons(Figura 1A-C). Alterações na emissão de fluorescência de fluoroforos sensíveis ao pH podem, portanto, fornecer uma aproximação útil do pH. O uso de fluoroforos únicos, no entanto, apresenta uma série de desvantagens. Por exemplo, alterações no plano focal, fotobleachamento e alterações no volume de organelas individuais, uma ocorrência comum em macropinosomos21,podem induzir alterações na intensidade de fluorescência de fluoroforos únicos, e isso não pode ser facilmente corrigido para22. As avaliações de comprimento de onda única, embora úteis para visualizar compartimentos ácidos, são, portanto, puramente qualitativas.

Uma abordagem mais quantitativa é atingir o fluoróforo sensível aos parâmetros, juntamente com um fluoróforo de referência à organela de interesse. O fluoróforo de referência é idealmente insensível às alterações bioquímicas dentro da organela (Figura 1D-F) e pode, portanto, ser usado para corrigir para alterações no plano focal, volume organellar e, em certa medida, fotobleaching23. Utilizando esta abordagem, referida como fluorescência multitorscência de fluorofora dupla, a correção pode ser alcançada gerando uma razão da emissão de fluorescência do fluorophore sensível aos parâmetros para o fluorophore de referência.

Aqui, o protocolo utilizará o princípio da imagem métrica de dupla fluorofora para medir pH, eventos oxidativos e degradação de proteínas dentro de macropinossos. Em cada caso, será selecionado um fluoróforo sensível ao parâmetro de interesse e a um fluoróforo de referência. Para direcionar os fluoroforos especificamente aos macropinossomos, eles serão covalentemente acoplados a 70 kDa dextran, que é preferencialmente incorporado em macropinossos24. Todos os ensaios serão realizados em células Raw264.7, mas podem ser adaptados a outros tipos de células. Sempre que possível, as razões de fluorescência serão calibradas em relação a uma curva de referência para ganhar valores absolutos. É importante ressaltar que todas as medições serão realizadas em células vivas para avaliação dinâmica e quantitativa do ambiente luminal dos macropinossomos.

Ao selecionar fluoroforos sensíveis ao pH, uma série de considerações devem ser ponderadas. O primeiro é o pKa do fluoróforo, que indica a faixa de valores de pH em que a sonda será mais sensível. Se for assumido que logo após a formação, o pH do macropinossomo estará próximo ao do meio extracelular (~pH 7.2) e que ele irá acidificar progressivamente através de interações com endósmos e lysosomos tardios (~pH 5.0), então uma sonda com um pKa sensível dentro dessa faixa(Figura 2C) deve ser selecionada. O fluoresceína fluorofora, que tem um pKa de 6.4, é otimizado dentro dessa faixa. Tem sido usado extensivamente para medir outras organelas semelhantes, como os faósmos, e será o fluoróforo de escolha neste manuscrito22,25. Como fluoróforo de referência, será utilizada a tetrametilrhodamina, que é insensível ao pH(Figura 1E). Outros fluoroforos, como pHrodo e cypHer5e podem ser substituídos por fluoresceína onde as propriedades espectrais da fluoresceína correspondem a outras variáveis experimentais. Alguns fluoroforos de referência sugeridos para pHrodo e cypHer5e são mostrados na Figura 1.

Uma segunda consideração é o método pelo qual os dois fluoroforos serão direcionados especificamente para macropinossomos. O Dextran do tamanho 70 kDa, que tem um raio hidrodinâmico de aproximadamente 7 nm, não gruda não especificamente nas células e é incorporado em macropinossos, mas não em poços revestidos de clathrin ou caveolae, e, portanto, marca macropinossos(Figura 2A e Figura 3A,B)16,24,26. Neste protocolo, o dextran de 70 kDa e tetramethylrhodamina (TMR) rotulados de 70 kDa dextran serão usados como sondas sensíveis ao pH e referência, respectivamente.

Nas células imunes inatas, macropinocistose e fagocitose representam as duas principais rotas para a internalização do material exógeno para processamento e posterior apresentação às células da resposta imune adaptativa27. O controle cuidadoso e coordenado da química redox do lúmen de fágoras e macropinossos é fundamental para o processamento específico do contexto do material exógeno. Talvez o regulador mais bem estudado de eventos oxidativos em fagosmos é o NADPH oxidase, um grande complexo multi-subunidade que produz grandes quantidades de espécies reativas de oxigênio (ROS) dentro do lúmen de fagosomes28. De fato, sua atividade é central para o processamento adequado de antígenos dentro dos fágoras29,30. No entanto, a atividade do NADPH oxidase em membranas macropinosômicas não foi explorada.

Neste protocolo, o éster de succinimidyl H2DCFDA é usado para medir eventos oxidativos dentro do macropinosome. Esta é uma forma modificada de fluoresceína (2',7'-diclorodihioresceto), que é minimamente fluorescente em sua forma reduzida. Após a oxidação, sua emissão de fluorescência aumenta significativamente. No entanto, vale a pena notar uma ressalva significativa do H2DCFDA - como é baseada na fluoresceína fluorofora, sua fluorescência também é saciada em compartimentos ácidos, e deve-se tomar cuidado para controlar essa variável ao projetar experimentos28. Semelhante à abordagem para medir o pH, o éster succinimidil H2DCFDA será covalentemente anexado ao dextran de 70 kDa e o dextran de 70 kDa com rótulo TMR será usado como fluoróforo de referência(Figura 3A).

Ovalbumina fluorescente será usada para medir a degradação da proteína dentro de macropinossomos. O ovalbumin usado aqui é densamente rotulado com um corante FL 4,4-difluoro-4-bora-3a,4a-diaza-s-indacene (BODIPY) fl que é auto-extinto. Após a digestão, peptídeos fortemente fluorescentes com tinta são liberados. Como o ovalbumin não pode ser facilmente conjugado a dextran de 70 kDa, as células com dextran de 70 kDa com tmr e ovalbumina de fase fluida serão co-incubadas. O sinal TMR será usado para gerar uma máscara macropinosa durante a análise pós-imagem, e o sinal liberado da ovalbumina digerida será medido dentro da máscara(Figura 3B).

Protocolo

1. Preparação de células

  1. Cultivar células Raw264.7 a 37 °C e 5% de CO2 a 70% de confluência em RPMI suplementado com soro inativado por calor de 10%.
  2. Um dia antes do ensaio, as células raw264.7 com uma densidade de 5 x 104 células por poço em uma placa de 96 poços. Certifique-se de que cada poço contém 100 μL de meio de crescimento. Certifique-se de que a placa de 96 poços tenha lados pretos e um fundo de vidro para imagem.
    NOTA: Aqui, foram utilizadas placas de 96 poços para imagem. As placas de 96 poços permitem o uso de quantidades menores de células e reagentes em relação a câmaras de imagem maiores. No entanto, qualquer câmara projetada para imagens de células vivas pode ser usada, e reagentes podem ser ampliados em conformidade.
  3. No dia do ensaio, verifique se os poços são pelo menos 70% confluentes.

2. Medindo pH macropinoso

  1. Prepare as células como na seção 1.
  2. Lave todos os poços com 100 μL de HBSS a 37 °C.
  3. Encha cada poço com 100 μL de HBSS contendo 0,025 mg/mL de dextran de 70 kDa com etiqueta TMR e 0,025 mg/mL de fluoresceína rotulada 70 kDa detranx.
  4. Coloque as células em uma incubadora fixada a 37 °C por 15 minutos.
  5. Remova as células da incubadora e lave as células 6x com 100 μL de HBSS.
  6. Encha cada poço com 100 μL de HBSS a 37 °C.
  7. Coloque a placa no microscópio com um palco e câmara aquecidos.
  8. Ajuste os parâmetros de excitação/emissão de cada fluorophore conforme necessário.
    NOTA: As condições ideais para aquisição de imagens variam de acordo com as configurações de fluoroforos usados e as configurações individuais do microscópio. Aqui, as imagens foram adquiridas em um microscópio confocal de varredura a laser Leica SP5. A TMR estava animada com uma linha de 543 lasers e a emissão foi coletada de 610 nm a 650 nm. A fluoresceína estava animada com uma linha de 488 lasers e a emissão foi coletada de 500 nm a 550 nm. Utilizou-se um objetivo de imersão de óleo de 63x e adquirido um volume Z de 10 μm em intervalos de 0,5 μm.
  9. Adquira uma imagem de cada poço, alternando entre fluoroforos entre cada poço.
  10. Após a primeira aquisição, verifique se todos os poços permaneceram em foco em toda a placa.
  11. Adquira imagens de cada poço em intervalos de 1-15 min pelo tempo desejado.

3. Calibração in situ do pH macropinoso

  1. Durante a aquisição de imagem, prepare 1 L de solução rica em potássio (K+-rico) contendo 140 mM KCl, 1 mM MgCl2, 1 mM CaCl2e 5 mM de glicose. Suplemente um volume de 400 mL da solução K+rica com HEPES de 25 mM (a partir de uma solução de estoque de 1 M, pH 7.2) e um volume separado de 400 mL com MES de 25 mM (de uma solução de estoque de 0,5 M, pH 6.0).
  2. Ajuste uma alíquota de 50 mL da solução K+rica tamponada com HEPES de 25mM para pH 7.5 usando 10 M HCl ou 10 M KOH conforme necessário.
  3. Ajuste três alíquotas separadas de 50 mL da solução K+rica tamponada com MES de 25mM para pH 6.5, pH 5.5 e pH 5.0 usando 10 M HCl ou 10 M KOH conforme necessário.
    NOTA: Um tampão de ácido acetato-acético pode ser preferível para soluções de pH mais baixas.
  4. Após a conclusão da aquisição de imagem, remova o HBSS da placa de 96 poços contendo as células e substitua-a pela solução k+rica que está em pH 7.5.
  5. Adicione nígericina a uma concentração final de 10 μg/mL.
    NOTA: Níger é um ionóforo que troca K+ por H+. Ao definir a concentração K+ da solução K+-rica para um valor que se aproxima da concentração K+ do citosol, pode-se garantir que a nigericina irá fixar o pH do macropinosome ao do citosol, que por sua vez reflete o pH do tampão de calibração.
  6. Coloque a placa de volta no microscópio e adquira imagens de cada poço usando as mesmas configurações de aquisição que acima.
  7. Repita as etapas 3.5 e 3.6 para cada buffer de calibração.

4. Análise de dados para pH macropinosome

  1. Usando o software FIJI, subtraia o fundo tanto do TMR quanto do canal fluoresceína.
  2. Gere uma máscara no canal TMR. Para gerar uma máscara, converta a imagem em uma imagem binária selecionando Ajustar > limiar > aplicar. Em seguida, destaque a imagem binária e selecione Editar > Seleção > Criar máscara.
  3. Aplique-o tanto nas imagens TMR quanto em fluoresceína. Para isso, destaque a máscara e selecione Editar > Seleção > Criar Seleção. Clique na imagem TMR e pressione Shift + E para aplicar a máscara no canal TMR. Da mesma forma, clique na imagem fluorescein e pressione Shift + E para aplicar a máscara no canal OB.
  4. Registo o TMR e a intensidade de fluoresceína para cada macropinosome dentro das máscaras.
  5. Repita as etapas 4.1-4.3 para cada ponto de tempo do curso de tempo.
  6. Repita as etapas 4.1-4.3 para as imagens capturadas na calibração in situ.
  7. Divida a intensidade da fluoresceína pela intensidade de TMR para gerar a relação fluoresceína:TMR.
  8. Plote o pH contra as relações fluoresceína:TMR para as imagens de calibração.
  9. Encaixe uma curva nos dados de calibração.
  10. Interpolar os dados para cada ponto de tempo do curso de tempo para obter valores absolutos de pH.

5. Medir eventos oxidativos dentro de macropinossos

  1. Prepare as células como na seção 1.
  2. Um dia antes do ensaio, prepare o éster de succinimidil H2DCFDA rotulado de 70 kDa dextran por reutilização de 10 mg de dextran-amino de 70 kDa em 1 mL de solução de bicarbonato de sódio de 0,1 M (pH 8.3). Adicione 1 mg do éster de succinimidil H2DCFDA à solução dextran-amino e incubar por 1h. Dialyze o H2DCFDA rotulado de 70 kDa dextran contra PBS. Não guarde por mais de 1 dia, pois o dextran de 70 kDa com rótulo H2DCFDA irá oxidar no armazenamento.
  3. No dia do ensaio, lave todos os poços com 100 μL de HBSS a 37 °C.
  4. Encha cada poço com 100 μL de HBSS contendo 0,025 mg/mL de dextran de 70 kDa com etiqueta TMR e 0,025 mg/mL de H2DCFDA com etiqueta de 70 kDa dextran.
  5. Coloque as células em uma incubadora a 37 °C por 15 minutos.
  6. Remova as células da incubadora e lave as células 6x com 100 μL de HBSS.
  7. Encha cada poço com 100 μL de HBSS a 37 °C.
  8. Coloque a placa no microscópio com um estágio e câmara aquecidos e ajuste os parâmetros de excitação/emissão de cada fluorohore conforme necessário.
    NOTA: As condições ideais para aquisição de imagens variam de acordo com as configurações de fluoroforos usados e as configurações individuais do microscópio. Aqui foram adquiridas imagens em um microscópio confocal de varredura a laser Leica SP5. A TMR estava animada com uma linha de 543 lasers, e a emissão foi coletada de 610 nm a 650 nm. H2DCFDA estava animado com uma linha de 488 laser e a emissão foi coletada de 500 nm a 550 nm. Utilizou-se um objetivo de imersão de óleo de 63x, e um volume Z de 10 μm foi adquirido em intervalos de 0,5 μm.
  9. Adquira uma imagem de cada poço, alternando entre fluoroforos entre cada poço.
  10. Após a primeira aquisição, verifique se todos os poços permanecem em foco em toda a placa.
  11. Adquira imagens de cada poço em intervalos de 1-15 min pelo tempo desejado.

6. Análise de dados para eventos oxidativos dentro de macropinossos

  1. Usando o software FIJI, subtraia o plano de fundo dos canais TMR e H2DCFDA.
  2. Gere uma máscara no canal TMR. Para gerar uma máscara, converta a imagem em uma imagem binária selecionando Ajustar > limiar > aplicar. Em seguida, destaque a imagem binária e selecione Editar > Seleção > Criar máscara.
  3. Aplique a máscara nas imagens TMR e H2DCFDA. Para isso, destaque a máscara e selecione Editar > Seleção > Criar Seleção. Clique na imagem TMR e pressione Shift + E para aplicar a máscara no canal TMR. Da mesma forma, clique na imagem H2DCFDA e pressione Shift + E para aplicar a máscara no canal H2DCFDA.
  4. Regisso da intensidade TMR e H2DCFDA para cada macropinosome dentro das máscaras.
  5. Repita as etapas 4.1-4.3 para cada ponto de tempo do curso de tempo.
  6. Divida a intensidade H2DCFDA pela intensidade TMR para gerar uma razão H2DCFDA: TMR.
  7. Plote a relação H2DCFDA: TMR contra o tempo.

7. Medir a digestão proteica dentro de macropinossomos

  1. Prepare as células como na seção 1.
  2. No dia do ensaio, lave todos os poços com HBSS de 100 μL a 37 °C.
  3. Dissolver ovalbumin com etiqueta BODIPY para uma concentração de 4 mg/mL no HBSS.
  4. Encha cada poço com 100 μL de HBSS contendo 0,025 mg/mL de dextran rotulado em TMR de 70 kDa e 0,2 mg/mL de ovalbumina com etiqueta BODIPY.
  5. Coloque as células em uma incubadora fixada a 37 °C por 15 minutos.
  6. Remova as células da incubadora e lave as células 6x com 100 μL de HBSS.
  7. Encha cada poço com 100 μL de HBSS a 37 °C.
  8. Coloque a placa no microscópio com um estágio e câmara aquecidos e ajuste os parâmetros de excitação/emissão de cada fluorohore conforme necessário.
    NOTA: As condições ideais para aquisição de imagens variam de acordo com as configurações de fluoroforos usados e as configurações individuais do microscópio. Aqui, as imagens foram adquiridas em um microscópio confocal de varredura a laser Leica SP5. A TMR estava animada com uma linha de 543 lasers, e a emissão foi coletada de 610 nm a 650 nm. BODIPY estava animado com uma linha de 488 laser, e a emissão foi coletada de 500 nm a 550 nm. Utilizou-se um objetivo de imersão de óleo de 63x e adquirido um volume Z de 10 μm em intervalos de 0,5 μm.
  9. Adquira uma imagem de cada poço, alternando entre fluoroforos entre cada poço.
  10. Após a primeira aquisição, verifique se todos os poços permanecem em foco em toda a placa.
  11. Adquira imagens de cada poço em intervalos de 1-15 min pelo tempo desejado.

8. Análise de dados para digestão de proteínas dentro de macropinosos

  1. Usando o software FIJI, subtraia o plano de fundo dos canais TMR e BODIPY.
  2. Gere uma máscara no canal TMR e aplique-a tanto nas imagens TMR quanto no BODIPY como nas etapas 6.2 e 6.3 acima(Figura 3B).
  3. Registo a intensidade TMR e BODIPY para cada macropinosome dentro das máscaras.
  4. Repita as etapas 4.1-4.3 para cada ponto de tempo do curso de tempo.
  5. Divida a intensidade BODIPY pela intensidade TMR para gerar a razão BODIPY:TMR.
  6. Plote a relação BODIPY:TMR contra o tempo.

Resultados

Ao medir o pH macropinosome, há um período de tempo para o qual a dinâmica da acidificação não pode ser medida. Este período corresponde à fase de carregamento do dextran (caixa cinza na Figura 2C e Figura 3C,D) e variará dependendo do tipo de célula utilizada. O comprimento da fase de carregamento varia-se com (i) a atividade macropinocítica das células e (ii) a sensibilidade do instrumento utilizado. Recomenda-se ajustar este perí...

Discussão

Embora existam uma série de protocolos para medidas de baixo e alto rendimento de absorção macropinóctica em macrófagos, fibroblastos e até mesmo dictyostelium spp. 3,7,31,32,33, muito poucas tentativas foram feitas para medir a bioquímica luminal desses compartimentos dinâmicos. Isso é provavelmente devido a uma escassez de sondas que podem ...

Divulgações

Os autores não têm conflitos de interesse para divulgar.

Agradecimentos

Agradecemos à Universidade de Calgary pelo apoio. Também gostaríamos de agradecer ao Dr. Robin Yates pelo acesso a reagentes, equipamentos e discussões úteis.

Materiais

NameCompanyCatalog NumberComments
Black-walled 96 well platePerkinElmer6005430
CypHer5e, NHS esterCytivaPA15401
Dextran-amino 70 kDaInvitrogenD1862
DQ-ovalbuminInvitrogenD12053
FITC-dextran 70 kDaInvitrogenD1823
HBSSGibco14287
NigericinSigma AldrichN7143
OxyBurst Green-SEInvitrogenD2935
pHrodo Red, SEInvitrogenP36600
Raw264.7 cellsATCCTIB-71
RPMI mediumGibco11875093
SP5 Confocal MicroscopeLeica-
TRITC-dextran 70 kDaInvitrogenD1819
u-DishIbidi81156

Referências

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