Ein permanentes Fenster zur Untersuchung von Krebsmetastasen in der Lunge

Zusammenfassung

Hier stellen wir ein Protokoll zur operativen Implantation eines dauerhaft verweilbaren optischen Fensters für den murinen Thorax vor, das eine hochauflösende, intravitale Bildgebung der Lunge ermöglicht. Die Permanenz des Fensters macht es gut geeignet für die Untersuchung dynamischer zellulärer Prozesse in der Lunge, insbesondere solcher, die sich langsam entwickeln, wie z.B. das metastatische Fortschreiten von disseminierten Tumorzellen.

Zusammenfassung

Metastasierung, die ~ 90% der krebsbedingten Mortalität ausmacht, beinhaltet die systemische Ausbreitung von Krebszellen von Primärtumoren zu sekundären Stellen wie Knochen, Gehirn und Lunge. Obwohl ausgiebig untersucht, sind die mechanistischen Details dieses Prozesses nach wie vor wenig verstanden. Während gängige Bildgebungsmodalitäten, einschließlich Computertomographie (CT), Positronenemissionstomographie (PET) und Magnetresonanztomographie (MRT), unterschiedliche Grade der groben Visualisierung bieten, fehlt jedem die zeitliche und räumliche Auflösung, die notwendig ist, um die Dynamik einzelner Tumorzellen zu erkennen. Um dies zu beheben, wurden zahlreiche Techniken für die intravitale Bildgebung von häufigen metastasierenden Stellen beschrieben. Von diesen Stellen hat sich die Lunge aufgrund ihrer Zartheit und ihrer entscheidenden Rolle bei der Erhaltung des Lebens als besonders schwierig für die intravitale Bildgebung erwiesen. Obwohl bereits mehrere Ansätze für die einzelzellige intravitale Bildgebung der intakten Lunge beschrieben wurden, beinhalten alle hochinvasive und terminale Verfahren, die die maximal mögliche Bildgebungsdauer auf 6-12 h begrenzen. Beschrieben wird hier eine verbesserte Technik zur dauerhaften Implantation eines minimalinvasiven thorakalen optischen Fensters zur hochauflösenden Bildgebung der Lunge (WHRIL). In Kombination mit einem angepassten Ansatz für die Mikrokartographie ermöglicht das innovative optische Fenster die serielle intravitale Bildgebung der intakten Lunge mit Einzelzellauflösung über mehrere Bildgebungssitzungen und mehrere Wochen hinweg. Angesichts der beispiellosen Zeitspanne, über die Bilddaten gesammelt werden können, kann das WHRIL die beschleunigte Entdeckung der dynamischen Mechanismen ermöglichen, die der metastatischen Progression und zahlreichen zusätzlichen biologischen Prozessen in der Lunge zugrunde liegen.

Einleitung

Metastasen, die für ~ 90% der Todesfälle verantwortlich sind, sind die Hauptursache für krebsbedingte Mortalität¹. Unter den Hauptorten klinisch beobachteter Metastasen (Knochen, Leber, Lunge, Gehirn)²hat sich die Lunge als besonders herausfordernd für die In-vivo-Bildgebung mittels intravitaler Mikroskopie erwiesen. Dies liegt daran, dass die Lunge ein empfindliches Organ in ständiger Bewegung ist. Die kontinuierliche Bewegung der Lunge, die durch intrathorakale Herzbewegungen noch verstärkt wird, stellt eine erhebliche Barriere für eine genaue Bildgebung dar. Aufgrund seiner relativen Unzugänglichkeit für Modalitäten für eine hochauflösende intravitale optische Bildgebung wurde das Krebswachstum in der Lunge daher oft als okkulter Prozess angesehen³.

Im klinischen Umfeld ermöglichen bildgebende Verfahren wie Computertomographie (CT), Positronenemissionstomographie (PET) und Magnetresonanztomographie (MRT) die Visualisierung tief in intakten lebenswichtigen Organen wie der Lunge⁴. Während diese Modalitäten jedoch hervorragende Ansichten des Bruttoorgans bieten (oft sogar die Pathologie vor dem Auftreten klinischer Symptome aufdecken), sind sie von unzureichender Auflösung, um einzelne disseminierte Tumorzellen zu erkennen, wenn sie durch die frühen Stadien der Metastasierung vordringen. Folglich sind metastasierende Herde bereits gut etabliert und vermehren sich, wenn die oben genannten Modalitäten einen Hinweis auf metastasierende Metastasen in der Lunge liefern. Da die Tumormikroumgebung eine zentrale Rolle bei der Krebsprogression und Metastasenbildung spielt^5,6, besteht ein großes Interesse daran, die frühesten Schritte der metastatischen Aussaat in vivozu untersuchen. Dieses Interesse wird weiter angeheizt durch die erhöhte Wertschätzung, dass Krebszellen sich verbreiten, noch bevor der Primärtumor entdeckt wird^7,8 und die zunehmenden Beweise, dass sie als Einzelzellen und in einem ruhenden Zustand für Jahre bis Jahrzehnte überleben, bevor sie in Makrometastasen auswachsen⁹.

Bisher umfasste die Bildgebung der Lunge mit Einzelzellauflösung notwendigerweise Ex-vivo- oder Explantatpräparate^10,11,12,13, die analysen auf einzelne Zeitpunkte beschränkten. Während diese Präparate nützliche Informationen liefern, geben sie keinen Einblick in die Dynamik von Tumorzellen innerhalb des Organs, das mit einem intakten Kreislaufsystem verbunden ist.

Jüngste technologische Fortschritte in der Bildgebung haben die intravitale Visualisierung der intakten Lunge mit Einzelzellauflösung über Zeiträume von bis zu 12 h^{ermöglicht 14,15,16}. Dies wurde in einem murinen Modell unter Verwendung eines Protokolls erreicht, das mechanische Beatmung, Resektion des Brustkorbs und vakuumunterstützte Lungenimmobilisierung beinhaltete. Obwohl die Technik die ersten Einzelzellauflösungsbilder der physiologisch intakten Lunge bietet, ist sie hochinvasiv und terminal, wodurch weitere Bildgebungssitzungen über das Indexverfahren hinaus ausgeschlossen sind. Diese Einschränkung verhindert daher seine Anwendung auf die Untersuchung von metastatischen Schritten, die länger als 12 h dauern, wie Ruhephase und Wiedereinleitung des Wachstums^14,15,16. Darüber hinaus müssen Muster des zellulären Verhaltens, die mit diesem bildgebenden Ansatz beobachtet wurden, vorsichtig interpretiert werden, da vakuuminduzierte Druckdifferenzen wahrscheinlich Umleitungen im Blutfluss verursachen.

Um diese Einschränkungen zu überwinden, wurde kürzlich ein minimal-invasives Fenster für die hochauflösende Bildgebung der Lunge (WHRIL) entwickelt, das die serielle Bildgebung über einen längeren Zeitraum von Tagen bis Wochen ermöglicht, ohne dass eine mechanische Beatmung erforderlich ist¹⁷. Die Technik beinhaltet die Schaffung eines "transparenten Brustkorbs" mit einer versiegelten Brusthöhle zur Erhaltung der normalen Lungenfunktion. Das Verfahren ist gut verträglich, so dass sich die Maus erholen kann, ohne die Ausgangsaktivität und -funktion sinnvoll zu verändern. Um bei der jeweiligen Bildgebungssitzung genau die gleiche Lungenregion zuverlässig zu lokalisieren, wurde auf dieses Fenster eine als Mikrokartographie bekannte Technik angewendet¹⁸. Durch dieses Fenster war es möglich, Bilder von Zellen aufzunehmen, wenn sie am Gefäßbett der Lunge ankommen, das Endothel überqueren, Zellteilung durchlaufen und zu Mikrometastasen heranwachsen.

Hier präsentiert die Studie eine detaillierte Beschreibung eines verbesserten Operationsprotokolls zur Implantation des WHRIL, das die Operation vereinfacht und gleichzeitig deren Reproduzierbarkeit und Qualität erhöht. Während dieses Protokoll entwickelt wurde, um die Untersuchung der dynamischen Prozesse zu ermöglichen, die der Metastasierung zugrunde liegen, kann die Technik alternativ auf Untersuchungen zahlreicher Prozesse der Lungenbiologie und -pathologie angewendet werden.

Protokoll

Alle in diesem Protokoll beschriebenen Verfahren wurden in Übereinstimmung mit den Richtlinien und Vorschriften für die Verwendung von Wirbeltieren durchgeführt, einschließlich der vorherigen Genehmigung durch das Albert Einstein College of Medicine Institutional Animal Care and Use Committee.

1. Passivierung von Fenstern

1. Spülen Sie die optischen Fensterrahmen (Ergänzende Abbildung 2) mit einer 1% igen (w/v) Lösung enzymatisch aktiver Reinigungsmittel ab.
2. In einem Glasgefäß tauchen Sie die optischen Fensterrahmen 30 min bei 70 °C in 5% (w/v) Natronlauge ein.
3. Entfernen und waschen Sie die Fensterrahmen mit entionisiertem Wasser.
4. Tauchen Sie die optischen Fensterrahmen 10 min bei 55 °C in ein neues Glasgefäß in 7% (w/v) Zitronensäurelösung.
5. Entfernen und waschen Sie die Fensterrahmen erneut mit entionisiertem Wasser.
6. Wiederholen Sie Schritt 1.2. Entfernen und waschen Sie dann die Fensterrahmen mit entionisiertem Wasser.

2. Vorbereitung auf die Operation

1. Führen Sie die Operation in einer Haube oder einem Laminar-Flow-Schrank durch. Um eine Kontamination des Operationsfeldes zu vermeiden, stellen Sie unterschiedliche, getrennte Bereiche für die Vorbereitung, Operation und Genesung sicher.
2. Sterilisieren Sie vor der Operation alle chirurgischen Instrumente in einem Autoklaven. Wenn nachfolgende Verfahren geplant sind, sterilisieren Sie die Instrumente mit einem Heißperlensterilisator erneut. Für diesen chirurgischen Eingriff wird eine reine Trinkgeldtechnik verwendet.
3. Schalten Sie die beheizte chirurgische Perle und den Perlensterilisator ein.
4. Betäuben Sie die Maus mit 5% Isofluran in der Anästhesiekammer.
5. Um Haare zu entfernen, tragen Sie großzügig enthaarende Creme auf die obere linke Brustschnittstelle auf. Nach nicht länger als 20 s die Haare und die Enthaarungscreme mit angefeuchtetem Seidenpapier fest abwischen. Wiederholen Sie dies nach Bedarf, um alle Haare von der Operationsstelle zu entfernen.
6. Binden Sie mit einer 2-0-Seidennaht einen Knoten an der Basis eines 22-G-Katheters und lassen Sie 2 Zoll lange Schwänze zurück (siehe Abbildung 1A).

3. Lungenfenster-Chirurgie

1. Waschen Sie die Hände mit antiseptischer Seife.
2. Ziehen Sie vor jeder neuen Operation neue sterile Handschuhe an.
3. Um eine Hornhauttrocknung und eine Schädigung der Augen der Maus zu verhindern, tragen Sie eine Augensalbe auf beide Augen auf.
4. Verdünnen Sie 10 μL (0,1 mg/kg) Buprenorphin in 90 μL sterilem PBS und injizieren Sie dann subkutan, um eine präoperative Analgesie sicherzustellen.
5. Intubieren Sie die Maus mit dem seidennahten 22 G Katheter¹⁵. Bestätigen Sie mit einer Inflationsbirne die erfolgreiche Intubation, indem Sie den bilateralen Brustanstieg beim Zwiebeldrücken feststellen.
6. Sichern Sie den Intubationskatheter, indem Sie die 2-0 Seidennaht um die Schnauze der Maus binden (siehe Abbildung 1B).
7. Legen Sie die Maus auf den beheizten chirurgischen Ständer und positionieren Sie sie im rechten seitlichen Dekubitus, um den linken Brustkorb freizulegen.
8. Schließen Sie das Beatmungsgerät an den Intubationskatheter an.
9. Sorgen Sie für eine kontrollierte, stabile Beatmung des Beatmungsgeräts und senken Sie dann das Isofluoran auf 3%. Beurteilen Sie zu Beginn des Eingriffs und regelmäßig während der gesamten Dauer des Eingriffs die Angemessenheit der Anästhesie, indem Sie einen Zehenquetschtest durchführen.
10. Mit Papierband befestigen Sie kranial und kaudal die vorderen bzw. hinteren Gliedmaßen an der beheizten Operationsbühne. Legen Sie ein weiteres Stück Klebeband entlang der Länge des Rückens der Maus an, um die Exposition gegenüber dem Operationsfeld zu maximieren (siehe Abbildung 1C).
11. Öffnen Sie alle chirurgischen Instrumente unter der Haube, um die Sterilität zu erhalten.
12. Sterilisieren Sie die Operationsstelle durch eine großzügige Anwendung von Antiseptikum auf die Haut der Maus.
13. Heben Sie mit einer Pinzette die Haut an und machen Sie einen ~ 10 mm kreisförmigen Schnitt, ~ 7 mm links vom Brustbein und ~ 7 mm über dem Unterkostalrand (Abbildung 1D).
14. Identifizieren Sie sorgfältig alle wichtigen Schiffe. Wenn die Teilung der Gefäße notwendig ist, kauterisieren Sie an beiden Enden mit dem Elektrokauterstift, um die Hämostase aufrechtzuerhalten.
15. Schneiden Sie das Weichgewebe über den Rippen aus.
16. Heben Sie die^6. oder^7. Rippe mit einer Pinzette an. Mit einer einzigen Klinge der stumpfen Mikrodesektionsschere, der abgerundeten Seite zur Lunge hin, durchbohren Sie vorsichtig den Interkostalmuskel zwischen der^6. und^7. Rippe, um in den intrathorakalen Raum einzudringen (Abbildung 1E).
17. Drücken Sie den Druckluftkanister am Defekt vorsichtig ab, um die Lunge zu kollabieren und von der Brustwand zu trennen. Feuern Sie die Druckluft in kurzen Ausbrüchen ab, um iatrogene Lungenverletzungen zu verhindern.
18. Legen Sie den Biopsiestempel über das Schneidwerkzeug (Ergänzende Abbildung 1) und manövrieren Sie vorsichtig die Basis des Schneidwerkzeugs durch den Interkostalschnitt (Abbildung 1F).
19. Richten Sie die Basis des Schneidwerkzeugs so aus, dass sie parallel zur Brustwand verläuft. Stanzen Sie ein 5 mm großes kreisförmiges Loch durch den Brustkorb (Abbildung 1G).
    HINWEIS: Stellen Sie sicher, dass das exponierte Lungengewebe rosa ist, ohne Anzeichen von Schäden.
20. Erstellen Sie mit der 5-0-Seidennaht einen Handtaschenstich ~ 1 mm vom Loch entfernt, umlaufend, verflochten mit den Rippen (Abbildung 1H).
21. Positionieren Sie den Fensterrahmen so, dass die Kanten des kreisförmigen Defekts innerhalb der Nut des Fensters ausgerichtet sind (siehe Abbildung 1I).
22. Verriegeln Sie das implantierte Fenster sicher, indem Sie die 5-0 Seidennaht fest zusammenbinden.
23. Laden Sie 100 μL Cyanacrylat-Gelkleber in die 1 mL Spritze.
24. Trocknen Sie die Lunge, indem Sie einen stetigen, sanften Druckluftstrom für ~ 10-20 s anwenden (Abbildung 1J).
25. Heben Sie den Fensterrahmen mit einer Pinzette vorsichtig an der Außenkante an, um die Trennung der Lunge von der Unterseite des Fensterrahmens sicherzustellen.
26. Verteilen Sie eine dünne Schicht Cyanacrylatkleber entlang der Unterseite des optischen Fensterrahmens (Abbildung 1K).
27. Erhöhen Sie den positiven endexspiratorischen Druck (PEEP) auf das Beatmungsgerät, um die Lunge aufzublasen.
28. Halten Sie 10-20 s und üben Sie sanften, aber festen Druck aus, um den optischen Fensterrahmen am Lungengewebe zu befestigen (Abbildung 1L).
29. Geben Sie einen 5 mm Tropfen des restlichen Cyanacrylat-Gelklebers auf einen rechteckigen Deckglas.
30. Nehmen Sie den 5-mm-Deckglas mit Vakuum-Tonabnehmern auf. Tauchen Sie die Unterseite des Deckglases in den Klebstoff und kratzen Sie dann überschüssigen Klebstoff dreimal gegen die Seite des rechteckigen Deckglases ab, so dass nur eine sehr dünne Schicht übrig bleibt (Abbildung 1M).
31. Positionieren Sie den Deckstab vorsichtig so, dass er in die Aussparung in der Mitte des optischen Fensterrahmens passt und schräg über dem Lungengewebe gehalten wird. Klemmen Sie das Beatmungsgerät kurz ein, um Einen positiven Druck zu erzeugen, wodurch die Lunge hyperinflationiert wird. Richten Sie den Deckstreifen mit einer rotierenden Bewegung parallel zum Lungengewebe aus, um eine direkte Apposition zwischen der Lungenoberfläche und der Unterseite des Deckglases zu erzeugen. Halten Sie einen sanften Druck aufrecht, so dass der Cyanacrylatkleber abbinden kann (~ 25 s).
32. Verwenden Sie die Pinzette, um den Deckglas von den Vakuumabnehmern zu trennen (Abbildung 1N).
33. Erzeugen Sie mit 5-0 Seidennaht erneut einen Handtaschenstich, diesmal <1 mm umschneidend von der Schnittkante des Hautschnitts. Stecken Sie überschüssige Haut unter den äußeren Rand des Fensterrahmens, bevor Sie sie mit verriegelnden Knoten fest binden.
34. Um eine luftdichte Abdichtung zwischen Deckglas und Fensterrahmen zu gewährleisten, dosieren Sie eine kleine Menge flüssiges Cyanacrylat an der Metall-Glas-Grenzfläche (siehe Abbildung 1O).
35. Befestigen Sie eine sterile Nadel an einer 1 ml Insulinspritze. Führen Sie die Nadel unterhalb des Xiphoid-Prozesses ein, bewegen Sie sich in Richtung der linken Schulter und treten Sie durch das Zwerchfell in die Brusthöhle ein. Ziehen Sie die Spritze vorsichtig zurück, um Restluft aus der Brusthöhle zu entfernen (siehe Abbildung 1P).
36. Entfernen Sie das Band von der Maus.
37. Schalten Sie Isofluran aus.
38. Setzen Sie die Beatmung mit 100% Sauerstoff fort, bis die Maus zum Erwachen bereit zu sein scheint.
39. Schneiden Sie die 2-0 Seidennaht vorsichtig um die Schnauze der Maus und extubieren Sie die Maus.
40. Bringen Sie die Maus in einen sauberen Käfig und überwachen Sie sie, bis sie vollständig wiederhergestellt ist. Euthanasieren Sie die Maus, wenn Anzeichen von Atembeschwerden vorhanden sind.
41. Postoperative Analgesie durch subkutane Injektion von 10 μL (0,1 mg/kg) Buprenorphin, verdünnt in 90 μL steriler phosphatgepufferter Lösung (PBS).

Ergebnisse

Die in diesem Protokoll beschriebenen Schritte des chirurgischen Verfahrens sind in Abbildung 1zusammengefasst und veranschaulicht. Kurz gesagt, vor der Operation werden Mäuse betäubt und die Haare über dem linken Brustkorb entfernt. Mäuse werden intubiert und mechanisch beatmet, um das Überleben bei Durchbrechen der Brusthöhle zu ermöglichen. Weichgewebe, das über den Rippen liegt, wird ausgeschnitten und ein kleiner kreisförmiger Defekt entsteht, der die^6. und^7.

Diskussion

An Stellen der Fernmetastasierung wie der Lunge gibt die hochauflösende optische Bildgebung Einblick in die aufwendige Dynamik der Tumorzellmetastasierung. Durch die In-vivo-Visualisierung einzelner Krebszellen und ihrer Wechselwirkungen mit dem Wirtsgewebe hat sich die hochauflösende intravitale Bildgebung als entscheidend für das Verständnis der Mechanismen erwiesen, die der Metastasierung zugrunde liegen.

Beschrieben wird hier ein verbessertes Operationsprotokoll für die dauer...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
1% (w/v) solution of enzyme-active detergent	Alconox Inc	N/A	concentrated, anionic detergent with protease enzyme for manual and ultrasonic cleaning
2 µm fluorescent microspheres	Invitrogen	F8827
5 mm coverslip	Electron Microscopy Sciences	72296-05
5% (w/v) solution of sodium hydroxide	Sigma-Aldrich	S8045
5% Isoflurane	Henry Schein, Inc	29405
5-0 braided silk with RB-1 cutting needle	Ethicon, Inc.	774B
7% (w/v) solution of citric acid	Sigma-Aldrich	251275
8 mm stainless steel window frame	N/A	N/A	Custom made, Supplementary Figure 2
9 cm 2-0 silk tie	Ethicon, Inc.	LA55G
5 mm disposable biopsy punch	Integra	33-35-SH
Blunt micro-dissecting scissors	Roboz	RS-5980
Brass window tool holder	N/A	N/A	Custom-made, Supplemental Figure 3
Buprenorphine	Hospira	0409-2012-32
Cautery pen	Braintree Scientific	GEM 5917
Chlorhexidine gluconate	Becton, Dickinson and Company	260100	ChloraPrep Single swabstick 1.75 mL
Compressed air canister	Falcon	DPSJB-12
Cyanoacrylate adhesive	Henkel Adhesives	LOC1363589
Fiber-optic illuminator	O.C. White Company	FL3000
Bead sterilizer	CellPoint Scientific	GER 5287-120V	Germinator 500
Graefe forceps	Roboz	RS-5135
Infrared heat lamp	Braintree Scientific	HL-1
Insulin syringes	Becton Dickinson	329424
Isoflurane vaporizer	SurgiVet	VCT302
Jacobson needle holder with lock	Kalson Surgical	T1-140
Long cotton tip applicators	Medline Industries	MDS202055
Nair	Church & Dwight Co., Inc.	40002957
Neomycin/polymyxin B/bacitracin	Johnson & Johnson	501373005	Antibiotic ointmen
Ophthalmic ointment	Dechra Veterinary Products	17033-211-38
Paper tape	Fisher Scientific	S68702
Murine ventilator	Kent Scientific	PS-02	PhysioSuite
Rectangular Cover Glass	Corning	2980-225
Rodent intubation stand	Braintree Scientific	RIS 100
Small animal lung inflation bulb	Harvard Apparatus	72-9083
Stainless steel cutting tool	N/A	N/A	Custom made, Supplementary Figure 1
Sulfamethoxazole and Trimethoprim oral antibiotic	Hi-Tech Pharmacal Co.	50383-823-16
SurgiSuite Multi-Functional Surgical Platform for Mice, with Warming	Kent Scientific	SURGI-M02	Heated surgical platform
Tracheal catheter	Exelint International	26746	22 G catheter
Vacuum pickup system metal probe	Ted Pella, Inc.	528-112