Rotulagem de vesículas extracelulares para monitoramento de migração e absorção em Explants de cartilagem

Resumo

Aqui, apresentamos um protocolo para rotular vesículas extracelulares derivadas de plaquetas para monitorar sua migração e absorção em explanações de cartilagem usadas como modelo de osteoartrite.

Resumo

Vesículas extracelulares (EVs) são utilizadas em diferentes estudos para comprovar seu potencial como tratamento livre de células devido à sua carga derivada de sua fonte celular, como o lisato plaqueta (PL). Quando usados como tratamento, espera-se que os EVs entrem nas células-alvo e afetuem uma resposta a partir delas. Nesta pesquisa, os EVs derivados do PL têm sido estudados como um tratamento livre de células para osteoartrite (OA). Assim, foi criado um método para rotular EVs e testar sua absorção em explants de cartilagem. Os EVs derivados do PL são rotulados com o corante lipofílico PKH26, lavados duas vezes através de uma coluna e, em seguida, testados em um modelo OA in vitro orientado para inflamação por 5 h após quantificação de partículas por análise de rastreamento de nanopartículas (NTA). De hora em hora, as explantas de cartilagem são fixas, parafinadas, cortadas em seções de 6 μm para montar em lâminas, e observadas sob um microscópio confocal. Isso permite verificar se os EVs entram nas células-alvo (condrócitos) durante esse período e analisam seu efeito direto.

Introdução

A osteoartrite (OA) é uma doença degenerativa articular que implica uma inflamação progressiva e irreversível e destruição da matriz extracelular da cartilagem articular¹. Embora várias formas de artrite tenham inúmeros tratamentos^2,3,4, estes são restritos por seus efeitos colaterais e eficácia limitada. Técnicas de engenharia de tecidos utilizando implantação de condrocito autólogo são rotineiramente aplicadas para o tratamento regenerativo da cartilagem lesionada nas lesões precoces da cartilagem OA⁴. As terapias baseadas em ....

Protocolo

NOTA: As explanagens de cartilagem foram obtidas junto ao IdISBa Biobank (IB 1995/12 BIO) em conformidade com as diretrizes institucionais após aprovação ética do projeto pelo CEI-IB (IB 3656118 PI).

1. Preparação da coluna

1. Colunas de equilíbrio seguindo as instruções do fabricante ou a seguir:
   1. Remova a tampa da coluna e equilibre a coluna. Remova o buffer de armazenamento por eluição.
   2. Lave a coluna 3 vezes com 2,5 mL de soro fisiológico tamponado com fosfato (PBS). Durante cada lavagem, espere que a coluna absorva todo o volume.
      NOTA: Não deixe a coluna secar.
   3. Cubra a coluna com a tampa após a últ....

Resultados

Uma visão geral esquemática para o monitoramento de rotulagem e absorção de EV é exibida na Figura 1. A concentração de partículas e o tamanho de EV detectados pela NTA na Tabela 1 mostram que a concentração de EV diminui durante o processo devido à etapa de purificação realizada duas vezes após a rotulagem com a coluna. No entanto, a quantidade obtida está na faixa ideal do número de partículas para usar para tratamento. Esta concentração de partículas ?.......

Discussão

A imagem EV ajuda a entender as propriedades de EV, como seus mecanismos de liberação e absorção. Sua imagem permite o monitoramento de sua biodistribução e a caracterização de suas propriedades farmacocinéticas como veículos de drogas. No entanto, a imagem e o rastreamento de EV podem ser difíceis devido aos seus pequenos tamanhos, embora muitos dispositivos de imagem e técnicas de rotulagem tenham sido desenvolvidos para ajudar os pesquisadores a monitorar EVs sob condições in vitro e in vivo.......

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Material
1.5 mL Centrifuge tube	SPL life sciences	PLC60015
1 mL Syringe BD Plastipak	BD	303174
2-Propanol (Isopropanol)	Panreac AppliChem	1.310.901.211	Prepared at 20% with Milli-Q water
96-well culture plate	SPL life sciences	PLC30096
Absolute ethanol Pharmpur	Scharlab	ET0006005P	Used to prepare 96% and 75% ethanol with Milli-Q water
Biopsy Punch with plunger 3 mm	Scandidact	MTP-33-32
Bovine serum Albumin (BSA)	Sigma-Aldrich	A7030	Prepared at 5% with PBS
Cartilage explants	IdISBa Biobank
Concentrating tube 15 mL Nanosep 100 kD Omega	Pall	MCP100C41
Concentrating tube 500 µL Nanosep 100 kD Omega	Pall	OD003C33
Cover glass 24 x 60 mm	Deltalab	D102460
DMEM-F12 -GlutaMAX medium	Biowest	L0092
Dulbecco's PBS (1x)	Capricorn Scientific	PBS-1A
Embedded paraffin tissue blocks	IdISBa Biobank		Fee for service
Exo-spin mini-HD columns	Cell guidance systems	EX05
Feather S35 Microtome Blade	Feather	43037
Filtropur S 0.2 µm syringe filter	Sarstedt	83.1826.001
Fluoroshield with DAPI	Sigma-Aldrich	F-6057
Oncostatin M Human	Sigma-Aldrich	O9635-10UG	Prepare a stock solution to a final concentration of 0.1 µg/µL diluten in PBS-0.1% BSA
Paraformaldehyde	Sigma-Aldrich	8.18715.1000	Prepared at 4% with PBS and stored at 4 °C
Penicillin-Streptomycin Solution 100x	Biowest	L0022
PKH26 Red Fluorescent Cell Linker Kit for General Cell Membrane Labeling	Sigma-Aldrich	MINI26	PKH26 and Dliuent C included
Sodium citrate dihydrate	Scharlab	SO019911000
Superfrost Plus Microscope Slides	Thermo Scientific	J1800AMNZ
TNFα	R&D systems	210-TA-005	Prepare a stock solution to a final concentration of 0.01 µg/µL diluted in PBS-0.1% BSA
Triton X-100	Sigma-Aldrich	T8787	Used to prepare a 0.1% Triton-0.1% sodium citrate solution with Milli-Q water
Xylene	Scharlab	XI0050005P
Equipment
Centrifuge 5430 R	Eppendorf	5428000210	F-45-48-11 rotor
NanoSight NS300	Malvern	NS300	Device with embedded laser at λ= 532 nm and camera sCMOS
Shandon Finesse 325 Manual Microtome	Thermo Scientific™	A78100101
TCS-SPE confocal microscope	Leica Microsystems	5200000271