Misurazione del pH, delle sostanze chimiche redox e della capacità degradativa dei macropinosomi utilizzando la microscopia a doppio fluoroforo

Riepilogo

Descriviamo i protocolli per misurare il pH, gli eventi ossidativi e la digestione delle proteine in singoli macropinosomi in cellule vive. L'accento è posto sulla microscopia a doppio fluoroforo ratiometrico e sui vantaggi che offre rispetto alle tecniche basate sulla popolazione.

Abstract

Negli ultimi anni, il campo della macropinocitosi è cresciuto rapidamente. La macropinocitosi è emersa come un meccanismo centrale attraverso il quale le cellule immunitarie innate mantengono l'omeostasi e l'immunità dell'organismo. Allo stesso tempo, e in contrasto con il suo ruolo omeostatico, può anche guidare varie patologie, tra cui il cancro e le infezioni virali. A differenza di altre modalità di endocitosi, gli strumenti sviluppati per studiare la maturazione dei macropinosomi rimangono sottosviluppati. Qui il protocollo descrive gli strumenti di nuova concezione per studiare l'ambiente redox all'interno del lume dei macropinosomi precoci e in maturazione. Vengono descritte le metodologie per l'utilizzo della microscopia a fluorescenza ratiometrica nella valutazione del pH, della produzione di specie reattive dell'ossigeno e della capacità degradativa all'interno del lume dei singoli macropinosomi nelle cellule vive. Le misurazioni di singoli organelli offrono il vantaggio di rivelare l'eterogeneità spaziotemporale, che spesso viene persa con approcci basati sulla popolazione. L'accento è posto sui principi di base della microscopia a doppio fluoroforo, tra cui la selezione della sonda, la strumentazione, la calibrazione e i metodi a singola cellula rispetto a quelli basati sulla popolazione.

Introduzione

La macropinocitosi si riferisce all'assorbimento di grandi quantità di fluido extracellulare in organelli citoplasmatici legati alla membrana chiamati macropinosomi^1,2. È un processo altamente conservato eseguito da organismi unicellulari viventi liberi, come l'ameba Dictyostelium spp. ³, così come antozoi⁴ e metazoi². Nella maggior parte delle cellule, la macropinocitosi è un evento indotto. La legatura dei recettori della superficie cellulare induce la protrusione delle estensioni della membrana plasmatica guidate dall'actina denominate volant. Una frazione di questi volant, da qualche meccanismo poco compreso, sigillano le loro punte distali per formare macropinosomi (anche se al di là dello scopo di questo documento di metodi, per revisioni dettagliate sulla meccanica della macropinocitosi, si prega di fare riferimento ai riferimenti^1,2,5,6,7). Lo stimolo extracellulare che induce la macropinocitosi è più spesso un fattore di crescita solubile^5,8. Di conseguenza, l'evento macropinocitico consente l'ingestione di un bolo di materiale extracellulare da cui la cellula può ricavare metaboliti utili per facilitare la crescita. Sfortunatamente, questo percorso per la consegna dei nutrienti può anche guidare la patologia. Alcune cellule tumorali ospitano mutazioni che provocano macropinocitosi continua o costitutiva. L'erogazione continua di nutrienti facilita la proliferazione incontrollata delle cellule tumorali ed è stata collegata a tumori particolarmente aggressivi^{9,10,11,12,13.} Allo stesso modo, i virus possono indurre macropinocitosi per ottenere l'accesso alle cellule ospiti, guidando così la patologia virale¹⁴.

La macropinocitosi funziona anche nel mantenimento dell'immunità agli agenti patogeni. Alcune cellule immunitarie innate come i macrofagi e le cellule dendritiche si impegnano nel campionamento costitutivo e aggressivo del fluido extracellulare tramite macropinocitosi^6,15,16. Questa modalità di macropinocitosi è incredibilmente attiva e una singola cellula dendritica può inglobarsi con un volume di liquido extracellulare equivalente al proprio peso ogni ora¹⁷. Nonostante questo campionamento costitutivo, i macrofagi e le cellule dendritiche non si replicano in modo incontrollabile come fanno le cellule tumorali, ma sembrano elaborare il materiale extracellulare in modo tale che le informazioni possano essere estratte per informare sulla presenza, o addirittura sull'assenza, di potenziali minacce. Le informazioni vengono estratte come i) modelli molecolari associati ai patogeni che possono essere letti dai recettori di riconoscimento dei patogeni intracellulari e ii) brevi tratti di amminoacidi che possono essere caricati sulle principali molecole di istocompatibilità per lo screening da parte delle cellule del sistema immunitario adattativo^16,18,19. Se i patogeni sovvertono questo percorso per l'elaborazione delle informazioni da parte delle cellule immunitarie non è al momento chiaro.

Nonostante questi ruoli ben definiti e critici per la macropinocitosi sia nel mantenimento dell'immunità che nell'omeostasi e in contrasto con altre modalità di endocitosi più comunemente studiate, si sa poco del funzionamento interno (luminale) dei macropinosomi. Lo sviluppo di protocolli e strumenti standardizzati per studiare la biochimica luminale dei macropinosomi non solo ci aiuterà a comprendere meglio la loro biologia unica, ma fornirà informazioni che possono essere sfruttate per nuove strategie terapeutiche, tra cui la somministrazione di farmaci²⁰. Questo metodo manoscritto si concentrerà su strumenti recentemente sviluppati per sezionare, a livello di singolo organello, vari aspetti della biochimica luminale dei macropinosomi.

I fluorofori possono essere utilizzati per misurare specifiche biochimiche di organelli se i) si dividono preferenzialmente nel compartimento di interesse e/o ii) subiscono cambiamenti spettrali in risposta al parametro di interesse. Ad esempio, nel caso del pH, le basi deboli fluorescenti, come l'arancio acridina, il viola cresile e i coloranti LysoTracker si accumulano preferenzialmente negli organelli acidi. Pertanto, la loro intensità relativa è un'indicazione approssimativa che l'organello etichettato è acido. Altri fluorofori pH-responsive, come fluoresceina, pHrodo e cypHer5e, subiscono cambiamenti spettrali al momento del legame ai protoni (Figura 1A-C). Le modifiche all'emissione di fluorescenza dei fluorofori sensibili al pH possono quindi fornire un'utile approssimazione del pH. L'uso di singoli fluorofori, tuttavia, presenta una serie di svantaggi. Ad esempio, le modifiche al piano focale, il fotosciviazione e le modifiche al volume dei singoli organelli, un evento comune nei macropinosomi²¹, possono indurre cambiamenti nell'intensità di fluorescenza dei singoli fluorofori e questo non può essere facilmente corretto per²². Le valutazioni a singola lunghezza d'onda, sebbene utili per visualizzare compartimenti acidi, sono quindi puramente qualitative.

Un approccio più quantitativo consiste nell'indirizzare il fluoroforo sensibile ai parametri insieme a un fluoroforo di riferimento all'organello di interesse. Il fluoroforo di riferimento è idealmente insensibile ai cambiamenti biochimici all'interno dell'organello (Figura 1D-F) e può quindi essere utilizzato per correggere i cambiamenti nel piano focale, nel volume organellare e, in una certa misura, nel fotosableaching²³. Utilizzando questo approccio, denominato fluorescenza del doppio fluoroforo, la correzione può essere ottenuta generando un rapporto tra l'emissione di fluorescenza del fluoroforo sensibile ai parametri e il fluoroforo di riferimento.

Qui, il protocollo utilizzerà il principio dell'imaging ratiometrico a doppio fluoroforo per misurare il pH, gli eventi ossidativi e la degradazione delle proteine all'interno dei macropinosomi. In ogni caso, verrà selezionato un fluoroforo sensibile al parametro di interesse e un fluoroforo di riferimento. Al fine di indirizzare i fluorofori specificamente ai macropinosomi, saranno accoppiati covalentemente a 70 kDa destrano, che è preferibilmente incorporato nei macropinosomi²⁴. Tutti i test saranno eseguiti in cellule Raw264.7 ma possono essere adattati ad altri tipi di cellule. Ove possibile, i rapporti di fluorescenza saranno calibrati rispetto a una curva di riferimento per ottenere valori assoluti. È importante sottolineare che tutte le misurazioni saranno eseguite in cellule vive per la valutazione dinamica e quantitativa dell'ambiente luminale dei macropinosomi.

Quando si selezionano fluorofori sensibili al pH, è necessario valutare una serie di considerazioni. Il primo è il pK_a del fluoroforo, che indica l'intervallo di valori di pH a cui la sonda sarà più sensibile. Se si presume che poco dopo la formazione, il pH del macropinosoma sarà vicino a quello del mezzo extracellulare (~pH 7,2) e che si acidificherà progressivamente attraverso interazioni con endosomi e lisosomi tardivi (~pH 5,0), allora dovrebbe essere selezionata una sonda con un pK_a sensibile all'interno di tale intervallo (Figura 2C). La fluoroforo fluoresceina, che ha un pK_a di 6,4, è sensibile in modo ottimale all'interno di tale intervallo. È stato ampiamente utilizzato per misurare altri organelli simili, come i fagosomi, e sarà il fluoroforo di scelta in questo manoscritto^22,25. Come fluoroforo di riferimento, verrà utilizzata la tetrametilrodamina, che è insensibile al pH (Figura 1E). Altri fluorofori, come pHrodo e cypHer5e possono essere sostituiti dalla fluoresceina in cui le proprietà spettrali della fluoresceina corrispondono ad altre variabili sperimentali. Alcuni fluorofori di riferimento suggeriti per pHrodo e cypHer5e sono mostrati nella Figura 1.

Una seconda considerazione è il metodo con cui i due fluorofori saranno mirati specificamente ai macropinosomi. Il destrano della dimensione 70 kDa, che ha un raggio idrodinamico di circa 7 nm, non si attacca in modo non specifico alle cellule ed è incorporato nei macropinosomi, ma non nelle fosse rivestite di clatrina o nelle caveole, e quindi segna i macropinosomi (Figura 2A e Figura 3A, B)^16,24,26. In questo protocollo, il destro di destrano e la tetrametilrodamina (TMR) etichettati con fluoresceina da 70 kDa saranno utilizzati rispettivamente come sonde sensibili al pH e di riferimento.

Nelle cellule immunitarie innate, la macropinocitosi e la fagocitosi rappresentano le due principali vie per l'internalizzazione del materiale esogeno per l'elaborazione e la successiva presentazione alle cellule della risposta immunitaria adattativa²⁷. Il controllo attento e coordinato della chimica redox del lume di fagosomi e macropinosomi è fondamentale per l'elaborazione specifica del contesto del materiale esogeno. Forse il regolatore più studiato degli eventi ossidativi nei fagosomi è la NADPH ossidasi, un grande complesso multi-subunità che produce grandi quantità di specie reattive dell'ossigeno (ROS) all'interno del lume dei fagosomi²⁸. Infatti, la sua attività è fondamentale per l'appropriata elaborazione dell'antigene all'interno dei fagosomi^29,30. Tuttavia, l'attività della NADPH ossidasi sulle membrane macropinosomiali non è stata esplorata.

In questo protocollo, l'estere succinimidilico H2DCFDA viene utilizzato per misurare gli eventi ossidativi all'interno del macropinosoma. Questa è una forma modificata di fluoresceina (2',7'-dicloroidoidrofluoresceina diacetato), che è minimamente fluorescente nella sua forma ridotta. Dopo l'ossidazione, la sua emissione di fluorescenza aumenta in modo significativo. Vale tuttavia la pena notare un avvertimento significativo di H2DCFDA - poiché si basa sulla fluorofora fluoresceina, la sua fluorescenza è anche spenta in compartimenti acidi e bisogna fare attenzione a controllare questa variabile quando si progettano esperimenti²⁸. Simile all'approccio per la misurazione del pH, l'estere succinimidilico H2DCFDA sarà fissato covalentemente a 70 kDa destrano e il destrano da 70 kDa con etichetta TMR sarà usato come fluoroforo di riferimento (Figura 3A).

L'ovalbumina fluorescente sarà utilizzata per misurare la degradazione delle proteine all'interno dei macropinosomi. L'ovalbumina utilizzata qui è densamente etichettata con un colorante FL 4,4-difluoro-4-bora-3a,4a-diaza-s-indacene (BODIPY) FL auto-spento. Dopo la digestione, i peptidi fortemente fluorescenti etichettati con coloranti vengono liberati. Poiché l'ovoalbumina non può essere facilmente coniugata a 70 kDa destrano, le cellule con destrano da 70 kDa e ovalbumina in fase fluida etichettati con TMR saranno co-incubate. Il segnale TMR verrà utilizzato per generare una maschera macropinosomica durante l'analisi post-imaging e il segnale liberato dall'ovoalbumina digerita sarà misurato all'interno della maschera (Figura 3B).

Protocollo

1. Preparazione delle cellule

1. Coltiva cellule Raw264.7 a 37 °C e dal 5% di CO₂ al 70% di confluenza in RPMI integrato con il 10% di siero inattivato dal calore.
2. Un giorno prima del test, seminare raw264,7 cellule ad una densità di 5 x 10⁴ cellule per pozzetti in una piastra a 96 pozzetti. Assicurarsi che ogni pozzo contenga 100 μL di terreno di coltura. Assicurarsi che la piastra a 96 pozzetti abbia lati neri e un fondo di vetro per l'imaging.
   NOTA: Qui, le piastre a 96 pozzi sono state utilizzate per l'imaging. Le piastre a 96 pozzetti consentono l'uso di piccole quantità di cellule e reagenti rispetto alle camere di imaging più grandi. Tuttavia, è possibile utilizzare qualsiasi camera progettata per l'imaging di cellule vive e i reagenti possono essere scalati di conseguenza.
3. Il giorno del test, verificare se i pozzi sono confluenti almeno al 70%.

2. Misurazione del pH dei macropinosomi

1. Preparare le cellule come nella sezione 1.
2. Lavare tutti i pozzi con 100 μL di HBSS a 37 °C.
3. Riempire ogni pozzo con 100 μL di HBSS contenenti 0,025 mg/mL di destrano da 70 kDa con etichetta TMR e 0,025 mg/mL di destrano da 70 kDa con etichetta con fluoresceina.
4. Posizionare le celle in un'incubatrice impostata a 37 °C per 15 minuti.
5. Rimuovere le cellule dall'incubatore e lavare le cellule 6 volte con 100 μL di HBSS.
6. Riempire ogni pozzo con 100 μL di HBSS a 37 °C.
7. Posizionare la piastra sul microscopio con uno stadio e una camera riscaldati.
8. Regolare i parametri di eccitazione/emissione per ciascun fluoroforo in base alle esigenze.
   NOTA: le condizioni ideali per l'acquisizione delle immagini variano con i fluorofori utilizzati e le singole configurazioni del microscopio. Qui, le immagini sono state acquisite su un microscopio confocale a scansione laser Leica SP5. TMR è stato eccitato con una linea laser 543 e l'emissione è stata raccolta da 610 nm a 650 nm. La fluoresceina è stata eccitata con una linea laser 488 e l'emissione è stata raccolta da 500 nm a 550 nm. È stato utilizzato un obiettivo di immersione in olio 63x ed è stato acquisito un volume Z di 10 μm a intervalli di 0,5 μm.
9. Acquisire un'immagine da ciascun pozzo, alternando fluorofori tra ciascun pozzo.
10. Dopo la prima acquisizione, controlla se tutti i pozzi sono rimasti a fuoco su tutta la piastra.
11. Acquisisci immagini di ciascun pozzo a intervalli di 1-15 minuti per il periodo di tempo desiderato.

3. Calibrazione in situ del pH del macropinosoma

1. Durante l'acquisizione dell'immagine, preparare 1 L di soluzione ricca di potassio (K⁺-rich) contenente 140 mM KCl, 1 mM MgCl₂, 1 mM CaCl₂e 5 mM di glucosio. Integrare un volume di 400 mL della soluzione ricca di K⁺con 25 mM HEPES (da una soluzione stock da 1 M, pH 7,2) e un volume separato di 400 mL con 25 mM MES (da una soluzione stock 0,5 M, pH 6,0).
2. Regolare un'aliquota di 50 mL della soluzione ricca di K⁺tamponata con HEPES da 25 mM a pH 7,5 utilizzando 10 M HCl o 10 M KOH secondo necessità.
3. Regolare tre aliquote separate da 50 mL della soluzione ricca di K⁺tamponata con MES da 25 mM a pH 6,5, pH 5,5 e pH 5,0 utilizzando 10 M HCl o 10 M KOH secondo necessità.
   NOTA: Un tampone di acido acetato-acetico può essere preferibile per soluzioni a pH più basso.
4. Dopo il completamento dell'acquisizione dell'immagine, rimuovere l'HBSS dalla piastra a 96 pozzi contenente le celle e sostituirlo con la soluzione ricca di K⁺che si trova a pH 7,5.
5. Aggiungere nigericina ad una concentrazione finale di 10 μg/ml.
   NOTA: La nigericina è uno ionoforo che scambia K⁺ per H⁺. Impostando la concentrazione K⁺ della soluzione ricca di K⁺su un valore che si avvicina alla concentrazione K⁺ del citosol, si può garantire che la nigericina blocca il pH del macropinosoma a quello del citosol, che a sua volta riflette il pH del tampone di calibrazione.
6. Posizionare la piastra sul microscopio e acquisire le immagini di ciascun pozzo utilizzando le stesse impostazioni di acquisizione di cui sopra.
7. Ripetere i passaggi 3.5 e 3.6 per ogni buffer di calibrazione.

4. Analisi dei dati per il pH del macropinosoma

1. Utilizzando il software FIJI, sottrarre lo sfondo sia dal TMR che dal canale della fluoresceina.
2. Generare una maschera sul canale TMR. Per generare una maschera, convertire l'immagine in un'immagine binaria selezionando Regola soglia > > Applica. Quindi, evidenziare l'immagine binaria e selezionare Modifica > selezione > Crea maschera.
3. Applicalo sia alle immagini TMR che a quella fluoresceina. A tale scopo, evidenziare la maschera e selezionare Modifica > selezione > Crea selezione. Fare clic sull'immagine TMR e premere Maiusc + E per applicare la maschera al canale TMR. Allo stesso modo, fare clic sull'immagine della fluoresceina e premere Maiusc + E per applicare la maschera al canale OB.
4. Registrare l'intensità di TMR e fluoresceina per ogni macropinosoma all'interno delle maschere.
5. Ripeti i passaggi 4.1-4.3 per ogni punto temporale del corso temporale.
6. Ripetere i passaggi 4.1-4.3 per le immagini acquisite nella calibrazione in situ.
7. Dividere l'intensità della fluoresceina per l'intensità TMR per generare il rapporto fluoresceina:TMR.
8. Traccia il pH rispetto ai rapporti fluoresceina:TMR per le immagini di calibrazione.
9. Adatta una curva ai dati di calibrazione.
10. Interpolare i dati per ogni punto temporale del corso temporale per ottenere valori assoluti di pH.

5. Misurazione degli eventi ossidativi all'interno dei macropinosomi

1. Preparare le cellule come nella sezione 1.
2. Un giorno prima del test, preparare l'estere succinimidilico H2DCFDA etichettato 70 kDa destrano riconsoscendo 10 mg di 70 kDa destrano-ammino in 1 mL di soluzione di bicarbonato di sodio 0,1 M (pH 8,3). Aggiungere 1 mg dell'estere succinimidyl H2DCFDA alla soluzione di destrano-ammino e incubare per 1 ora. Dialyze il destrano da 70 kDa con etichetta H2DCFDA contro PBS. Non conservare per più di 1 giorno poiché il destrano da 70 kDa etichettato H2DCFDA si ossida al momento della conservazione.
3. Il giorno del test, lavare tutti i pozzi con 100 μL di HBSS a 37 °C.
4. Riempire ogni pozzo con 100 μL di HBSS contenenti 0,025 mg/mL di destrano da 70 kDa con etichetta TMR e 0,025 mg/mL di destrano da 70 kDa con marchio H2DCFDA.
5. Posizionare le celle in un'incubatrice impostata a 37 °C per 15 minuti.
6. Rimuovere le cellule dall'incubatore e lavare le cellule 6 volte con 100 μL di HBSS.
7. Riempire ogni pozzo con 100 μL di HBSS a 37 °C.
8. Posizionare la piastra sul microscopio con uno stadio e una camera riscaldati e regolare i parametri di eccitazione / emissione per ciascun fluoroforo secondo necessità.
   NOTA: le condizioni ideali per l'acquisizione delle immagini variano con i fluorofori utilizzati e le singole configurazioni del microscopio. Qui le immagini sono state acquisite su un microscopio confocale a scansione laser Leica SP5. TMR è stato eccitato con una linea laser 543 e l'emissione è stata raccolta da 610 nm a 650 nm. H2DCFDA è stato entusiasta di una linea laser 488 e l'emissione è stata raccolta da 500 nm a 550 nm. È stato utilizzato un obiettivo di immersione in olio 63x e un volume Z di 10 μm è stato acquisito a intervalli di 0,5 μm.
9. Acquisire un'immagine da ciascun pozzo, alternando fluorofori tra ciascun pozzo.
10. Dopo la prima acquisizione, controlla se tutti i pozzi rimangono a fuoco su tutta la piastra.
11. Acquisisci immagini di ciascun pozzo a intervalli di 1-15 minuti per il periodo di tempo desiderato.

6. Analisi dei dati per eventi ossidativi all'interno di macropinosomi

1. Utilizzando il software FIJI, sottrarre lo sfondo da entrambi i canali TMR e H2DCFDA.
2. Generare una maschera sul canale TMR. Per generare una maschera, convertire l'immagine in un'immagine binaria selezionando Regola soglia > > Applica. Quindi, evidenziare l'immagine binaria e selezionare Modifica > selezione > Crea maschera.
3. Applicare la maschera alle immagini TMR e H2DCFDA. A tale scopo, evidenziare la maschera e selezionare Modifica > selezione > Crea selezione. Fare clic sull'immagine TMR e premere Maiusc + E per applicare la maschera al canale TMR. Allo stesso modo, fare clic sull'immagine H2DCFDA e premere Maiusc + E per applicare la maschera al canale H2DCFDA.
4. Registrare l'intensità TMR e H2DCFDA per ogni macropinosoma all'interno delle maschere.
5. Ripeti i passaggi 4.1-4.3 per ogni punto temporale del corso temporale.
6. Dividere l'intensità H2DCFDA per l'intensità TMR per generare un rapporto H2DCFDA:TMR.
7. Traccia il rapporto H2DCFDA: TMR contro il tempo.

7. Misurare la digestione delle proteine all'interno dei macropinosomi

1. Preparare le cellule come nella sezione 1.
2. Il giorno del test, lavare tutti i pozzi con 100 μL HBSS a 37 °C.
3. Sciogliere l'ovoalbumina con etichetta BODIPY ad una concentrazione di 4 mg/mL in HBSS.
4. Riempire ogni pozzo con 100 μL di HBSS contenenti 0,025 mg/mL di destrano da 70 kDa con etichetta TMR e 0,2 mg/mL di ovoalbumina con etichetta BODIPY.
5. Posizionare le celle in un'incubatrice impostata a 37 °C per 15 minuti.
6. Rimuovere le cellule dall'incubatore e lavare le cellule 6 volte con 100 μL di HBSS.
7. Riempire ogni pozzo con 100 μL di HBSS a 37 °C.
8. Posizionare la piastra sul microscopio con uno stadio e una camera riscaldati e regolare i parametri di eccitazione / emissione per ciascun fluoroforo secondo necessità.
   NOTA: le condizioni ideali per l'acquisizione delle immagini variano con i fluorofori utilizzati e le singole configurazioni del microscopio. Qui, le immagini sono state acquisite su un microscopio confocale a scansione laser Leica SP5. TMR è stato eccitato con una linea laser 543 e l'emissione è stata raccolta da 610 nm a 650 nm. BODIPY è stato eccitato con una linea laser 488 e l'emissione è stata raccolta da 500 nm a 550 nm. È stato utilizzato un obiettivo di immersione in olio 63x ed è stato acquisito un volume Z di 10 μm a intervalli di 0,5 μm.
9. Acquisire un'immagine da ciascun pozzo, alternando fluorofori tra ciascun pozzo.
10. Dopo la prima acquisizione, controlla se tutti i pozzi rimangono a fuoco su tutta la piastra.
11. Acquisisci immagini di ciascun pozzo a intervalli di 1-15 minuti per il periodo di tempo desiderato.

8. Analisi dei dati per la digestione delle proteine all'interno dei macropinosomi

1. Utilizzando il software FIJI, sottrarre lo sfondo da entrambi i canali TMR e BODIPY.
2. Generare una maschera sul canale TMR e applicarla sia alle immagini TMR che BODIPY come nei passaggi 6.2 e 6.3 precedenti (Figura 3B).
3. Registrare l'intensità TMR e BODIPY per ciascun macropinosoma all'interno delle maschere.
4. Ripeti i passaggi 4.1-4.3 per ogni punto temporale del corso temporale.
5. Dividere l'intensità BODIPY per l'intensità TMR per generare il rapporto BODIPY:TMR.
6. Traccia il rapporto BODIPY:TMR rispetto al tempo.

Risultati

Quando si misura il pH dei macropinosomi, c'è un periodo di tempo per il quale la dinamica dell'acidificazione non può essere misurata. Questo periodo corrisponde alla fase di carico destro (riquadro grigio in Figura 2C e Figura 3C,D)e varierà a seconda del tipo di cella utilizzata. La durata della fase di carico varierà con (i) l'attività macropinocitica delle cellule e (ii) la sensibilità dello strumento utilizzato. Si raccomanda di rego...

Discussione

Sebbene esistano numerosi protocolli per misurazioni sia a basso che ad alto rendimento dell'assorbimento macropinocitico in macrofagi, fibroblasti e persino Dictyostelium spp. ^{3,7,31,32,33,}pochissimi tentativi sono stati fatti per misurare la biochimica luminale di questi compartimenti dinamici. Ciò è probabilmente dovuto a una scarsità di sonde c...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Black-walled 96 well plate	PerkinElmer	6005430
CypHer5e, NHS ester	Cytiva	PA15401
Dextran-amino 70 kDa	Invitrogen	D1862
DQ-ovalbumin	Invitrogen	D12053
FITC-dextran 70 kDa	Invitrogen	D1823
HBSS	Gibco	14287
Nigericin	Sigma Aldrich	N7143
OxyBurst Green-SE	Invitrogen	D2935
pHrodo Red, SE	Invitrogen	P36600
Raw264.7 cells	ATCC	TIB-71
RPMI medium	Gibco	11875093
SP5 Confocal Microscope	Leica	-
TRITC-dextran 70 kDa	Invitrogen	D1819
u-Dish	Ibidi	81156