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Resumo

Aqui, apresentamos um protocolo para rotular vesículas extracelulares derivadas de plaquetas para monitorar sua migração e absorção em explanações de cartilagem usadas como modelo de osteoartrite.

Resumo

Vesículas extracelulares (EVs) são utilizadas em diferentes estudos para comprovar seu potencial como tratamento livre de células devido à sua carga derivada de sua fonte celular, como o lisato plaqueta (PL). Quando usados como tratamento, espera-se que os EVs entrem nas células-alvo e afetuem uma resposta a partir delas. Nesta pesquisa, os EVs derivados do PL têm sido estudados como um tratamento livre de células para osteoartrite (OA). Assim, foi criado um método para rotular EVs e testar sua absorção em explants de cartilagem. Os EVs derivados do PL são rotulados com o corante lipofílico PKH26, lavados duas vezes através de uma coluna e, em seguida, testados em um modelo OA in vitro orientado para inflamação por 5 h após quantificação de partículas por análise de rastreamento de nanopartículas (NTA). De hora em hora, as explantas de cartilagem são fixas, parafinadas, cortadas em seções de 6 μm para montar em lâminas, e observadas sob um microscópio confocal. Isso permite verificar se os EVs entram nas células-alvo (condrócitos) durante esse período e analisam seu efeito direto.

Introdução

A osteoartrite (OA) é uma doença degenerativa articular que implica uma inflamação progressiva e irreversível e destruição da matriz extracelular da cartilagem articular1. Embora várias formas de artrite tenham inúmeros tratamentos2,3,4, estes são restritos por seus efeitos colaterais e eficácia limitada. Técnicas de engenharia de tecidos utilizando implantação de condrocito autólogo são rotineiramente aplicadas para o tratamento regenerativo da cartilagem lesionada nas lesões precoces da cartilagem OA4. As terapias baseadas em células são restritas principalmente devido ao número limitado de condrócitos fenotipicamente estáveis ou chondroprogenitors capazes de reparar efetivamente a cartilagem3. Portanto, o desenvolvimento de novas estratégias terapêuticas para prevenir a progressão da doença e regenerar grandes lesões de cartilagem é de suma importância.

Vesículos extracelulares (EVs) têm sido sugeridos como um tratamento para OA por diferentes autores5,6. Os EVs são corpos membranous secretados pela maioria dos tipos de células, estão envolvidos na sinalização intercelular, e têm sido mostrados para exercer os efeitos terapêuticos das células-tronco7,8,9, devido ao qual recentemente despertaram interesse em medicina regenerativa10. Os EVs derivados de células estromais mesenquimais (MSCs) são os principais EVs terapêuticos investigados para OA, embora outras células relacionadas à articulação tenham sido usadas como fontes de EV, por exemplo, condroprogenitors ou células imunes11,12.

Concentrados plaquetas, como plaquetas plaquetas (PLs), são usados para melhorar a cicatrização de feridas em diferentes lesões, como úlceras córneas13,14,15 ou na regeneração do tecido tendinoso16,devido à hipótese de que o componente EV dos concentrados plaquetas pode ser responsável por esses efeitos17 . Alguns estudos relacionados a doenças relacionadas à articulação utilizam EVs derivados de plaquetas (PL-EVs) como tratamento para amenizar as condições osteoartríticas. Os PL-EVs melhoram a proliferação de condrocitos e a migração celular ativando a via Wnt/β-catenin18, promovendo a expressão de marcadores condrogênicos em condrócitos osteoartréticos19, ou mostrando níveis mais elevados de proteínas condrogênicas e menos anormalidades tissulares em coelhos osteoartrrápticos tratados com PL-EVs18.

Os EVs contêm proteínas, lipídios e ácidos nucleicos que são liberados para a célula-alvo, estabelecendo a comunicação célula-célula, que é a principal característica relacionada às suas aplicações terapêuticas20. Os efeitos dos EVs dependem de suas células de alcance e posterior liberação de carga. Esse efeito pode ser confirmado indiretamente por alterações causadas nas células, como atividade metabólica ou modificação da expressão genética. No entanto, esses métodos não permitem a visualização de como os EVs chegam às células para exercer sua função. Assim, este artigo apresenta um método para rotular esses EVs derivados de PL para serem utilizados como tratamento para explantas de cartilagem OA orientadas por inflamação. A microscopia confocal foi utilizada para monitorar a absorção e progressão de EV para os condrócitos presentes nas explantas em um lapso de tempo de 5h.

Protocolo

NOTA: As explanagens de cartilagem foram obtidas junto ao IdISBa Biobank (IB 1995/12 BIO) em conformidade com as diretrizes institucionais após aprovação ética do projeto pelo CEI-IB (IB 3656118 PI).

1. Preparação da coluna

  1. Colunas de equilíbrio seguindo as instruções do fabricante ou a seguir:
    1. Remova a tampa da coluna e equilibre a coluna. Remova o buffer de armazenamento por eluição.
    2. Lave a coluna 3 vezes com 2,5 mL de soro fisiológico tamponado com fosfato (PBS). Durante cada lavagem, espere que a coluna absorva todo o volume.
      NOTA: Não deixe a coluna secar.
    3. Cubra a coluna com a tampa após a última lavagem e até a preparação da amostra.

2. Rotulagem EV

NOTA: Este protocolo de rotulagem EV utiliza uma amostra PL-EV anteriormente isolada por cromatografia de exclusão de tamanho (SEC) com condições previamente descritas21,22. No entanto, qualquer amostra de EV de qualquer fonte pode ser usada com este protocolo.

  1. Concentre a amostra EV e o controle (PBS) utilizando um tubo de concentração.
    1. Coloque as amostras em um tubo concentrador de 15 mL ou 500 μL, dependendo do volume inicial da inicialção da amostra EV. Centrifugar os tubos de acordo com as instruções do fabricante até que uma amostra quase seca seja obtida.
      NOTA: A amostra de controle é necessária para verificar se há qualquer fundo de corante. Embora este método não exija nenhum volume inicial específico, deve-se considerar que cerca de 10% das partículas serão perdidas durante as etapas de purificação.
  2. Resuspend as amostras concentradas com amostras de EV diluentes com 200 μL e o grupo controle com 100 μL e transfira-as para novos tubos de centrífugas de 1,5 mL.
  3. Separe a amostra de EV em duas alíquotas de 100 μL. Marque um com corante e use-a como tratamento (PKH-PL-EV); deixe o outro não marcado, mas processe-o (NTA-PL-EV) como a amostra EV e use-a para quantificar a concentração de EV pela NTA.
  4. Prepare a solução de corante 2x, resultando em solução PKH26 de 8 μM em C diluído.
  5. Misture 1 μL de 1 mM PKH26 linker por 125 μL de C diluído na amostra. Prepare um volume necessário para adicionar às amostras em uma proporção de 1:1.
  6. Adicione solução de corante 2x ao PKH-PL-EV e controle amostras em uma proporção de 1:1 para alcançar 1x de concentração de corante e 4 μM de concentração PKH26. Adicione o mesmo volume de PBS à amostra NTA-PL-EV. Incubar por 5 minutos em temperatura ambiente.
  7. Adicione 5% de solução de gérico bovino albumin-PBS às amostras em uma proporção de 1:1 e certifique-se de que o volume final seja ~400 μL.
    NOTA: Esta etapa permite a remoção de interações de corantes inespecíficos ou corantes não vinculados.
  8. Prossiga para separar os EVs rotulados do corante não vinculado e interações não específicas do corante com a coluna.

3. Isolamento rotulado-EV

  1. Retire a tampa da coluna, adicione 400 μL da amostra (PKH-PL-EV, NTA-PL-EV ou controle) e descarte todo o líquido elucido.
  2. Aguarde que a amostra entre completamente na coluna antes de prosseguir para o próximo passo. Adicione 600 μL de PBS e descarte todo o líquido elucido.
  3. Aguarde que o PBS entre completamente na coluna antes de prosseguir para a próxima etapa. Adicione 600 μL de PBS e colete uma fração de 600 μL em um 1,5. tubo de centrífugas mL (EVs ou controle).
    NOTA: Estas etapas são necessárias para remover o excesso de corante das amostras. Outra separação por coluna é necessária para obter EVs mais puros. Assim, as etapas a seguir devem ser realizadas em uma nova coluna equilibrada (etapa 4.1.) ou na mesma coluna após uma etapa inicial de lavagem (etapa 4.2).
  4. Prepare a coluna para uma nova etapa de separação do EV para obter EVs mais puros. Se for uma nova coluna, repita os passos 2.1. e 2,2. Se for a mesma coluna, lave a coluna com 2,5 mL de isopropanol de 20% e, em seguida, repita as etapas 2.1 e 2.2.
  5. Adicione 600 μL de EVs previamente elucidos obtidos na etapa 2.5 à coluna e descarte o volume elucido. Aguarde que o líquido entre na coluna completamente antes de prosseguir para o próximo passo.
  6. Adicione 400 μL de PBS e descarte todo o volume elucido. Aguarde que o líquido entre na coluna completamente antes de prosseguir para o próximo passo.
  7. Adicione 600 μL de PBS e colete uma fração de 600 μL em um tubo de centrífuga de 1,5 mL. Use os EVs e as amostras de controle para novas análises ou armazene-as durante a noite a 4 oC.
  8. Armazene as colunas usadas para uso futuro.
    1. Lave a coluna com 25 mL de isopropanol de 20% e descarte o volume elucido. Lave a coluna 3 vezes com 2,5 mL de PBS.
    2. Adicione o buffer de armazenamento removido na etapa 1.1.1 e aguarde que o buffer entre na coluna. Cubra a coluna com a tampa e armazene a 4 oC até o uso subsequente.

4. Quantificação de EV

  1. Prepare 1:1.000 diluições da amostra NTA-PL-EV e da amostra inicial de PL-EV, conforme descrito pelas duas etapas seguintes.
    1. Prepare 1 mL de 1:10 diluído NTA-PL-EV e 1 mL de PL-EV inicial diluído com PBS filtrado através de um filtro de 0,2 μm.
    2. Prepare 1 mL de uma diluição de 1:100 das amostras diluídas anteriores com PBS filtrado através de um filtro de 0,2 μm.
  2. Injete a amostra NTA-PL-EV diluída de 1:100 ou a amostra inicial de PL-EV usando uma seringa estéril na bomba NTA. Siga as instruções e recomendações do fabricante para a concentração de partículas e a determinação da distribuição de tamanho.
    NOTA: Como a concentração de EV depende do volume de inicialização da amostra, pode ser necessário ler diluições intermediárias e fazer ajustes para obter uma determinação correta do NTA.

5. EVs usados como tratamento para OA movidos a inflamação

  1. Lave a cartilagem duas vezes com PBS e extirpar-a usando um soco de biópsia de 3 mm de diâmetro em condições estéreis.
    NOTA: Realize o procedimento das etapas 5.1 a 5.6 em um capô de cultura celular.
  2. Coloque as explantas em placas de cultura de 96 poços com meio DMEM-F12 suplementado com 1% de penicilina-estreptomicina a 37 oC, 5% DE CO2e 80% de umidade.
    1. Para estabelecer um modelo de OA orientado para inflamação, suplementar o meio de cultura celular com oncostatina M de 10 ng/mL e 2 ng/mL fator de necrose tumoral alfa (TNFα).
  3. Trate as explantas com 1 × 109 partículas/poço de EVs rotulados (PKH-PL-EV) ou controle em meio de cultura celular complementado com oncostatina M e TNFα.
    NOTA: Meça o volume da amostra contendo 1 × 109 partículas/poço e use o mesmo volume para o controle.
  4. Remova o meio das placas de cultura celular de 96 poços contendo explants de cartilagem. Adicione 200 μL do meio de cultura celular descrito na etapa 5.3 para cada poço.
    NOTA: Se as placas de 96 poços tiverem estado em contato com o soro bovino fetal (FBS), lave cada poço três vezes com 200 μL de PBS para remover quaisquer EVs do FBS.
  5. Pare o ensaio in vitro em horários diferentes: 0, 1, 2, 3, 4 e 5h.
  6. Lave os poços de cultura celular contendo as explantas de cartilagem duas vezes com 200 μL de PBS.
  7. Adicione 100 μL de 4% de paraformaldeído (PFA) ao tecido para fixá-lo por 3h a 4 oC.
    NOTA: As etapas que envolvem a PFA devem ser realizadas em um capô de fumaça seguindo as recomendações da Ficha de Dados de Segurança.
  8. Retire o PFA, adicione 100 μL de PBS, armazene o tecido fixo a 4 °C e processe as amostras dentro de 48 h.

6. Preparação e visualização de microscopia

NOTA: Este procedimento histológico consiste em desidratação, incorporação de parafina e etapas de reidratação. Essas etapas podem reduzir a fluorescência geral do corante (uma limitação mencionada na folha de dados para PKH26). Portanto, outros procedimentos, como a secção congelada, podem ser mais adequados para visualização de EV por microscopia confocal.

  1. Incorpore os tecidos fixos em blocos de parafina. Corte o tecido em seções de 6 μm de espessura.
  2. Desparafinar as seções de tecido.
    NOTA: Todas as etapas que utilizam xileno devem ser realizadas em um capô de fumaça.
    1. Mergulhe as seções teciduais em xileno por 30 min, 100% etanol por 2 min, 96% etanol por 2 min, 75% etanol por 1 min, e finalmente em água destilada por 30 s.
  3. Permeabilize as seções teciduais.
    1. Prepare uma solução de citrato de sódio Triton-0,1% de 0,1% para permeabilizar o tecido. Adicione uma gota de 20 μL em cada seção de tecido e incubar por 10 minutos à temperatura ambiente. Lave cada seção duas vezes com 20 μL de PBS.
  4. Em um slide microscópico, adicione uma gota de meio de montagem contendo 4′,6-diamidino-2-fenilôdole (DAPI) com um meio de montagem aquoso para preservar a fluorescência. Cubra a lâmina contendo 3 seções teciduais da etapa 6.3.1.
  5. Incubar os slides durante a noite à temperatura ambiente, protegidos da luz.
  6. Armazene a 4 °C, protegido da luz até a microscopia confocal.

Resultados

Uma visão geral esquemática para o monitoramento de rotulagem e absorção de EV é exibida na Figura 1. A concentração de partículas e o tamanho de EV detectados pela NTA na Tabela 1 mostram que a concentração de EV diminui durante o processo devido à etapa de purificação realizada duas vezes após a rotulagem com a coluna. No entanto, a quantidade obtida está na faixa ideal do número de partículas para usar para tratamento. Esta concentração de partículas ?...

Discussão

A imagem EV ajuda a entender as propriedades de EV, como seus mecanismos de liberação e absorção. Sua imagem permite o monitoramento de sua biodistribução e a caracterização de suas propriedades farmacocinéticas como veículos de drogas. No entanto, a imagem e o rastreamento de EV podem ser difíceis devido aos seus pequenos tamanhos, embora muitos dispositivos de imagem e técnicas de rotulagem tenham sido desenvolvidos para ajudar os pesquisadores a monitorar EVs sob condições in vitro e in vivo...

Divulgações

Os autores não têm conflitos de interesse para divulgar.

Agradecimentos

Esta pesquisa foi financiada pelo Instituto de Salud Carlos III, Ministerio de Economía y Competitividad, co-financiado pelo Fundo Social Europeu da ESF e pelo Fundo Europeu de Desenvolvimento Regional do ERDF (MS16/00124; CP16/00124); pelo PROGRAMA JUNIOR del proyecto TALENT PLUS, construyendo SALUD, generando VALOR (JUNIOR01/18), financiado pelo imposto sobre o turismo sustentável das Ilhas Baleares; pelo Direcció General d'Investigació, Conselleria d'Investigació, Govern Balear (FPI/2046/2017); pelo programa de pós-doutorado FOLIUM (FOLIUM 17/01) dentro do FUTURMed, financiado em 50% pelo imposto sobre o turismo sustentável das Ilhas Baleares e em 50% pela ESF; e pelo Comissio de Docencia i Investigacio de la Fundacio Banc de Sang i Teixits de les Illes Balears (CDI21/03).

Materiais

NameCompanyCatalog NumberComments
Material
1.5 mL Centrifuge tubeSPL life sciencesPLC60015
1 mL Syringe BD PlastipakBD303174
2-Propanol (Isopropanol)Panreac AppliChem1.310.901.211Prepared at 20% with Milli-Q water
96-well culture plateSPL life sciencesPLC30096
Absolute ethanol PharmpurScharlabET0006005PUsed to prepare 96% and 75% ethanol with Milli-Q water
Biopsy Punch with plunger 3 mmScandidactMTP-33-32
Bovine serum Albumin (BSA)Sigma-AldrichA7030Prepared at 5% with PBS
Cartilage explantsIdISBa Biobank
Concentrating tube 15 mL Nanosep 100 kD OmegaPallMCP100C41
Concentrating tube 500 µL Nanosep 100 kD OmegaPallOD003C33
Cover glass 24 x 60 mmDeltalabD102460
DMEM-F12 -GlutaMAX mediumBiowestL0092
Dulbecco's PBS (1x)Capricorn ScientificPBS-1A
Embedded paraffin tissue blocksIdISBa BiobankFee for service
Exo-spin mini-HD columnsCell guidance systemsEX05
Feather S35 Microtome BladeFeather43037
Filtropur S 0.2 µm syringe filterSarstedt83.1826.001
Fluoroshield with DAPISigma-AldrichF-6057
Oncostatin M HumanSigma-AldrichO9635-10UGPrepare a stock solution to a final concentration of 0.1 µg/µL diluten in PBS-0.1% BSA
ParaformaldehydeSigma-Aldrich8.18715.1000Prepared at 4% with PBS and stored at 4 °C
Penicillin-Streptomycin Solution 100xBiowestL0022
PKH26 Red Fluorescent Cell Linker Kit for General Cell Membrane LabelingSigma-AldrichMINI26PKH26 and Dliuent C included
Sodium citrate dihydrateScharlabSO019911000
Superfrost Plus Microscope SlidesThermo ScientificJ1800AMNZ
TNFαR&D systems210-TA-005Prepare a stock solution to a final concentration of 0.01 µg/µL diluted in PBS-0.1% BSA
Triton X-100Sigma-AldrichT8787Used to prepare a 0.1% Triton-0.1% sodium citrate solution with Milli-Q water
XyleneScharlabXI0050005P
Equipment
Centrifuge 5430 REppendorf5428000210F-45-48-11 rotor
NanoSight NS300MalvernNS300Device with embedded laser at λ= 532 nm and camera sCMOS
Shandon Finesse 325 Manual MicrotomeThermo Scientific™A78100101
TCS-SPE confocal microscopeLeica Microsystems5200000271

Referências

  1. Sutton, S., et al. The contribution of the synovium, synovial derived inflammatory cytokines and neuropeptides to the pathogenesis of osteoarthritis. The Veterinary Journal. 179 (1), 10-24 (2009).
  2. Zylińska, B., Silmanowicz, P., Sobczyńska-Rak, A., Jarosz, &. #. 3. 2. 1. ;., Szponder, T. Treatment of articular cartilage defects: Focus on tissue engineering. In Vivo. 32 (6), 1289-1300 (2018).
  3. Mobasheri, A., Kalamegam, G., Musumeci, G., Batt, M. E. Chondrocyte and mesenchymal stem cell-based therapies for cartilage repair in osteoarthritis and related orthopaedic conditions. Maturitas. 78 (3), 188-198 (2014).
  4. Ringe, J., Burmester, G. R., Sittinger, M. Regenerative medicine in rheumatic disease-progress in tissue engineering. Nature Reviews Rheumatology. 8 (8), 493-498 (2012).
  5. Ringe, J., Burmester, G. R., Sittinger, M. Regenerative medicine in rheumatic disease-progress in tissue engineering. Nature Reviews Rheumatology. 8 (8), 493-498 (2012).
  6. Burke, J., et al. et al.Therapeutic potential of mesenchymal stem cell based therapy for osteoarthritis. Clinical and Translational Medicine. 5 (1), 27 (2016).
  7. Doeppner, T. R., et al. Extracellular vesicles improve post-stroke neuroregeneration and prevent postischemic immunosuppression. Stem Cells Translational Medicine. 4 (10), 1131-1143 (2015).
  8. Bruno, S., et al. Mesenchymal stem cell-derived microvesicles protect against acute tubular injury. Journal of the American Society of Nephrology. 20 (5), 1053-1067 (2009).
  9. Bruno, S., Camussi, G. Role of mesenchymal stem cell-derived microvesicles in tissue repair. Pediatric Nephrology. 28 (12), 2249-2254 (2013).
  10. Théry, C. Exosomes: secreted vesicles and intercellular communications. F1000 Biology Reports. 3, 15 (2011).
  11. D'Arrigo, D., et al. Secretome and extracellular vesicles as new biological therapies for knee osteoarthritis: a systematic review. Journal of Clinical Medicine. 8 (11), 1867 (2019).
  12. Ryan, S. T., et al. Extracellular vesicles from mesenchymal stromal cells for the treatment of inflammation-related conditions. International Journal of Molecular Sciences. 22 (6), 1-34 (2021).
  13. El Backly, R., et al. Platelet lysate induces in vitro wound healing of human keratinocytes associated with a strong proinflammatory response. Tissue Engineering. Part A. 17 (13-14), 1787-1800 (2011).
  14. Yuta, K., et al. Graefe's archive for clinical and experimental ophthalmology outcomes of phacoemulsification in patients with chronic ocular graft-versus-host disease. Bone Marrow Transplantation. 45 (3), 479-483 (2013).
  15. Del Bue, M., et al. Platelet lysate promotes in vitro proliferation of equine mesenchymal stem cells and tenocytes. Veterinary Research Communications. 31, 289-292 (2007).
  16. Klatte-Schulz, F., et al. Comparative analysis of different platelet lysates and platelet rich preparations to stimulate tendon cell biology: an in vitro study. International Journal of Molecular Sciences. 19 (1), 212 (2018).
  17. Headland, S. E., et al. Neutrophil-derived microvesicles enter cartilage and protect the joint in inflammatory arthritis. Science Translational Medicine. 7 (315), 1-13 (2015).
  18. Liu, X., et al. Exosomes derived from platelet-rich plasma present a novel potential in alleviating knee osteoarthritis by promoting proliferation and inhibiting apoptosis of chondrocyte via Wnt/β-catenin signaling pathway. Journal of Orthopaedic Surgery and Research. 14 (1), 470 (2019).
  19. Otahal, A., et al. Characterization and chondroprotective effects of extracellular vesicles from plasma- and serum-based autologous blood-derived products for osteoarthritis therapy. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 8 (1), 584050 (2020).
  20. Penfornis, P., Vallabhaneni, K. C., Whitt, J., Pochampally, R. Extracellular vesicles as carriers of microRNA, proteins and lipids in tumor microenvironment. International Journal of Cancer. 138 (1), 14-21 (2016).
  21. Ortega, F. G., et al. Interfering with endolysosomal trafficking enhances release of bioactive exosomes. Nanomedicine: Nanotechnology, Biology, and Medicine. 20, 102014 (2019).
  22. de Miguel Pérez, D., et al. Extracellular vesicle-miRNAs as liquid biopsy biomarkers for disease identification and prognosis in metastatic colorectal cancer patients. Scientific Reports. 10 (1), 1-13 (2020).
  23. Morelli, A. E., et al. Endocytosis, intracellular sorting, and processing of exosomes by dendritic cells. Blood. 104 (10), 3257-3266 (2004).
  24. Feng, D., et al. Cellular internalization of exosomes occurs through phagocytosis. Traffic. 11 (5), 675-687 (2010).
  25. Chuo, S. T. Y., Chien, J. C. Y., Lai, C. P. K. Imaging extracellular vesicles: Current and emerging methods. Journal of Biomedical Science. 25, 91 (2018).
  26. Rice, B. W., Cable, M. D., Nelson, M. B. In vivo imaging of light-emitting probes. Journal of Biomedical Optics. 6 (4), 432 (2001).
  27. Lai, C. P., et al. Visualization and tracking of tumour extracellular vesicle delivery and RNA translation using multiplexed reporters. Nature Communications. 6, 7029 (2015).
  28. Takahashi, Y., et al. Visualization and in vivo tracking of the exosomes of murine melanoma B16-BL6 cells in mice after intravenous injection. Journal of Biotechnology. 165 (2), 77-84 (2013).
  29. Askenasy, N., Farkas, D. L. Optical imaging of PKH-labeled hematopoietic cells in recipient bone marrow in vivo. Stem Cells. 20 (6), 501-513 (2002).
  30. Tamura, R., Uemoto, S., Tabata, Y. Immunosuppressive effect of mesenchymal stem cell-derived exosomes on a concanavalin A-induced liver injury model. Inflammation and Regeneration. 36, 26 (2016).
  31. Deddens, J. C., et al. Circulating extracellular vesicles contain miRNAs and are released as early biomarkers for cardiac injury. Journal of Cardiovascular Translational Research. 9 (4), 291-301 (2016).
  32. Skardelly, M., et al. Long-term benefit of human fetal neuronal progenitor cell transplantation in a clinically adapted model after traumatic brain injury. Journal of Neurotrauma. 28 (3), 401-414 (2011).
  33. Protocol guide: Exosome labeling using PKH lipophilic membrane dyes. Sigma-Aldrich Available from: https://www.sigmaaldrich.com/technical-documents/protocols/biology/cell-culture/exosome-labeling-pkh.html (2021)
  34. Dehghani, M., Gulvin, S. M., Flax, J., Gaborski, T. R. Systematic evaluation of PKH labelling on extracellular vesicle size by nanoparticle tracking analysis. Scientific Reports. 10 (1), 1-10 (2020).
  35. Morales-Kastresana, A., et al. Labeling extracellular vesicles for nanoscale flow cytometry. Scientific Reports. 7 (1), 1-10 (2017).
  36. Takov, K., Yellon, D. M., Davidson, S. M. Confounding factors in vesicle uptake studies using fluorescent lipophilic membrane dyes. Journal of Extracellular Vesicles. 6 (1), 1388731 (2017).
  37. Mortati, L., et al. In vitro study of extracellular vesicles migration in cartilage-derived osteoarthritis samples using real-time quantitative multimodal nonlinear optics imaging. Pharmaceutics. 12 (8), 1-18 (2020).

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