Messung des pH-Werts, der Redoxchemie und der abbauenden Kapazität von Makropinosomen mit Hilfe der ratiometrischen Dual-Fluorophor-Mikroskopie

Zusammenfassung

Wir beschreiben Protokolle zur Messung von pH-Wert, oxidativen Ereignissen und Proteinverdauung in einzelnen Makropinosomen in lebenden Zellen. Ein Schwerpunkt liegt auf der dualen fluorophoren ratiometrischen Mikroskopie und den Vorteilen, die sie gegenüber populationsbasierten Techniken bietet.

Zusammenfassung

In den letzten Jahren ist das Gebiet der Makropinozytose rasant gewachsen. Makropinozytose hat sich als zentraler Mechanismus herausgestellt, durch den angeborene Immunzellen die organismische Homöostase und Immunität aufrechterhalten. Gleichzeitig und im Gegensatz zu seiner homöostatischen Rolle kann es auch verschiedene Pathologien, einschließlich Krebs und Virusinfektionen, antreiben. Im Gegensatz zu anderen Modi der Endozytose bleiben die Werkzeuge, die zur Untersuchung der Reifung von Makropinosomen entwickelt wurden, unterentwickelt. Hier beschreibt das Protokoll neu entwickelte Werkzeuge zur Untersuchung der Redoxumgebung im Lumen früher und reifender Makropinosomen. Methoden zur Verwendung der ratiometrischen Fluoreszenzmikroskopie zur Beurteilung des pH-Werts, der Produktion von reaktiven Sauerstoffspezies und der abbauenden Kapazität innerhalb des Lumens einzelner Makropinosomen in lebenden Zellen werden beschrieben. Einzelorganellenmessungen bieten den Vorteil, dass sie räumlich-zeitliche Heterogenität aufdecken, die bei populationsbasierten Ansätzen oft verloren geht. Der Schwerpunkt liegt auf den Grundprinzipien der ratiometrischen Dual-Fluorophor-Mikroskopie, einschließlich Sondenauswahl, Instrumentierung, Kalibrierung und Einzelzell- und Populations-basierten Methoden.

Einleitung

Makropinozytose bezieht sich auf die Aufnahme großer Mengen extrazellulärer Flüssigkeit in membrangebundene zytoplasmatische Organellen, die Makropinosomen^1,2genannt werden. Es ist ein hochkonserviertes Verfahren, das von freilebenden einzelligen Organismen wie der Amöbe Dictyostelium sppdurchgeführt wird. ³, sowie Anthozoen⁴ und Metazoen². In den meisten Zellen ist die Makropinozytose ein induziertes Ereignis. Die Ligatur von Zelloberflächenrezeptoren induziert das Hervorkommen von Aktin-getriebenen Plasmamembranverlängerungen, d....

Protokoll

1. Vorbereitung der Zellen

1. Züchten Sie Raw264,7-Zellen bei 37 °C und 5% CO₂ bis 70% Konfluenz in RPMI, ergänzt mit 10% hitzeinaktiviertem Serum.
2. Einen Tag vor dem Assay werden Raw264,7-Zellen mit einer Dichte von 5 x 10⁴ Zellen pro Vertiefung in einer 96-Well-Platte ausgesät. Stellen Sie sicher, dass jede Vertiefung 100 μL Wachstumsmedium enthält. Stellen Sie sicher, dass die 96-Well-Platte schwarze Seiten und einen Glasboden für die Bildgebung hat.
   HINWEIS: Hier wurden 96-Well-Platten für die Bildgebung verwendet. Die 96-Well-Platten ermöglichen die Verwendung kleinerer Mengen von Zellen und Reagenzien im Vergleich zu größ....

Ergebnisse

Bei der Messung des pH-Werts von Makropinosomen gibt es einen Zeitraum, für den die Dynamik der Versauerung nicht gemessen werden kann. Dieser Zeitraum entspricht der Dextran-Ladephase (graues Feld in Abbildung 2C und Abbildung 3C,D)und variiert je nach verwendetem Zelltyp. Die Länge der Ladephase variiert mit (i) der makropinozyten Aktivität der Zellen und (ii) der Empfindlichkeit des verwendeten Instruments. Es wird empfohlen, diesen Zeitra.......

Diskussion

Obwohl es eine Reihe von Protokollen für Messungen mit niedrigem und hohem Durchsatz der makropinozytären Aufnahme in Makrophagen, Fibroblasten und sogar Dictyostelium spp. ^3,7,31,32,33, es wurden nur sehr wenige Versuche unternommen, die luminale Biochemie dieser dynamischen Kompartimente zu messen. Dies ist wahrscheinlich auf einen Mangel an Sonde.......

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
Black-walled 96 well plate	PerkinElmer	6005430
CypHer5e, NHS ester	Cytiva	PA15401
Dextran-amino 70 kDa	Invitrogen	D1862
DQ-ovalbumin	Invitrogen	D12053
FITC-dextran 70 kDa	Invitrogen	D1823
HBSS	Gibco	14287
Nigericin	Sigma Aldrich	N7143
OxyBurst Green-SE	Invitrogen	D2935
pHrodo Red, SE	Invitrogen	P36600
Raw264.7 cells	ATCC	TIB-71
RPMI medium	Gibco	11875093
SP5 Confocal Microscope	Leica	-
TRITC-dextran 70 kDa	Invitrogen	D1819
u-Dish	Ibidi	81156