二重蛍光系比測定法を用いたマクロピノソームのpH、レドックス化学、分解能の測定

要約

生細胞の個々のマクロピノソームにおけるpH、酸化事象、タンパク質消化を測定するためのプロトコルについて述べています。二重蛍光系比測定顕微鏡と、人口ベースの技術よりも利点に重点が置かれています。

要約

近年、マクロピノサイトーシスの分野は急速に成長しています。マクロピノサイトーシスは、自然免疫細胞が生体恒常性および免疫を維持する中心的なメカニズムとして出現した。同時に、そのホメオスタティックな役割とは対照的に、癌およびウイルス感染を含む様々な病理を促進することもできる。他のエンドサイトーシスのモードとは異なり、マクロピノソームの成熟を研究するために開発されたツールは未発達のままです。ここでは、初期および成熟したマクロピノソームの内腔内の酸化還元環境を研究するための新しく開発されたツールについてプロトコルが説明されています。pHを評価する際に蛍光顕微鏡のレシオメトリックを用いる方法論、活性酸素種の産生、および生細胞における個々のマクロピノソームの内腔内の分解能が記載されている。単一のオルガネラの測定は、人口ベースのアプローチでしばしば失われる時空間的不均一性を明らかにする利点を提供する。プローブ選択、計測、キャリブレーション、単細胞と母集団ベースの方法を含む二重蛍光色素比顕微鏡の基本原理に重点が置かれています。

概要

マクロピノサイトーシスとは、マクロピノソーム^1,2と呼ばれる膜結合細胞質小器官への大量の細胞外液の取り込みのことをい^う。これは、アメーバ・ジクチオステリウム属のような自由に生きている単細胞生物によって行われる高度に保存されたプロセスである。^3、アントゾアン⁴とメタゾアン²と同様に。ほとんどの細胞では、マクロピノサイトーシスは誘発事象である。細胞表面受容体のライゲーションは、フリルと呼ばれるアクチン駆動形質膜拡張の突起を誘導する。これらのフリルの一部は、いくつかの十分に理解されていないメカニズムによって、マクロピノソームを形成するために遠位の先端をシールします(しかし、この方法の論文の範囲を超えて、マクロピノサイトーシスの力学に関する詳細なレビューについては、参照^{1、2、5、6、7}を参照してください)。マクロピノサイトーシスを誘発する細胞外刺激は、最も多い可溶性増殖因子^5,8である。したがって、マクロピノサイトー事象は、細胞が成長を促進するために有用な代謝産物を導き出すことができる細胞外物質のボーラスの摂取を可能にする。残念ながら、栄養分娩のためのこの経路はまた、病理学を駆動することができます。ある種の癌細胞は、連続的または構成的なマクロピノサイトーシスをもたらす突然変異を収容する。栄養素の連続的な送達は癌細胞の制御不能な増殖を促進し、特に積極的な腫瘍^{9、10、11、12、13}にリンクされている。同様に、ウイルスは、宿主細胞へのアクセスを得るためにマクロピノサイトーシスを誘導し、それによってウイルス病理¹⁴を駆動することができる。

マクロピノサイトーシスは、病原体に対する免疫の維持にも機能する。マクロファージや樹状細胞などの特定の自然免疫細胞は、マクロピノサイトーシス^6、15、16を介して細胞外液の構成的かつ積極的なサンプリングに従事する。このマクロピノサイトーシスのモードは非常に活発であり、単一の樹状細胞は^、1時間ごとに自重に相当する細胞外液の体積を持つことができます。この構成的なサンプリングにもかかわらず、マクロファージと樹状細胞は腫瘍細胞のように制御不能に複製されず、代わりに、潜在的な脅威の存在、または実際に不在を知らせるために情報を抽出できるように細胞外物質を処理するように見えます。情報は、i)細胞内病原体認識受容体およびii)適応免疫系^16、18、19の細胞によるスクリーニングのために主要な組織適合性分子にロードされ得るアミノ酸の短い伸縮によって読み取ることができる病原体関連分子パターンとして抽出される。病原体が免疫細胞による情報処理のためにこの経路を覆すかどうかは、現時点では不明である。

免疫と恒常性の両方の維持および他のより一般的に研究されたエンドサイトーシスのモードとは対照的に、マクロピノサイトーシスのこれらの明確かつ重要な役割にもかかわらず、マクロピノソームの内部(発光)働きはほとんど知られていない。マクロピノソームの発光生化学を研究するための標準化されたプロトコルとツールを開発することは、私たちが彼らのユニークな生物学をよりよく理解するのに役立つだけでなく、薬物送達を含む新しい治療戦略に活用できる洞察を提供します^20.この方法原稿は、マクロピノソームの発光生化学のさまざまな側面を単一のオルガネラレベルで解剖するための最近開発されたツールに焦点を当てます。

フルオロフォアは、オルガネラの特定の生化学生物を測定するために使用することができます(i)関心のある区画に優先的に分割し、および/またはii)関心のあるパラメータに応答してスペクトル変化を受ける。例えば、pHの場合、アクリジンオレンジ、クレシルバイオレット、およびリゾトラッカー色素などの蛍光弱塩基は酸性オルガネラに優先的に蓄積する。したがって、それらの相対強度は、標識されたオルガネラが酸性であることを大まかな示すものである。フルオレセイン、pHrodo、cypHer5eなどの他のpH応答性フルオロフォアは、陽子に結合するとスペクトル変化を起こします(図1A-C)。したがって、pH感受性蛍光性蛍光体の蛍光発光の変化は、pHの有用近似を提供することができる。しかし、単一の蛍光器を使用すると、多くの欠点があります。例えば、焦点面への変更、光漂白、および個々のオルガネラの体積の変化は、マクロピノソーム²¹において一般的に起こる、単一蛍光性の蛍光強度の変化を誘発し、これは^容易に22のために修正することができない。したがって、単一波長評価は酸性コンパートメントの可視化には有用であるが、純粋に定性的である。

より定量的なアプローチは、対象のオルガネラへの参照フルオロフォアと共にパラメータ感受性フルオロフォアを標的にすることです。参照フルオロフォアは、オルガネラ内の生化学的変化に対して理想的に無神経である(図1D-F)、したがって、焦点面、オルガネラ体積、および、ある程度、光漂白²³の変化を修正するために使用することができる。このアプローチを用いて、二重蛍光系蛍光率と称し、パラメータ感受性蛍光の蛍光発光率を参照蛍光に対して生成することにより補正を行うことができる。

ここで、このプロトコルは、マクロピノソーム内のpH、酸化イベント、およびタンパク質分解を測定するために、二重蛍光泳動比イメージングの原理を利用するであろう。いずれの場合も、対象のパラメータと参照フルオロフォアに敏感な蛍光色素が選択されます。特にマクロピノソームに対してフルオロフォアを標的とするために、それらは70kDaデキストランに共有結合され、マクロピノソーム²⁴に優先的に組み込まれる。すべてのアッセイはRaw264.7細胞で行われますが、他の細胞タイプに適合させることができます。可能な限り、蛍光比は基準曲線に対して較正され、絶対値を得る。重要なことに、すべての測定は、マクロピノソームの光環境の動的および定量的評価のために、生細胞で行われます。

pH感受性蛍光ホルを選択する場合、いくつかの考慮事項を検討する必要があります。最初の_pKは、プローブが最も敏感になるpH値の範囲を示すフルオロフォアのaです。形成直後にマクロピノソームのpHが細胞外培地(〜pH7.2)に近いものであり、後期のエンドーソームとリソソーム(〜pH5.0)との相互作用によって徐々に酸性化すると仮定した場合、その範囲内に感受性である_pKaを有するプローブ(図2C)を選択すべきである。6.4のpKaを有するフルオロフォアフルオレセインは、その範囲内で最適に敏感である。これは、ファゴソームなどの他の同様のオルガネラを測定するために広く使用されており、この原稿^22,25において選択したフルオロフォアとなる。参考蛍光体として、テトラメチルローダアミンが使用され、pHに対して無感受性である(図1E)。pHrodoやcypHer5eなどの他のフルオロフォアは、フルオレセインのスペクトル特性が他の実験変数と一致するフルオレセインに代わりてもよい。pHrodo および cypHer5e に対して推奨される参考蛍光体のいくつかを図 1に示します。

第二の考察は、2つのフルオロフォアをマクロピノソームに特異的に標的とする方法である。約7nmの流体力学的半径を有するサイズ70kDaのデキストランは、細胞に非特異的に固執せず、マクロピノソームに組み込まれるが、クラトリンコーティングされたピットやカベオラには含まれないため、マクロピノソーム(図2Aおよび図3A、B)16、24、26を示す。このプロトコルでは、フルオレセイン標識70kDaデキストランおよびテトラメチルrhodamine(TMR)標識70 kDaデキストランがそれぞれpH感受性および基準プローブとして使用される。

自然免疫細胞において、マクロピノサイトーシスおよび貪食細胞症は、適応免疫応答²⁷の細胞への処理とその後の提示のための外因性物質の内在化のための2つの主要な経路を表す。ファゴソームとマクロピノソームの内腔のレドックス化学の慎重かつ協調的な制御は、外因性物質の文脈特異的な処理にとって重要である。ファゴソームにおける酸化事象の最もよく研究された調節因子は、ファゴソーム²⁸の内腔内で大量の活性酸素種(ROS)を産生する大型マルチサブユニット複合体であるNADPHオキシダーゼである。実際、その活性は、ファゴソーム^29,30内で適切な抗原処理の中心である。しかし、マクロピノソーム膜に対するNADPHオキシダーゼの活性は検討されていない。

このプロトコルでは、H2DCFDAスクシニミジルエステルは、マクロピノソーム内の酸化事象を測定するために使用される。これは、フッ素(2',7'-ジクロロジヒドロフルオアセインジアセチン)の修飾された形態であり、減少した形態で最小限の蛍光である。酸化の際、その蛍光発光は著しく増加する。しかし、H2DCFDAの重要な注意点は注目に値する - それはフルオロフォアフルオレセインに基づいているので、その蛍光も酸性コンパートメントで消光され、実験²⁸を設計する際にこの変数を制御するために注意する必要があります。pHを測定するアプローチと同様に、H2DCFDAスクシニミジルエステルは70kDaデキストランに共有結合され、TMR標識70kDaデキストランが参照フルオロフォアとして使用される(図3A)。

蛍光オバアルブミンは、マクロピノソーム内のタンパク質分解を測定するために使用されます。ここで使用されるオボアルブミンは、自己消光された4,4-ジフルオロ-4-ボラ-3a、4a-ジアザ-s-インダセン(BODIPY)FL染料で密にラベル付けされています。消化の際、強い蛍光色素標識ペプチドが遊離されます。オボアルブミンは70kDaデキストランに容易にコンジュゲートすることができないので、TMR標識70 kDaデキストランと流体相オブアルブミンを有する細胞は共インキュベートされる。TMR信号は、画像後分析中にマクロピノソームマスクを生成するために使用され、消化されたオボアルブミンから解放された信号はマスク内で測定される(図3B)。

プロトコル

1. 細胞の調製

1. 37°CでRaw264.7細胞を増殖させ、10%の熱不活性化血清を加えたRPMIで5%CO2〜70%の合流性を有する。
2. アッセイの前日には、96ウェルプレートで1ウェルあたり5 x 10⁴ 細胞の密度でRaw264.7細胞をシードします。各ウェルに100 μLの成長培地が含まれていることを確認します。96ウェルプレートに黒い側面とイメージング用のガラス底があることを確認します。
   注: ここでは、96 ウェルプレートをイメージングに使用しました。96ウェルプレートは、より大きな画像処理室に比べて少量の細胞および試薬を使用することを可能にします。しかし、ライブ細胞のイメージング用に設計されたチャンバーはいずれも使用でき、それに応じて試薬をスケールアップすることができます。
3. アッセイの日に、ウェルが少なくとも70%コンフルエントであるかどうかを確認してください。

2. マクロピノソームpHの測定

1. セクション 1 のようにセルを準備します。
2. 37°Cで100μLのHBSSですべてのウェルを洗います。
3. TMR標識70 kDaデキストランの0.025 mg/mLとフルオレセイン標識70 kDaデキストランの0.025 mg/mLを含むHBSSの100 μLを各ウェルに充填してください。
4. 細胞を37°Cに設定したインキュベーターに15分間入れる。
5. インキュベーターから細胞を取り出し、HBSSの100 μLで細胞6倍を洗います。
6. 37 °CでHBSSを100 μLずつ充満します。
7. 加熱されたステージとチャンバーで顕微鏡の上にプレートを置きます。
8. 必要に応じて、各蛍光色素の励起/放出パラメータを調整します。
   注:画像取得の理想的な条件は、使用される蛍光体と個々の顕微鏡のセットアップによって異なります。ここでは、Leica SP5レーザー走査共焦点顕微鏡で画像を取得した。TMRは543レーザーラインで励起され、放出は610 nmから650 nmまで収集された。フルオレセインは488レーザーラインで励起し、500 nmから550 nmまでの放出を収集した。63倍の油浸し目的を使用し、10 μmのZ体積を0.5 μm間隔で取得しました。
9. 各ウェルから画像を取得し、各ウェルの間に蛍光色素を交互に使用します。
10. 最初の取得後、すべての井戸がプレート全体に焦点を合わせ続けているかどうかを確認します。
11. 所望の時間の1-15分間隔で各井戸の画像を取得します。

3. マクロピノソームpHの その時点 での較正

1. 画像取得中に、140 mM KCl、1 mM MgCl 2、1 mM_CaCl2、および5 mMグルコースを含むカリウムが豊富な(K^+-リッチ)溶液を1L調製します。25 mM HEPES (1 M、 pH 7.2 ストック溶液) と 25 mM MES (0.5 M、pH 6.0 ストックソリューションから) を含む別の 400 mL 容積を加えた K⁺豊富な溶液の 400 mL 容積を補います。
2. 必要に応じて、10 M HCl または 10 M KOH を使用して、25 mM HEPES でバッファリングされた K⁺リッチソリューションの 50 mL アリコートを pH 7.5 に調整します。
3. 必要に応じて、10 M HCl または 10 M KOH を使用して、25 mM MES でバッファーされる K⁺リッチソリューションの 3 つの別個の 50 mL アリコートを pH 6.5、pH 5.5、および pH 5.0 に調整します。
   注: 低いpH溶液には酢酸酢酸緩衝液が好ましい場合があります。
4. 画像取得が完了したら、細胞を含む96ウェルプレートからHBSSを取り出し、pH 7.5にある^K+-リッチ溶液に交換します。
5. 10 μg/mLの最終濃度にニジェリシンを加えます。
   注:ニジェリシンは、H⁺のためにK⁺を交換するイオノフォアです。K+リッチ溶液の^K+濃度をサイトゾルの^K+濃度に近似する値に設定することで、ニジェリジシンがマクロピノソームのpHをサイトゾルのpHにクランプし、キャリブレーションバッファのpHを反射することを保証できる。
6. プレートを顕微鏡に戻し、上記と同じ取得設定を使用して各ウェルの画像を取得します。
7. 各キャリブレーションバッファに対して、ステップ3.5と3.6を繰り返します。

4. マクロピノソームpHのデータ分析

1. フィジーソフトウェアを使用して、TMRとフルオレセインチャネルの両方から背景を差し引きます。
2. TMR チャネルでマスクを生成します。マスクを生成するには、[閾値を調整]を選択してイメージ >をバイナリイメージ>変換>します。次に、バイナリイメージをハイライト表示し、[ 選択範囲>編集]を選択>マスクを作成します。
3. TMR画像とフルオレセイン画像の両方に適用します。これを行うには、マスクをハイライト表示し、[ 選択範囲の編集] >選択>選択を作成します。TMR イメージをクリックし 、Shift + E キーを押して、マスクを TMR チャネルに適用します。同様に、フルオレセイン画像をクリックし 、Shift + E キーを押して、OBチャンネルにマスクを適用します。
4. マスク内のマクロピノソームごとにTMRとフルオレセインの強度を記録します。
5. 時間コースの各時点に対して、ステップ 4.1 から 4.3 を繰り返します。
6. in キャリブレーションで撮影した画像について、手順 4.1 ~ 4.3 を 繰り返します。
7. フッ素の強度を TMR 強度で割って、フルオレセイン:TMR 比を生成します。
8. キャリブレーション画像のフルオレセイン:TMR比に対してpHをプロットします。
9. キャリブレーションデータにカーブをフィットさせます。
10. 時間経過から各時点のデータを補間して、絶対 pH 値を取得します。

5. マクロピノソーム内の酸化事象の測定

1. セクション 1 のようにセルを準備します。
2. アッセイの前日、H2DCFDAスクシニミジルエステルを調製し、70 kDaデキストランの標識を10mgの70kDaデキストランアミノを0.1 Mの炭酸水素ナトリウム溶液(pH 8.3)の1mLで再懸濁して調製した。Dextran-アミノ溶液にH2DCFDAスクシニミジルエステルの1mgを加え、1時間インキュベートします。D透析 H2DCFDA ラベル 70 kDa dextran を PBS に対して.H2DCFDA標識70 kDaデキストランは、貯蔵時に酸化するので、1日以上保存しないでください。
3. アッセイの日に、37°CでHBSSの100 μLですべての井戸を洗います。
4. TMR標識70 kDaデキストランの0.025 mg/mLとH2DCFDA標識70 kDaデキストランの0.025 mg/mLを含むHBSSの100 μLで各井戸を充填します。
5. 細胞を37°Cに設定したインキュベーターに15分間入れる。
6. インキュベーターから細胞を取り出し、HBSSの100 μLで細胞6倍を洗浄します。
7. 37 °CでHBSSを100 μLずつ充満します。
8. 加熱されたステージとチャンバーを使用して顕微鏡にプレートを置き、必要に応じて各蛍光色素の励起/放出パラメータを調整します。
   注:画像取得の理想的な条件は、使用される蛍光体と個々の顕微鏡のセットアップによって異なります。ここでは、ライカSP5レーザー走査共焦点顕微鏡で画像を取得しました。TMRは543レーザーラインで励起し、610 nmから650 nmまでの放出を収集した。H2DCFDAは488レーザーラインで励起され、放出は500 nmから550 nmまで収集された。63倍の油浸し目的を使用し、10 μmのZ体積を0.5 μm間隔で取得しました。
9. 各ウェルから画像を取得し、各ウェルの間に蛍光色素を交互に使用します。
10. 最初の取得後、すべてのウェルがプレート全体に焦点を合わせ続けるかどうかを確認します。
11. 所望の時間の1-15分間隔で各井戸の画像を取得します。

6. マクロピノソーム内の酸化事象のデータ解析

1. フィジーソフトウェアを使用して、TMRとH2DCFDAチャネルの両方から背景を差し引きます。
2. TMR チャネルでマスクを生成します。マスクを生成するには、[閾値を調整]を選択してイメージ >をバイナリイメージ>変換>します。次に、バイナリイメージをハイライト表示し、[ 選択範囲>編集]を選択>マスクを作成します。
3. マスクを TMR および H2DCFDA イメージの両方に適用します。これを行うには、マスクをハイライト表示し、[ 選択範囲の編集] >選択>選択を作成します。TMR イメージをクリックし 、Shift + E キーを押して、マスクを TMR チャネルに適用します。同様に、H2DCFDA イメージをクリックし 、Shift + E を押して、マスクを H2DCFDA チャネルに適用します。
4. マスク内のマクロピノソームごとにTMRとH2DCFDAの強度を記録します。
5. 時間コースの各時点に対して、ステップ 4.1 から 4.3 を繰り返します。
6. H2DCFDA強度をTMR強度で割り、H2DCFDA:TMR比を生成する。
7. 時間に対するH2DCFDA:TMR比をプロットします。

7. マクロピノソーム内のタンパク質消化の測定

1. セクション 1 のようにセルを準備します。
2. アッセイの日には、37°Cで100 μL HBSSですべてのウェルを洗浄してください。
3. HBSSで4mg/mLの濃度にBODIPY標識オボアルブミンを溶解します。
4. TMRラベル70 kDaデキストランの0.025 mg/mLとBODIPYラベルのオボアルブミンの0.2 mg/mLを含むHBSSの100 μLを各ウェルに充填してください。
5. 細胞を37°Cに設定したインキュベーターに15分間入れる。
6. インキュベーターから細胞を取り出し、HBSSの100 μLで細胞6倍を洗浄します。
7. 37 °CでHBSSを100 μLずつ充満します。
8. 加熱されたステージとチャンバーを使用して顕微鏡にプレートを置き、必要に応じて各蛍光色素の励起/放出パラメータを調整します。
   注:画像取得の理想的な条件は、使用される蛍光体と個々の顕微鏡のセットアップによって異なります。ここでは、Leica SP5レーザー走査共焦点顕微鏡で画像を取得した。TMRは543レーザーラインで励起し、610 nmから650 nmまでの放出を収集した。BODIPYは488レーザーラインで励起され、500 nmから550 nmまでの放出を収集した。63倍の油浸し目的を使用し、10 μmのZ体積を0.5 μm間隔で取得しました。
9. 各ウェルから画像を取得し、各ウェルの間に蛍光色素を交互に使用します。
10. 最初の取得後、すべてのウェルがプレート全体に焦点を合わせ続けるかどうかを確認します。
11. 所望の時間の1-15分間隔で各井戸の画像を取得します。

8. マクロピノソーム内のタンパク質消化に関するデータ解析

1. フィジーのソフトウェアを使用して、TMR と BODIPY の両方のチャネルから背景を差し引きます。
2. TMR チャネルでマスクを生成し、上記のステップ 6.2 および 6.3 の手順 (図 3B)のように、TMR および BODIPY イメージの両方に適用します。
3. マスク内のマクロピノソームごとに TMR と BODIPY 強度を記録します。
4. 時間コースの各時点に対して、ステップ 4.1 から 4.3 を繰り返します。
5. BODIPY 強度を TMR 強度で割って、BODIPY:TMR 比を生成します。
6. 時間に対する BODIPY:TMR 比をプロットします。

結果

マクロピノソームpHを測定する場合、酸性化のダイナミクスを測定できない期間があります。この期間は、デキストラン荷重フェーズ(図2Cおよび図3C、Dの灰色のボックス)に対応し、使用するセルの種類によって異なります。ローディングフェーズの長さは、(i)細胞のマクロピノサイト活性と(ii)使用される器具の感度によって異なりま?...

ディスカッション

マクロファージ、線維芽細胞、さらにはジクチオステリウム属のマクロピノサイクの取り込みの低スループットと高スループットの両方の測定のためのプロトコルの数がありますが。3、7、31、32、33、非常に少数の試みは、これらの動的コンパートメントの発光生化学を測定するために行われている。

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Black-walled 96 well plate	PerkinElmer	6005430
CypHer5e, NHS ester	Cytiva	PA15401
Dextran-amino 70 kDa	Invitrogen	D1862
DQ-ovalbumin	Invitrogen	D12053
FITC-dextran 70 kDa	Invitrogen	D1823
HBSS	Gibco	14287
Nigericin	Sigma Aldrich	N7143
OxyBurst Green-SE	Invitrogen	D2935
pHrodo Red, SE	Invitrogen	P36600
Raw264.7 cells	ATCC	TIB-71
RPMI medium	Gibco	11875093
SP5 Confocal Microscope	Leica	-
TRITC-dextran 70 kDa	Invitrogen	D1819
u-Dish	Ibidi	81156