연골 내의 마이그레이션 및 섭취 모니터링을 위한 세포외 소포 라벨링

요약

여기에서, 우리는 골관절염을 위한 모형으로 이용된 연골 이병 에서 그들의 이동 그리고 upup를 감시하기 위하여 혈소판 lysate 유래 세포외 소포를 레이블을 붙이는 프로토콜을 제시합니다.

초록

세포 외 소포 (EV)는 혈소판 용해 (PL)와 같은 세포 공급원에서 파생 된 화물로 인해 세포없는 치료로서의 잠재력을 증명하기 위해 다른 연구에서 사용됩니다. 치료로 사용되는 경우, EV는 표적 세포를 입력하고 이들로부터의 반응에 영향을 미칠 것으로 예상된다. 이 연구에서, PL 유래 전기 는 골관절염에 대 한 세포 없는 치료로 공부 되었습니다 (OA). 따라서, 방법은 EV를 라벨과 연골 각질에 대한 그들의 섭취량을 테스트하도록 설정되었다. PL 유래 전기는 리포마이트 염료 PKH26로 표지되고, 컬럼을 통해 두 번 세척한 다음, 나노입자 추적 분석(NTA)에 의한 입자 정량화 후 5h에 대한 체외 염증 중심OA 모델에서 테스트한다. 시간당 연골 이출은 고정되고, 파라플료로 절단되어 6 μm 섹션으로 절단되어 슬라이드에 장착하고, 공초점 현미경으로 관찰됩니다. 이를 통해 이 기간 동안 EV가 대상 셀(연골세포)에 진입하는지 여부를 검증하고 직접적인 효과를 분석할 수 있습니다.

서문

골관절염(OA)은 관절 연골^1의세포외 매트릭스의 점진적이고 돌이킬 수 없는 염증 및 파괴를 의미하는 관절 퇴행성 질환이다. 관절염의 다양한 형태는 수많은 치료를 가지고 있지만^2,3,4,이들은 자신의 부작용과 제한된 효능에 의해 제한됩니다. 자가 연골성 이식을 이용한 조직 공학 기술은 조기 OA 연골 병변^4에서부상당한 연골의 재생 치료를 위해 일상적으로 적용된다. 세포 기반 치료법은 주로 연골^3을효과적으로 수리할 수 있는 페노전형안정연골세포 또는 연골로겐이터의 수가 제한되어 있기 때문에 제한된다. 따라서 질병 진행을 방지하고 큰 연골 병변을 재생하는 새로운 치료 전략의 개발이 가장 중요합니다.

세포 외 소포 (EV)는 다른^저자에의해 OA에 대한 치료로 제안되었습니다^5,6. 전기자동차는 대부분의 세포 유형에 의해 분비되는 암골체이며, 세포간 신호에 관여하며, 줄기세포의 치료 효과를 발휘하는 것으로 나타났으며,^8,9,최근^{재생의학에}대한 관심을 유도하고 있다. 중간엽 기질 세포(MSC)에서 유래된 전기는 OA를 위해 조사되는 주요 치료 용 전기자동차이지만, 다른 관절 관련 세포는 EV 소스, 예를 들어, 촌드롭로겐이터 또는 면역^{세포(11,12)로}사용되어 왔다.

혈소판 용액(PLs)과 같은 혈소판 농축물들은 각막궤양(13,^14,15) 또는 힘줄 조직 재생^16과같은 상이한 부상에서 상처 치유를 향상시키는 데 사용되며, 혈소판 농축물의 EV 성분이 이러한 효과에 대한 책임이 있을 수 있다는 가설 로 인해¹⁷ . 관절 관련 질환과 관련된 일부 연구는 혈소판 유래 EV (PL-EV)를 관절 관절염 조건에 대한 치료로 사용합니다. PL-Ev는 Wnt/β-카테닌^{통로(18)를}활성화하여 연골세포 증식 및 세포 이동을 개선, 골관절염^{분골19에서}연골성 마커의 발현을 촉진하거나, 더 높은 수준의 연골관절염 단백질을 나타내거나, PL-E18로 치료된 골관절염 토끼의 더 적은 치창 이상을 보여준다.

전기자동차는 표적 세포로 해방되는 단백질, 지질 및 핵산을 함유하고 있으며, 세포 간 통신을 확립하여 치료 적용^20과관련된 주요 특징이다. EV의 효과는 도달 셀과 후속 화물 방출에 따라 달라집니다. 이러한 효과는 대사 활동 또는 유전자 발현 수정과 같은 세포에 의한 변화에 의해 간접적으로 확인할 수 있다. 그러나 이러한 방법은 EV가 세포에 도달하는 방법을 시각화하여 기능을 발휘하도록 허용하지 않습니다. 따라서, 본 논문은 염증 중심의 OA 연골 연골 경질 에 대한 치료제로 사용되는 이러한 PL 유래 전기자동차를 라벨링하는 방법을 제시한다. 공초점 현미경 검사는 5h의 시간 경과에 있는 소멸에 존재하는 연골세포에 EV uptake 및 진행을 감시하기 위하여 이용되었습니다.

프로토콜

참고: 이디스바 바이오뱅크(IB 1995/12 BIO)로부터 CEI-IB(IB 3656118 PI)의 프로젝트의 윤리적 승인 후 제도적 가이드라인에 따라 연골 이출을 획득했습니다.

1. 열 준비

1. 제조업체의 지침에 따라 또는 다음과 같이 열을 평형화합니다.
   1. 열 캡을 제거하고 열을 상위화합니다. 용출하여 저장소 버퍼를 제거합니다.
   2. 인산염 완충식식염(PBS)의 2.5mL로 컬럼을 3회 세척한다. 각 세척 하는 동안, 전체 볼륨을 흡수 하는 열에 대 한 기다립니다.
      참고: 열을 건조시키지 마십시오.
   3. 마지막 세척 후 와 샘플 준비까지 캡으로 컬럼을 덮습니다.

2. EV 라벨링

참고: 이 EV 라벨링 프로토콜은 이전에 설명된^{조건(21,22)을}가진 크기 배제 크로마토그래피(SEC)에 의해 이전에 격리된 PL-EV 샘플을 사용합니다. 그러나 모든 소스의 모든 EV 샘플은 이 프로토콜과 함께 사용될 수 있습니다.

1. 집중 튜브를 사용하여 EV 샘플 및 제어(PBS)를 농축합니다.
   1. EV 샘플 시작의 시작 부피에 따라 샘플을 15mL 또는 500 μL 집중 튜브에 배치합니다. 거의 건조한 시료를 얻을 때까지 제조업체의 지시에 따라 튜브를 원심 분리합니다.
      참고: 제어 샘플은 염료 배경을 확인하는 데 필요합니다. 이 방법은 특정 초기 부피를 필요로하지 않지만, 정제 단계에서 입자의 약 10 %가 손실되는 것으로 간주되어야한다.
2. 희석 C. 200 μL및 100 μL의 대조군으로 EV 샘플을 다시 중단하고 새로운 1.5mL 원심분리기 튜브로 이송합니다.
3. EV 샘플을 100 μL의 두 개의 알리쿼트로 분리하여 염료로 표시하고 치료(PKH-PL-EV)로 사용하십시오. 다른 표시되지 않은 상태로 두고 EV 샘플과 같이 (NTA-PL-EV)를 처리하고 NTA에 의해 EV 농도를 정량화하는 데 사용합니다.
4. 2배 염료 용액을 준비하여 희석 C로 8μM PKH26 용액을 생성합니다.
5. 샘플에 희석 C의 125 μL 당 1 mM PKH26 링커의 1 μL을 혼합합니다. 1:1 비율로 샘플에 추가하는 데 필요한 볼륨을 준비합니다.
6. PKH-PL-EV에 2x 염료 용액을 추가하고 1:1 비율로 시료를 제어하여 1x 염료 농도와 4 μM PKH26 농도를 달성합니다. NTA-PL-EV 샘플에 동일한 양의 PBS를 추가합니다. 실온에서 5분 동안 배양하십시오.
7. 1:1 비율로 시료에 5% 소 세럼 알부민-PBS 용액을 추가하고 최종 부피가 ~400 μL인지 확인합니다.
   참고: 이 단계를 사용하면 비특이적 염료 상호 작용 또는 무한염료를 제거할 수 있습니다.
8. 레이블이 지정된 EV를 언바운드 염료및 열과 염료의 비특이적 상호 작용에서 분리합니다.

3. 라벨이 붙은 EV 격리

1. 컬럼에서 캡을 제거하고 시료의 400 μL(PKH-PL-EV, NTA-PL-EV 또는 제어)을 추가하고 모든 용출된 액체를 폐기합니다.
2. 다음 단계로 진행하기 전에 샘플이 열을 완전히 입력할 때까지 기다립니다. PBS의 600 μL을 추가하고 모든 용출 된 액체를 폐기합니다.
3. 다음 단계로 진행하기 전에 PBS가 열을 완전히 입력할 때까지 기다립니다. PBS의 600 μL을 추가하고 1.5에 600 μL의 일부를 수집합니다. mL 원심분리기 튜브(EV 또는 제어).
   참고: 샘플에서 과도한 염료를 제거하기 위해 이러한 단계가 필요합니다. 더 순수한 전기 EV를 얻으려면 열별 또 다른 분리가 필요합니다. 따라서, 다음 단계는 초기 세척 단계(4.2단계) 후에 새로운 평형 컬럼(step 4.1.) 또는 동일한 컬럼에서 수행되어야 한다.
4. 새로운 EV 분리 단계에 대한 열을 준비하여 더 순수한 전기를 얻습니다. 새 열인 경우 2.1단계를 반복합니다. 및 2.2. 동일한 열인 경우 2.5mL의 2.5mL로 열을 세척한 다음 2.1 및 2.2 단계를 반복합니다.
5. 2.5단계에서 얻은 이전에 용출된 전기 의 600 μL을 열에 넣고 용출된 부피를 폐기합니다. 다음 단계로 진행하기 전에 액체가 열에 완전히 들어갈 때까지 기다립니다.
6. PBS 의 400 μL을 추가하고 모든 용출 된 볼륨을 폐기합니다. 다음 단계로 진행하기 전에 액체가 열에 완전히 들어갈 때까지 기다립니다.
7. PBS의 600 μL을 추가하고 1.5mL 원심분리기 튜브에 600 μL의 일부를 수집합니다. 추가 분석을 위해 전기 및 제어 샘플을 사용하여 추가 분석을 하거나 4 oC에서 하룻밤 동안 저장합니다.
8. 나중에 사용할 수 있는 사용 된 열을 저장합니다.
   1. 20% 이소프로판올의 25mL로 컬럼을 세척하고 용출된 부피를 폐기하십시오. PBS의 2.5 mL로 컬럼을 3번 세척합니다.
   2. 1.1.1 단계에서 제거된 저장소 버퍼를 추가하고 버퍼가 열에 들어갈 때까지 기다립니다. 캡으로 열을 덮고 후속 사용까지 4oC에 저장합니다.

4. EV 정량화

1. 다음 두 단계에 의해 설명된 바와 같이 NTA-PL-EV 샘플 및 초기 PL-EV 샘플의 1:1,000 희석을 준비한다.
   1. 0.2 μm 필터를 통해 여과된 PBS를 통해 1:10 희석NTA-PL-EV 와 1:10 희석 초기 PL-EV의 1mL을 준비한다.
   2. 0.2 μm 필터를 통해 여과된 PBS로 이전 희석 시료의 1:100 희석1mL을 준비한다.
2. NTA 펌프에 멸균 주사기를 사용하여 1:1,000 희석NTA-PL-EV 샘플 또는 초기 PL-EV 샘플을 주입한다. 입자 농도 및 크기 분포 결정에 대한 제조업체의 지침 및 권장 사항을 따르십시오.
   참고: EV 농도는 샘플 스타터 볼륨에 따라 달라지므로 중간 희석을 읽고 올바른 NTA 판정을 얻기 위해 조정해야 할 수도 있습니다.

5. 염증 중심의 OA에 대한 치료로 사용되는 전기 자동차

1. PBS로 연골을 두 번 세척하고 멸균 조건하에서 3mm 직경의 생검 펀치를 사용하여 소비합니다.
   참고: 세포 배양 후드에서 5.1단계에서 5.6단계부터 절차를 수행합니다.
2. 37 oC, 5 % CO_2,80 % 습도에서 1 % 페니실린 - 연쇄 절제술로 보충 DMEM-F12 배지와 96 웰 문화 판에 이식을 배치합니다.
   1. 염증 중심OA 모델을 확립하려면 세포 배양 배지를 10 ng/mL 온코스타틴 M 및 2 ng/mL 종양 괴사 인자-알파(TNFα)로 보완한다.
3. 1× 10⁹ 개의 입자 / 라벨이 붙은 전기 자동차 (PKH-PL-EV) 또는 온코사틴 M 및 TNFα로 보충 된 세포 배양 배지에서 제어하여 이물질을 처리합니다.
   참고: 1× 10⁹ 입자/웰을 포함하는 샘플의 부피를 측정하고 컨트롤에 동일한 부피를 사용합니다.
4. 연골 이외에도 함유된 96웰 세포 배양 판에서 배지를 제거한다. 각 웰에 5.3 단계에서 설명된 세포 배양 배지의 200 μL을 추가합니다.
   참고: 96웰 플레이트가 태아 소 혈청(FBS)과 접촉한 경우, FBS에서 전기를 제거하기 위해 200μL의 PBS로 각각 세 번 씻으세요.
5. 0, 1, 2, 3, 4 및 5 h : 다른 시간에 시험관 내 분석기를 중지합니다.
6. 연골을 함유한 세포 배양 우물을 PBS 200 μL로 두 번 세척합니다.
7. 4%의 파라포름알데히드(PFA)의 100μL을 조직에 추가하여 4oC에서 3시간 동안 고정합니다.
   참고: PFA와 관련된 단계는 안전 데이터 시트 권장 사항에 따라 연기 후드에서 수행해야 합니다.
8. PFA를 제거하고, PBS의 100 μL을 추가하고, 고정 조직을 4°C에 저장하고, 48h 이내에 샘플을 처리한다.

6. 현미경 검사기 준비 및 시각화

참고: 이 조직학적 절차는 탈수, 파라핀 포함 및 재수화 단계로 구성됩니다. 이러한 단계는 전반적인 염료 형광을 줄일 수 있습니다(PKH26에 대한 데이터 시트에 언급된 제한). 따라서, 냉동 단면과 같은 다른 절차는 공초점 현미경검사법에 의한 EV 시각화에 더 적합할 수 있다.

1. 파라핀 블록에 고정 된 조직을 포함. 조직을 6 μm 두께의 섹션으로 자른다.
2. 조직 섹션을 분리합니다.
   참고: 자일렌을 사용하는 모든 단계는 연기 후드로 수행해야 합니다.
   1. 자일렌에 30분, 에탄올 100% 2분, 에탄올 96% 2분, 에탄올 75% 1분, 마지막으로 30초 증류수에 침수합니다.
3. 조직 섹션을 과미화합니다.
   1. 조직을 과미화하기 위해 0.1% 트리톤-0.1% 구연산 나트륨 용액을 준비한다. 각 티슈 섹션에 20 μL 드롭을 추가하고 실온에서 10 분 동안 배양하십시오. PBS의 20 μL로 각 섹션을 두 번 세척합니다.
4. 현미경 슬라이드에, 형광을 보존하기 위한 수성 장착 매체와 함께 4′,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI)를 포함하는 장착 매체의 한 방울을 추가합니다. 6.3.1 단계에서 3개의 조직 단면을 포함하는 슬라이드를 덮습니다.
5. 빛으로부터 보호되는 실온에서 밤새 슬라이드를 배양합니다.
6. 4 °C에 저장, 공초점 현미경 검사까지 빛으로부터 보호.

결과

도 1에EV 라벨링 및 업테이크 모니터링에 대한 회로도 개요가 표시됩니다. 표 1에서 NTA에 의해 검출된 입자 농도 및 EV 크기는 컬럼으로 라벨링한 후 두 번 수행된 정화 단계로 인해 공정 중에 EV 농도가 감소함을 보여준다. 그러나, 얻어진 양은 처리를 위해 사용하는 입자의 수의 최적 범위에 있다. 이러한 입자 농도는 골관절염 연골 경질을 치료하는 데 사용되는 P...

토론

EV 이미징은 방출 및 섭취 메커니즘과 같은 EV 특성을 이해하는 데 도움이 됩니다. 그들의 화상 진찰은 그들의 생체 분배의 감시 및 약동성 속성의 특성을 약 차량으로 허용합니다. 그러나, EV 이미징 및 추적은 그들의 작은 크기 때문에 어려울 수 있습니다, 많은 이미징 장치 및 라벨링 기술은 연구원이 체외및 생체 내 조건에서 전기를 모니터링하는 데 도움이 개발되었지만

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
Material
1.5 mL Centrifuge tube	SPL life sciences	PLC60015
1 mL Syringe BD Plastipak	BD	303174
2-Propanol (Isopropanol)	Panreac AppliChem	1.310.901.211	Prepared at 20% with Milli-Q water
96-well culture plate	SPL life sciences	PLC30096
Absolute ethanol Pharmpur	Scharlab	ET0006005P	Used to prepare 96% and 75% ethanol with Milli-Q water
Biopsy Punch with plunger 3 mm	Scandidact	MTP-33-32
Bovine serum Albumin (BSA)	Sigma-Aldrich	A7030	Prepared at 5% with PBS
Cartilage explants	IdISBa Biobank
Concentrating tube 15 mL Nanosep 100 kD Omega	Pall	MCP100C41
Concentrating tube 500 µL Nanosep 100 kD Omega	Pall	OD003C33
Cover glass 24 x 60 mm	Deltalab	D102460
DMEM-F12 -GlutaMAX medium	Biowest	L0092
Dulbecco's PBS (1x)	Capricorn Scientific	PBS-1A
Embedded paraffin tissue blocks	IdISBa Biobank		Fee for service
Exo-spin mini-HD columns	Cell guidance systems	EX05
Feather S35 Microtome Blade	Feather	43037
Filtropur S 0.2 µm syringe filter	Sarstedt	83.1826.001
Fluoroshield with DAPI	Sigma-Aldrich	F-6057
Oncostatin M Human	Sigma-Aldrich	O9635-10UG	Prepare a stock solution to a final concentration of 0.1 µg/µL diluten in PBS-0.1% BSA
Paraformaldehyde	Sigma-Aldrich	8.18715.1000	Prepared at 4% with PBS and stored at 4 °C
Penicillin-Streptomycin Solution 100x	Biowest	L0022
PKH26 Red Fluorescent Cell Linker Kit for General Cell Membrane Labeling	Sigma-Aldrich	MINI26	PKH26 and Dliuent C included
Sodium citrate dihydrate	Scharlab	SO019911000
Superfrost Plus Microscope Slides	Thermo Scientific	J1800AMNZ
TNFα	R&D systems	210-TA-005	Prepare a stock solution to a final concentration of 0.01 µg/µL diluted in PBS-0.1% BSA
Triton X-100	Sigma-Aldrich	T8787	Used to prepare a 0.1% Triton-0.1% sodium citrate solution with Milli-Q water
Xylene	Scharlab	XI0050005P
Equipment
Centrifuge 5430 R	Eppendorf	5428000210	F-45-48-11 rotor
NanoSight NS300	Malvern	NS300	Device with embedded laser at λ= 532 nm and camera sCMOS
Shandon Finesse 325 Manual Microtome	Thermo Scientific™	A78100101
TCS-SPE confocal microscope	Leica Microsystems	5200000271