研究癌症转移至肺部的永久窗口

摘要

在这里，我们提出了一种用于为小鼠胸部手术植入永久留置光学窗口的方案，该方案可实现高分辨率的肺活体成像。窗口的持久性使其非常适合研究肺部的动态细胞过程，特别是那些缓慢进化的过程，例如播散性肿瘤细胞的转移性进展。

摘要

转移占癌症相关死亡率的约90%，涉及癌细胞从原发性肿瘤到继发部位（如骨骼，大脑和肺）的全身扩散。尽管经过了广泛的研究，但这一过程的机制细节仍然知之甚少。虽然常见的成像方式，包括计算机断层扫描（CT），正电子发射断层扫描（PET）和磁共振成像（MRI），提供不同程度的粗略可视化，但每种方式都缺乏检测单个肿瘤细胞动力学所需的时间和空间分辨率。为了解决这个问题，已经描述了许多技术用于常见转移部位的活体成像。在这些部位中，肺已被证明特别难以进入活体成像，因为它的细腻性和维持生命的关键作用。虽然之前已经描述了几种用于完整肺的单细胞活体内成像的方法，但所有方法都涉及高度侵入性和终末期手术，将最大可能的成像持续时间限制在6-12小时。这里描述的是一种改进的技术，用于永久植入用于肺部高分辨率成像（WHRIL）的微创胸腔光学窗口。结合经过调整的显微血管造影方法，创新的光学窗口有助于在多个成像会话和数周内以单细胞分辨率对完整肺进行连续活体成像。鉴于可以收集成像数据的前所未有的时间，WHRIL可以促进加速发现转移进展的动态机制和肺部许多其他生物过程。

引言

造成~90%的死亡，转移是癌症相关死亡的主要原因^1。在临床观察到的转移的主要部位（骨，肝，肺，脑^）2中，肺已被证明对通过活体显微镜进行体内成像特别具有挑战性。这是因为肺是永动机中一个微妙的器官。肺部的连续运动，进一步由胸内心脏运动加剧，是准确成像的重要障碍。因此，由于其相对难以获得高分辨率活体内光学成像的模式，肺内的癌症生长通常被认为是一个隐匿的过程^3。

在临床环境中，计算机断层扫描（CT），正电子发射断层扫描（PET）和磁共振成像（MRI）等成像技术可以在完整的重要器官（如肺）深处进行可视化^4。然而，虽然这些模式提供了对大器官的良好观察（通常甚至在临床症状发作之前揭示病理学），但它们的分辨率不足以检测单个播散的肿瘤细胞，因为它们在转移的早期阶段进展。因此，当上述方式提供任何肺转移迹象时，转移灶已经建立并增殖。由于肿瘤微环境在癌症进展和转移形成^5、6中起着举足轻重的作用，因此对研究体内转移性播种的最早步骤有很大的兴趣。这种兴趣进一步被进一步激发了人们的意识，即癌细胞甚至在检测到原发性肿瘤^{之前传播7，8，}并且越来越多的证据表明它们作为单个细胞存活并且处于休眠状态数年到数十年，然后才生长成宏观转移^9。

以前，单细胞分辨率下的肺成像必然涉及离体或外植体制剂10，11，12，13，将分析限制在单个时间点。虽然这些制剂确实提供了有用的信息，但它们并没有提供任何关于连接到完整循环系统的器官内肿瘤细胞动力学的见解。

最近在成像方面的技术进步使得在长达12小时14，15，16的时间内以单细胞分辨率对完整肺进行活体内可视化。这是在小鼠模型中完成的，使用涉及机械通气，胸腔切除术和真空辅助肺固定的方案。然而，尽管提供了生理完整肺的第一个单细胞分辨率图像，但该技术具有高度侵入性和终末性，从而排除了索引程序之外的进一步成像过程。因此，这种限制阻止了其应用于研究需要超过12小时的转移步骤，例如休眠和生长的重新启动14，15，16。此外，使用这种成像方法观察到的细胞行为模式必须谨慎解释，因为真空诱导的压差可能导致血流转移。

为了克服这些限制，最近开发了一种用于肺部高分辨率成像的微创窗口（WHRIL），便于在数天至数周的延长时间内进行连续成像，而无需机械通气¹⁷。该技术需要创建一个具有密封胸腔的"透明胸腔"，以保持正常的肺功能。该过程具有良好的耐受性，允许小鼠恢复而不会对基线活动和功能进行有意义的改变。为了在每次相应的成像过程中可靠地定位完全相同的肺区域，将一种称为显微刻图的技术应用于该窗口^18。通过这个窗口，可以捕获细胞到达肺血管床，穿过内皮，经历细胞分裂并生长成微转移的图像。

在这里，该研究详细介绍了用于植入WHRIL的改进手术方案，该方案简化了手术，同时提高了其可重复性和质量。虽然该协议旨在能够研究转移背后的动态过程，但该技术可以替代地应用于肺生物学和病理学的众多过程的研究。

研究方案

本议定书中描述的所有程序均按照脊椎动物使用的指南和法规进行，包括阿尔伯特爱因斯坦医学院机构动物护理和使用委员会的事先批准。

1. 窗户钝化

1. 用1%（w / v）酶活性洗涤剂溶液冲洗光学窗框（补充图2）。
2. 在玻璃罐内，将光学窗框浸没在5%（w / v）氢氧化钠溶液中，在70°C下30分钟。
3. 取下并用去离子水清洗窗框。
4. 在新的玻璃罐内，将光学窗框浸没在7%（w / v）柠檬酸溶液中，在55°C下10分钟。
5. 同样，取下并用去离子水清洗窗框。
6. 重复步骤1.2;然后，取下并用去离子水清洗窗框。

2. 手术准备

1. 在罩式或层流柜中进行手术。为避免手术区域受到污染，请分别确保不同的、分开的准备、手术和恢复区域。
2. 在手术前，在高压灭菌器中对所有手术器械进行消毒。如果计划后续程序，请使用热珠灭菌器对器械进行重新灭菌。对于这种外科手术，使用仅提示技术。
3. 打开加热的手术珠和磁珠灭菌器的电源。
4. 在麻醉室中用5%异氟醚麻醉小鼠。
5. 要去除头发，请慷慨地将脱毛膏涂抹在左上胸部切口部位。不超过20秒后，使用湿纸巾牢牢擦去头发和脱毛膏。根据需要重复上述步骤，以去除手术部位的所有毛发。
6. 使用2-0丝线，在22 G导管的底部打结，留下2英寸长的尾巴（见图1A）。

3. 肺窗手术

1. 用抗菌肥皂洗手。
2. 在每次新手术之前，戴上新的无菌手套。
3. 为了防止角膜干燥和对小鼠眼睛的损害，请在双眼上涂抹眼药膏。
4. 将10μL（0.1mg / kg）丁丙诺啡稀释在90μL无菌PBS中，然后皮下注射以确保术前镇痛。
5. 用丝线缝合的22 G导管¹⁵插入小鼠。使用充气灯泡，通过注意灯泡挤压时双侧胸部上升来确认插管成功。
6. 通过将2-0的丝线缝合线绑在小鼠的鼻子周围来固定插管导管（见图1B）。
7. 将鼠标放在加热的手术支架上，并将其放置在右侧外侧卧位以暴露左胸部。
8. 将呼吸机连接到插管导管。
9. 确保呼吸机上受控、稳定的通风，然后将异氟烷降低到3%。在手术开始时，在整个手术过程中定期进行，通过进行脚趾捏合测试来评估麻醉的充分性。
10. 使用纸胶带，颅骨和尾部分别将前肢和后肢固定到加热的手术阶段。沿着小鼠背部的长度放置另一块胶带，以最大限度地暴露于手术区域（见图1C）。
11. 打开罩子下的所有手术器械，以保持无菌。
12. 通过在小鼠皮肤上大量施用防腐剂对手术部位进行消毒。
13. 使用镊子，抬起皮肤并做一个~10毫米的圆形切口，胸骨左侧约7毫米，比肋下缘高出约7毫米（图1D）。
14. 仔细识别任何主要船只。如果需要分割血管，用电烙笔在两端烧灼以保持止血。
15. 切除肋骨上方的软组织。
16. 使用镊子抬高^第6^或第7肋。使用钝性微解剖剪刀的单刃，将圆润的一面朝向肺部，小心地刺穿^第6^和第7肋骨之间的肋间肌以进入胸内空间（图1E）。
17. 在缺损处小心地排出压缩空气罐，使肺塌陷并将其与胸壁分开。在短时间内发射压缩空气，以防止医源性肺损伤。
18. 将活检孔放在切割工具上（补充图1），并通过肋间切口小心地操纵切割工具的底座（图1F）。
19. 调整切削刀具底座的方向，使其与胸壁平行。在肋骨保持架上打一个5毫米的圆孔（图1G）。
    注意:确保暴露的肺组织是粉红色的，没有损伤的迹象。
20. 使用5-0丝绸缝合线，从孔处创建一个钱包线约1毫米，圆周，与肋骨交错（图1H）。
21. 定位窗框，使圆形缺陷的边缘在窗口的凹槽内对齐（见图1I）。
22. 通过紧紧绑住5-0丝绸缝合线来牢固地锁定植入的窗户。
23. 将100μL氰基丙烯酸酯凝胶粘合剂加载到1mL注射器中。
24. 通过施加稳定温和的压缩空气流约10-20秒来干燥肺部（图1J）。
25. 使用镊子抓住窗框的外缘，轻轻抬起以确保肺部与窗框的下表面分离。
26. 沿着光学窗框的底面分配一层薄薄的氰基丙烯酸酯粘合剂（图1K）。
27. 增加呼吸机上的呼气末正压 （PEEP） 以给肺部充气。
28. 保持10-20秒，施加轻柔但牢固的压力，将光学窗框连接到肺组织上（图1L）。
29. 将剩余的氰基丙烯酸酯凝胶粘合剂的5毫米滴剂滴到矩形盖玻片上。
30. 使用真空拾音器拾取 5 mm 盖玻片。将盖玻片的底面浸入粘合剂中，然后在矩形盖玻片的侧面刮掉多余的粘合剂三次，使得只剩下非常薄的一层（图1M）。
31. 小心地将盖玻片放置在光学窗框中心的凹槽内，并以一定角度保持在肺组织上方。短暂夹住呼吸机以产生正压，使肺部过度充气。使用旋转运动，将盖玻片与肺组织平行的方向，以在肺表面和盖玻片的下表面之间产生直接的叠加。保持轻柔的压力，使氰基丙烯酸酯粘合剂凝固（~25 s）。
32. 使用镊子将盖玻片与真空拾音器分离（图1N）。
33. 使用5-0丝线缝合线，再次创建钱包线，这次从皮肤切口的切缘圆周<1毫米。将多余的皮肤塞入窗框外缘下方，然后用锁结将其紧紧地绑住。
34. 为确保盖玻片和窗框之间的气密密封，请在金属玻璃界面处分配少量的液体氰基丙烯酸酯（见图1O）。
35. 将无菌针头连接到1 mL胰岛素注射器上。将针插入xiphoid突下方，向左肩推进，通过横膈膜进入胸腔。轻轻地拉回注射器，以从胸腔中除去任何残留的空气（见图1P）。
36. 从鼠标上取下磁带。
37. 关闭异氟醚。
38. 继续用100%氧气通气，直到鼠标准备好醒来。
39. 小心地将2-0丝线缝合线切在小鼠的鼻子周围，并拔管鼠标。
40. 将鼠标转移到干净的笼子中并进行监控，直到完全恢复。如果存在呼吸困难的迹象，对小鼠实施安乐死。
41. 通过皮下注射10μL（0.1mg / kg）丁丙诺啡稀释在90μL无菌磷酸盐缓冲溶液（PBS）中来提供术后镇痛。

结果

图1总结了本方案中描述的外科手术步骤并进行了说明。简而言之，在手术前，麻醉小鼠并去除左胸部的毛发。对小鼠进行插管和机械通气，以便在胸腔破裂后存活。切除覆盖肋骨的软组织，并产生一个小的圆形缺陷，横跨^{第6和第7肋}骨。将光学窗框插入缺陷中，其底部（透明孔外）粘附在肺组织上。然后用缝合线和粘合剂的组合固定窗框，重新密封胸腔，并...

讨论

在肺等远处转移部位，高分辨率光学成像可以深入了解肿瘤细胞转移的复杂动力学。通过实现单个癌细胞及其与宿主组织的相互作用的 体内 可视化，高分辨率的活体成像已被证明有助于理解转移的潜在机制。

这里描述的是一种改进的手术方案，用于永久胸腔植入光学窗口，旨在通过高分辨率多光子显微镜对小鼠肺进行连续成像。使用该协议创建的窗口具有良好的耐受...

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
1% (w/v) solution of enzyme-active detergent	Alconox Inc	N/A	concentrated, anionic detergent with protease enzyme for manual and ultrasonic cleaning
2 µm fluorescent microspheres	Invitrogen	F8827
5 mm coverslip	Electron Microscopy Sciences	72296-05
5% (w/v) solution of sodium hydroxide	Sigma-Aldrich	S8045
5% Isoflurane	Henry Schein, Inc	29405
5-0 braided silk with RB-1 cutting needle	Ethicon, Inc.	774B
7% (w/v) solution of citric acid	Sigma-Aldrich	251275
8 mm stainless steel window frame	N/A	N/A	Custom made, Supplementary Figure 2
9 cm 2-0 silk tie	Ethicon, Inc.	LA55G
5 mm disposable biopsy punch	Integra	33-35-SH
Blunt micro-dissecting scissors	Roboz	RS-5980
Brass window tool holder	N/A	N/A	Custom-made, Supplemental Figure 3
Buprenorphine	Hospira	0409-2012-32
Cautery pen	Braintree Scientific	GEM 5917
Chlorhexidine gluconate	Becton, Dickinson and Company	260100	ChloraPrep Single swabstick 1.75 mL
Compressed air canister	Falcon	DPSJB-12
Cyanoacrylate adhesive	Henkel Adhesives	LOC1363589
Fiber-optic illuminator	O.C. White Company	FL3000
Bead sterilizer	CellPoint Scientific	GER 5287-120V	Germinator 500
Graefe forceps	Roboz	RS-5135
Infrared heat lamp	Braintree Scientific	HL-1
Insulin syringes	Becton Dickinson	329424
Isoflurane vaporizer	SurgiVet	VCT302
Jacobson needle holder with lock	Kalson Surgical	T1-140
Long cotton tip applicators	Medline Industries	MDS202055
Nair	Church & Dwight Co., Inc.	40002957
Neomycin/polymyxin B/bacitracin	Johnson & Johnson	501373005	Antibiotic ointmen
Ophthalmic ointment	Dechra Veterinary Products	17033-211-38
Paper tape	Fisher Scientific	S68702
Murine ventilator	Kent Scientific	PS-02	PhysioSuite
Rectangular Cover Glass	Corning	2980-225
Rodent intubation stand	Braintree Scientific	RIS 100
Small animal lung inflation bulb	Harvard Apparatus	72-9083
Stainless steel cutting tool	N/A	N/A	Custom made, Supplementary Figure 1
Sulfamethoxazole and Trimethoprim oral antibiotic	Hi-Tech Pharmacal Co.	50383-823-16
SurgiSuite Multi-Functional Surgical Platform for Mice, with Warming	Kent Scientific	SURGI-M02	Heated surgical platform
Tracheal catheter	Exelint International	26746	22 G catheter
Vacuum pickup system metal probe	Ted Pella, Inc.	528-112