标记细胞外囊泡以监测软骨外植体的迁移和摄取

摘要

在这里，我们提出了一种标记血小板裂解物衍生的细胞外囊泡的方案，以监测它们在软骨外植体中的迁移和摄取，这些外植体用作骨关节炎的模型。

摘要

细胞外囊泡（EV）用于不同的研究，以证明其作为无细胞治疗的潜力，因为它们的货物来自其细胞来源，如血小板裂解物（PL）。当用作治疗时，EV有望进入靶细胞并从中产生反应。在这项研究中，PL衍生的EV已被研究为骨关节炎（OA）的无细胞治疗。因此，建立了一种方法来标记EV并测试它们在软骨外植体上的摄取。PL衍生的EV用亲脂性染料PKH26标记，通过柱洗涤两次，然后在通过纳米颗粒跟踪分析（NTA）进行颗粒定量后 在体外 炎症驱动的OA模型中测试5小时。每小时，将软骨外植体固定，石蜡化，切成6μm切片以安装在载玻片上，并在共聚焦显微镜下观察。这允许验证EV在此期间是否进入靶细胞（软骨细胞）并分析其直接影响。

引言

骨关节炎（OA）是一种关节退行性疾病，意味着进行性和不可逆的炎症和关节软骨细胞外基质的破坏¹。虽然各种形式的关节炎有许多治疗方法^2，3，4，但这些都受到其副作用和有限疗效的限制。使用自体软骨细胞植入的组织工程技术常规应用于早期OA软骨病变中受伤软骨的再生治疗^4。基于细胞的疗法受到限制，主要是由于能够有效修复软骨的表型稳定的软骨细胞或软骨祖细胞的数量有限³。因此，开发新的治疗策略来预防疾病进展和再生大软骨病变至关重要。

细胞外囊泡（EV）已被不同的作者建议作为OA的治疗方法^5，6。EV是由大多数细胞类型分泌的膜性体，参与细胞间信号传导，并且已被证明可以发挥干细胞的治疗作用^7，8，9，因此它们最近引起了对再生医学的兴趣^10。来自间充质基质细胞（MSCs）的EV是研究OA的主要治疗EV，尽管其他关节相关细胞已被用作EV来源，例如软骨祖细胞或免疫细胞^11，12。

血小板浓缩物，如血小板裂解物（PLs），用于增强不同损伤的伤口愈合，如角膜溃疡13，14，15或肌腱组织再生^16，因为假设血小板浓缩物的EV组分可能负责这些影响¹⁷.一些与关节相关疾病相关的研究使用血小板衍生的EV（PL-EV）作为改善骨关节炎疾病的治疗方法。PL-EV通过激活Wnt/β-catenin途径¹⁸来改善软骨细胞增殖和细胞迁移，促进骨关节炎软骨细胞¹⁹中软骨标志物的表达，或者在用PL-EVs¹⁸治疗的骨关节炎兔中显示出更高水平的软骨蛋白和更少的囊状异常。

EV含有释放到靶细胞的蛋白质，脂质和核酸，建立细胞间通讯，这是与其治疗应用相关的主要特征^20。电动汽车的影响取决于它们到达细胞和随后的货物释放。这种效应可以通过细胞中引起的变化间接证实，例如代谢活动或基因表达修饰。然而，这些方法不允许可视化EV如何到达细胞以发挥其功能。因此，本文提出了一种标记这些PL衍生的EV的方法，以用作炎症驱动的OA软骨外植体的治疗方法。共聚焦显微镜用于监测EV的摄取和进展到外展体中存在的软骨细胞，延时为5小时。

研究方案

注:软骨外植体是在CEI-IB（IB 3656118 PI）对项目进行伦理批准后，根据机构指南从IdISBa生物库（IB 1995/12 BIO）获得的。

1. 色谱柱制备

1. 按照制造商的说明或如下方式平衡色谱柱:
   1. 取下柱帽并平衡柱。通过洗脱取除去储存缓冲液。
   2. 用2.5mL磷酸盐缓冲盐水（PBS）洗涤色谱柱3次。在每次洗涤过程中，等待色谱柱吸收整个体积。
      注意:不要让色谱柱干燥。
   3. 在最后一次洗涤后用盖子盖住色谱柱，直到样品制备。

2. 电动汽车标签

注意:该EV标记方案使用先前通过尺寸排阻色谱（SEC）分离的PL-EV样品，其先前描述的条件^{为21，22。}然而，来自任何来源的任何EV样品都可以与该协议一起使用。

1. 使用浓缩管浓缩EV样品和对照（PBS）。
   1. 将样品置于15 mL或500μL浓缩管中，具体取决于EV样品起始量。根据制造商的说明离心管，直到获得几乎干燥的样品。
      注:对照样品是检查任何染料背景所必需的。虽然这种方法不需要任何特定的初始体积，但应该考虑到在纯化步骤中会损失大约10%的颗粒。
2. 用稀释剂C重悬浓缩样品，用200μL重悬EV样品，用100μL重悬对照组，并将其转移到新的1.5mL离心管中。
3. 将EV样品分成两个100μL的等分试样，用染料标记一个并用作处理（PKH-PL-EV）;将另一个保留为未标记，但像EV样品一样对其进行处理（NTA-PL-EV），并用它来量化NTA的EV浓度。
4. 制备2x染料溶液，在稀释剂C中产生8μM PKH26溶液。
5. 在样品中每125μL稀释剂C混合1μL1mM PKH26接头。准备以1:1的比例添加到样品中所需的体积。
6. 向PKH-PL-EV中加入2x染料溶液，并以1:1的比例对照样品，以达到1x染料浓度和4μM PKH26浓度。将相同体积的PBS添加到NTA-PL-EV样品中。在室温下孵育5分钟。
7. 以1:1的比例向样品中加入5%牛血清白蛋白-PBS溶液，并确保最终体积约为400μL。
   注意:此步骤允许去除非特异性染料相互作用或未结合的染料。
8. 继续将标记的EV与未结合的染料以及染料与色谱柱的非特异性相互作用分开。

3. 贴标EV隔离

1. 从色谱柱中取出盖子，加入400μL样品（PKH-PL-EV，NTA-PL-EV或对照），并丢弃所有洗脱的液体。
2. 等待样本完全进入列，然后再继续下一步。加入600μLPBS并丢弃所有洗脱的液体。
3. 等待 PBS 完全进入列，然后再继续执行下一步。加入600μLPBS，并在1.5中收集600μL的一小部分。mL 离心管（EV 或对照组）。
   注意:需要这些步骤来去除样品中多余的染料。需要通过色谱柱进行另一次分离以获得更纯净的EV。因此，以下步骤应在新的平衡柱（步骤4.1）或初始洗涤步骤（步骤4.2）之后的同一色谱柱中执行。
4. 为新的EV分离步骤准备色谱柱，以获得更纯净的EV。如果是新列，请重复步骤 2.1。和 2.2.如果是同一色谱柱，请用2.5 mL的20%异丙醇洗涤色谱柱，然后重复步骤2.1和2.2。
5. 将步骤2.5中获得的600μL先前洗脱的EV加入色谱柱中，并弃去洗脱的体积。等待液体完全进入色谱柱，然后再继续下一步。
6. 加入400μLPBS并丢弃所有洗脱体积。等待液体完全进入色谱柱，然后再继续下一步。
7. 加入600μLPBS，并在1.5mL离心管中收集600μL的馏分。使用EV和对照样品进行进一步分析，或将其储存在4 oC下过夜。
8. 存储使用的列以供将来使用。
   1. 用25mL的20%异丙醇洗涤色谱柱并丢弃洗脱的体积。用2.5 mL PBS洗涤色谱柱3次。
   2. 添加在步骤 1.1.1 中删除的存储缓冲区，并等待缓冲区进入列。用盖子盖住色谱柱，储存在4 oC，直到后续使用。

4. 电动汽车量化

1. 按照以下两个步骤所述，准备1:1，000稀释的NTA-PL-EV样品和初始PL-EV样品。
   1. 准备1 mL 1:10稀释的NTA-PL-EV和1 mL的1:10稀释的初始PL-EV，PBS通过0.2μm过滤器过滤。
   2. 用PBS制备1 mL先前稀释的先前稀释样品的1:100稀释液，通过0.2μm过滤器过滤。
2. 使用无菌注射器将1:1，000稀释的NTA-PL-EV样品或初始PL-EV样品注入NTA泵中。按照制造商的说明和建议进行颗粒浓度和尺寸分布测定。
   注意:由于EV浓度取决于样品起始体积，因此可能需要读取中间稀释液并进行调整以获得正确的NTA测定。

5. 用于治疗炎症驱动型OA的EV

1. 用PBS清洗软骨两次，并在无菌条件下使用直径为3mm的活检孔将其切除。
   注意:在细胞培养罩中执行步骤5.1至5.6中的步骤。
2. 将外植体置于96孔培养板中，其中DMEM-F12培养基在37 oC，5%CO₂和80%湿度下补充1%青霉素 - 链霉素。
   1. 为了建立炎症驱动的OA模型，用10 ng / mL oncostatin M和2 ng / mL肿瘤坏死因子-α（TNFα）补充细胞培养基。
3. 用1×10⁹ 个标记EV（PKH-PL-EV）颗粒/孔处理外植体，或在补充了癌抑素M和TNFα的细胞培养基中对照。
   注意:测量含有1×10⁹ 个颗粒/孔的样品的体积，并使用相同的体积进行对照。
4. 从含有软骨外植体的96孔细胞培养板中取出培养基。向每个孔中加入步骤5.3中描述的200μL细胞培养基。
   注意:如果96孔板与胎牛血清（FBS）接触，则用200μLPBS洗涤每个孔三次，以从FBS中除去任何EV。
5. 在不同时间停止 体外 测定:0，1，2，3，4和5小时。
6. 用200μLPBS洗涤含有软骨外植体的细胞培养孔两次。
7. 向组织中加入100μL4%多聚甲醛（PFA），在4 oC下固定3小时。
   注:涉及PFA的步骤应按照安全数据表的建议在通风橱中执行。
8. 除去PFA，加入100μLPBS，将固定组织储存在4°C，并在48小时内处理样品。

6. 显微镜制备和可视化

注意:该组织学程序包括脱水，石蜡包埋和补液步骤。这些步骤可能会降低整体染料荧光（PKH26数据表中提到的限制）。因此，其他程序，如冷冻切片，可能更适合通过共聚焦显微镜进行EV可视化。

1. 将固定组织嵌入石蜡块中。将组织切成6μm厚的部分。
2. 使组织切片脱蜡。
   注:使用二甲苯的所有步骤均应在通风橱中进行。
   1. 将组织切片浸入二甲苯中30分钟，100%乙醇浸入2分钟，96%乙醇浸入2分钟，75%乙醇浸入1分钟，最后在蒸馏水中浸泡30秒。
3. 渗透组织切片。
   1. 准备0.1%Triton-0.1%柠檬酸钠溶液以透化组织。向每个组织切片中加入20μL滴剂，并在室温下孵育10分钟。用20μLPBS洗涤每节两次。
4. 在显微镜载玻片上，加入一滴含有4′，6-二氨基-2-苯基吲哚（DAPI）的安装介质和水性安装介质，以保持荧光。盖住包含步骤6.3.1中的3个组织切片的载玻片。
5. 将载玻片在室温下孵育过夜，避光。
6. 储存在4°C，避光，直到共聚焦显微镜。

结果

EV标签和车载监测的原理图如图 1所示。 表1 中NTA检测到的颗粒浓度和EV大小表明，由于在用色谱柱标记后执行两次纯化步骤，EV浓度在加工过程中降低。然而，获得的量在用于处理的颗粒数量的最佳范围内。该颗粒浓度用于计算用于治疗骨关节炎软骨外植体的PKH-PL-EV和对照的体积。

一旦软骨外植体用EV或对照组处理，它们就会固定在不同的?...

讨论

EV成像有助于了解EV特性，例如它们的释放和摄取机制。它们的成像允许监测它们的生物分布，并表征它们作为药物载体的药代动力学特性。然而，EV成像和跟踪可能由于其小尺寸而变得困难，尽管已经开发了许多成像设备和标记技术来帮助研究人员在体外和体内条件下监测EV23，24，25。

通过?...

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Material
1.5 mL Centrifuge tube	SPL life sciences	PLC60015
1 mL Syringe BD Plastipak	BD	303174
2-Propanol (Isopropanol)	Panreac AppliChem	1.310.901.211	Prepared at 20% with Milli-Q water
96-well culture plate	SPL life sciences	PLC30096
Absolute ethanol Pharmpur	Scharlab	ET0006005P	Used to prepare 96% and 75% ethanol with Milli-Q water
Biopsy Punch with plunger 3 mm	Scandidact	MTP-33-32
Bovine serum Albumin (BSA)	Sigma-Aldrich	A7030	Prepared at 5% with PBS
Cartilage explants	IdISBa Biobank
Concentrating tube 15 mL Nanosep 100 kD Omega	Pall	MCP100C41
Concentrating tube 500 µL Nanosep 100 kD Omega	Pall	OD003C33
Cover glass 24 x 60 mm	Deltalab	D102460
DMEM-F12 -GlutaMAX medium	Biowest	L0092
Dulbecco's PBS (1x)	Capricorn Scientific	PBS-1A
Embedded paraffin tissue blocks	IdISBa Biobank		Fee for service
Exo-spin mini-HD columns	Cell guidance systems	EX05
Feather S35 Microtome Blade	Feather	43037
Filtropur S 0.2 µm syringe filter	Sarstedt	83.1826.001
Fluoroshield with DAPI	Sigma-Aldrich	F-6057
Oncostatin M Human	Sigma-Aldrich	O9635-10UG	Prepare a stock solution to a final concentration of 0.1 µg/µL diluten in PBS-0.1% BSA
Paraformaldehyde	Sigma-Aldrich	8.18715.1000	Prepared at 4% with PBS and stored at 4 °C
Penicillin-Streptomycin Solution 100x	Biowest	L0022
PKH26 Red Fluorescent Cell Linker Kit for General Cell Membrane Labeling	Sigma-Aldrich	MINI26	PKH26 and Dliuent C included
Sodium citrate dihydrate	Scharlab	SO019911000
Superfrost Plus Microscope Slides	Thermo Scientific	J1800AMNZ
TNFα	R&D systems	210-TA-005	Prepare a stock solution to a final concentration of 0.01 µg/µL diluted in PBS-0.1% BSA
Triton X-100	Sigma-Aldrich	T8787	Used to prepare a 0.1% Triton-0.1% sodium citrate solution with Milli-Q water
Xylene	Scharlab	XI0050005P
Equipment
Centrifuge 5430 R	Eppendorf	5428000210	F-45-48-11 rotor
NanoSight NS300	Malvern	NS300	Device with embedded laser at λ= 532 nm and camera sCMOS
Shandon Finesse 325 Manual Microtome	Thermo Scientific™	A78100101
TCS-SPE confocal microscope	Leica Microsystems	5200000271