Mesure du pH, de la chimie redox et de la capacité dégradative des macropinosomes à l’aide de la microscopie ratiométrique à double fluorophore

Résumé

Nous décrivons des protocoles pour mesurer le pH, les événements oxydatifs et la digestion des protéines dans les macropinosomes individuels dans les cellules vivantes. L’accent est mis sur la microscopie ratiométrique à double fluorophore et les avantages qu’elle offre par rapport aux techniques basées sur la population.

Résumé

Ces dernières années, le domaine de la macropinocytose s’est développé rapidement. La macropinocytose est apparue comme un mécanisme central par lequel les cellules immunitaires innées maintiennent l’homéostasie et l’immunité de l’organisme. Simultanément, et contrairement à son rôle homéostatique, il peut également conduire à diverses pathologies, y compris le cancer et les infections virales. Contrairement à d’autres modes d’endocytose, les outils développés pour étudier la maturation des macropinosomes restent sous-développés. Ici, le protocole décrit des outils nouvellement développés pour étudier l’environnement redox dans la lumière des macropinosomes précoces et en cours de maturation. Les méthodologies d’utilisation de la microscopie à fluorescence ratiométrique pour évaluer le pH, la production d’espèces réactives de l’oxygène et la capacité de dégradation dans la lumière des macropinosomes individuels dans les cellules vivantes sont décrites. Les mesures d’organites uniques offrent l’avantage de révéler l’hétérogénéité spatio-temporelle, qui est souvent perdue avec les approches basées sur la population. L’accent est mis sur les principes de base de la microscopie ratiométrique à double fluorophore, y compris la sélection des sondes, l’instrumentation, l’étalonnage et les méthodes unicellulaires par rapport aux méthodes basées sur la population.

Introduction

La macropinocytose fait référence à l’absorption de grandes quantités de liquide extracellulaire dans des organites cytoplasmiques liés à la membrane appelés macropinosomes^1,2. C’est un processus hautement conservé effectué par des organismes unicellulaires libres, tels que l’amibe Dictyostelium spp. ³, ainsi que les anthozoaires⁴ et les métazoaires². Dans la plupart des cellules, la macropinocytose est un événement induit. La ligature des récepteurs de la surface cellulaire induit la saillie d’extensions de membrane plasmique ent....

Protocole

1. Préparation des cellules

1. Cultiver des cellules Raw264.7 à 37 °C et 5% de CO₂ à 70% de confluence dans rpmI complété par 10% de sérum inactivé par la chaleur.
2. Un jour avant le test, ensemencez des cellules Raw264.7 à une densité de 5 x 10⁴ cellules par puits dans une plaque de 96 puits. S’assurer que chaque puits contient 100 μL de milieu de croissance. Assurez-vous que la plaque de 96 puits a des côtés noirs et un fond en verre pour l’imagerie.
   REMARQUE: Ici, des plaques de 96 puits ont été utilisées pour l’imagerie. Les plaques de 96 puits permettent d’utiliser de plus petites quantités de cellules et de réactifs par ra....

Résultats

Lors de la mesure du pH des macropinosomes, il existe une période de temps pendant laquelle la dynamique de l’acidification ne peut pas être mesurée. Cette période correspond à la phase de chargement du dextran (boîte grise dans la Figure 2C et la Figure 3C,D) et variera en fonction du type de cellule utilisé. La durée de la phase de charge variera avec (i) l’activité macropinocytaire des cellules et (ii) la sensibilité de l’inst.......

Discussion

Bien qu’il existe un certain nombre de protocoles pour les mesures à faible et à haut débit de l’absorption macropinocytaire dans les macrophages, les fibroblastes et même Dictyostelium spp. ^3,7,31,32,33, très peu de tentatives ont été faites pour mesurer la biochimie luminale de ces compartiments dynamiques. Cela est probablement dû à un.......

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
Black-walled 96 well plate	PerkinElmer	6005430
CypHer5e, NHS ester	Cytiva	PA15401
Dextran-amino 70 kDa	Invitrogen	D1862
DQ-ovalbumin	Invitrogen	D12053
FITC-dextran 70 kDa	Invitrogen	D1823
HBSS	Gibco	14287
Nigericin	Sigma Aldrich	N7143
OxyBurst Green-SE	Invitrogen	D2935
pHrodo Red, SE	Invitrogen	P36600
Raw264.7 cells	ATCC	TIB-71
RPMI medium	Gibco	11875093
SP5 Confocal Microscope	Leica	-
TRITC-dextran 70 kDa	Invitrogen	D1819
u-Dish	Ibidi	81156