Markierung extrazellulärer Vesikel zur Überwachung der Migration und Aufnahme in Knorpelexplantaten

Zusammenfassung

Hier stellen wir ein Protokoll zur Kennzeichnung von extrazellulären Vesikeln aus Thrombozytenlysat vor, um ihre Migration und Aufnahme in Knorpelexplantaten zu überwachen, die als Modell für Osteoarthritis verwendet werden.

Zusammenfassung

Extrazelluläre Vesikel (EVs) werden in verschiedenen Studien verwendet, um ihr Potenzial als zellfreie Behandlung aufgrund ihrer Ladung aus ihrer zellulären Quelle, wie z.B. Thrombozytenlysat (PL), nachzuweisen. Wenn sie als Behandlung verwendet werden, wird erwartet, dass EVs in die Zielzellen eindringen und eine Reaktion von diesen bewirken. In dieser Forschung wurden PL-abgeleitete EVs als zellfreie Behandlung von Osteoarthritis (OA) untersucht. So wurde eine Methode entwickelt, um EVs zu kennzeichnen und ihre Aufnahme an Knorpelexplantaten zu testen. PL-abgeleitete EVs werden mit dem lipophilen Farbstoff PKH26 markiert, zweimal durch eine Säule gewaschen und dann in einem in vitro entzündungsgetriebenen OA-Modell für 5 h nach Partikelquantifizierung durch Nanopartikel-Tracking-Analyse (NTA) getestet. Stündlich werden Knorpelexplantate fixiert, paraffiniert, in 6-μm-Abschnitte geschnitten, um sie auf Objektträgern zu montieren, und unter einem konfokalen Mikroskop beobachtet. Dies ermöglicht die Überprüfung, ob EVs während dieser Zeit in die Zielzellen (Chondrozyten) gelangen und ihre direkte Wirkung zu analysieren.

Einleitung

Osteoarthritis (OA) ist eine artikuläre degenerative Erkrankung, die eine fortschreitende und irreversible Entzündung und Zerstörung der extrazellulären Matrix des Gelenkknorpels^{impliziert 1}. Obwohl verschiedene Formen der Arthritis zahlreiche Behandlungen^{haben 2,3,4}, sind diese durch ihre Nebenwirkungen und begrenzte Wirksamkeit eingeschränkt. Tissue-Engineering-Techniken unter Verwendung der autologen Chondrozytenimplantation werden routinemäßig zur regenerativen Behandlung von verletztem Knorpel bei frühen OA-Knorpelläsionen angewendet⁴. Zellbasierte Therapien sind vor allem aufgrund der begrenzten Anzahl von phänotypisch stabilen Chondrozyten oder Chondroprogenitoren eingeschränkt, die in der Lage sind, den Knorpel effektiv zu reparieren³. Daher ist die Entwicklung neuer therapeutischer Strategien zur Verhinderung des Fortschreitens der Krankheit und zur Regeneration großer Knorpelläsionen von größter Bedeutung.

Extrazelluläre Vesikel (EVs) wurden von verschiedenen Autoren als Behandlung für OA vorgeschlagen^5,6. EVs sind membranöse Körper, die von der Mehrheit der Zelltypen sezerniert werden, an der interzellulären Signalgebung beteiligt sind und nachweislich die therapeutische Wirkung von Stammzellen ausüben^7,8,9, wodurch sie kürzlich Interesse an der regenerativen Medizin geweckt haben¹⁰. EVs, die von mesenchymalen Stromazellen (MSCs) abgeleitet sind, sind die wichtigsten therapeutischen EVs, die für OA untersucht wurden, obwohl andere gelenkbezogene Zellen als EV-Quellen verwendet wurden, z. B. Chondroprogenitoren oder Immunzellen^11,12.

Thrombozytenkonzentrate, wie Thrombozytenlysate (PLs), werden verwendet, um die Wundheilung bei verschiedenen Verletzungen, wie Hornhautgeschwüren^{13 , 14,15} oder bei der Sehnengewebsregeneration¹⁶zu verbessern , aufgrund der Hypothese, dass die EV-Komponente von Thrombozytenkonzentraten für diese Effekte verantwortlich sein kann¹⁷ . Einige Studien im Zusammenhang mit Gelenkerkrankungen verwenden thrombozytenbasierte EVs (PL-EVs) zur Behandlung, um osteoarthritische Zustände zu verbessern. PL-EVs verbessern die Chondrozytenproliferation und Zellmigration, indem sie den Wnt/β-Catenin-Signalweg¹⁸aktivieren, die Expression chondogener Marker in osteoarthritischen Chondrozyten^{fördern 19}oder höhere Konzentrationen chondogener Proteine und weniger tissuläre Anomalien bei osteoarthritischen Kaninchen zeigen, die mit PL-EVs behandelt wurden¹⁸.

EVs enthalten Proteine, Lipide und Nukleinsäuren, die an die Zielzelle abgegeben werden, wodurch eine Zell-zu-Zell-Kommunikation hergestellt wird, die das Hauptmerkmal im Zusammenhang mit ihren therapeutischen Anwendungen ist²⁰. Die Auswirkungen von Elektrofahrzeugen hängen von ihren erreichenden Zellen und der anschließenden Freisetzung von Fracht ab. Dieser Effekt kann indirekt durch Veränderungen in Zellen bestätigt werden, wie z.B. Stoffwechselaktivität oder Genexpressionsmodifikation. Diese Methoden erlauben jedoch nicht die Visualisierung, wie EVs Zellen erreichen, um ihre Funktion auszuüben. Daher stellt dieses Papier eine Methode zur Kennzeichnung dieser PL-abgeleiteten EVs vor, die zur Behandlung von entzündungsbedingten OA-Knorpel-Explantaten eingesetzt werden sollen. Die konfokale Mikroskopie wurde verwendet, um die EV-Aufnahme und das Fortschreiten zu den in den Explantaten vorhandenen Chondrozyten in einem Zeitraffer von 5 h zu überwachen.

Protokoll

HINWEIS: Knorpelexplantaten wurden von der IdISBa Biobank (IB 1995/12 BIO) in Übereinstimmung mit institutionellen Richtlinien nach ethischer Genehmigung des Projekts durch die CEI-IB (IB 3656118 PI) bezogen.

1. Säulenvorbereitung

1. Setzen Sie die Spalten gemäß den Anweisungen des Herstellers oder wie folgt aus:
   1. Entfernen Sie die Spaltenkappe, und gleichen Sie die Spalte aus. Entfernen Sie den Speicherpuffer durch Elution.
   2. Waschen Sie die Säule 3 mal mit 2,5 ml phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS). Warten Sie bei jeder Wäsche, bis die Säule das gesamte Volumen absorbiert hat.
      HINWEIS: Lassen Sie die Säule nicht trocknen.
   3. Decken Sie die Säule nach der letzten Wäsche und bis zur Probenvorbereitung mit der Kappe ab.

2. EV-Kennzeichnung

HINWEIS: Dieses EV-Kennzeichnungsprotokoll verwendet eine PL-EV-Probe, die zuvor durch Größenausschlusschromatographie (SEC) mit den zuvor beschriebenen^{Bedingungen 21,22}isoliert wurde. Jede EV-Probe aus einer beliebigen Quelle kann jedoch mit diesem Protokoll verwendet werden.

1. Konzentrieren Sie die EV-Probe und die Steuerung (PBS) mit einem konzentrierenden Röhrchen.
   1. Legen Sie die Proben in ein 15 mL oder 500 μL konzentrierendes Röhrchen, abhängig vom Startvolumen der EV-Probe. Zentrifugieren Sie die Röhrchen gemäß den Anweisungen des Herstellers, bis eine fast trockene Probe erhalten ist.
      HINWEIS: Die Kontrollprobe ist notwendig, um nach Farbstoffhintergrund zu suchen. Obwohl diese Methode kein spezifisches Anfangsvolumen erfordert, sollte berücksichtigt werden, dass während der Reinigungsschritte etwa 10% der Partikel verloren gehen.
2. Resuspendieren Sie die konzentrierten Proben mit Verdünnungsmittel C. Resuspend EV Proben mit 200 μL und die Kontrollgruppe mit 100 μL und übertragen Sie sie auf neue 1,5 ml Zentrifugenröhrchen.
3. Trennen Sie die EV-Probe in zwei Aliquots von 100 μL. Markieren Sie eine mit Farbstoff und verwenden Sie sie als Behandlung (PKH-PL-EV); Lassen Sie die andere unmarkiert, aber verarbeiten Sie sie (NTA-PL-EV) wie die EV-Probe und verwenden Sie sie, um die EV-Konzentration durch NTA zu quantifizieren.
4. 2x Farbstofflösung herstellen, was zu 8 μM PKH26 Lösung in Verdünnungsmittel C führt.
5. Mischen Sie 1 μL 1 mM PKH26 Linker pro 125 μL Verdünnungsmittel C in der Probe. Bereiten Sie ein Volumen vor, das erforderlich ist, um die Proben im Verhältnis 1: 1 hinzuzufügen.
6. Fügen Sie PKH-PL-EV 2x Farbstofflösung hinzu und kontrollieren Sie Proben im Verhältnis 1: 1, um eine 1x Farbstoffkonzentration und eine 4 μM PKH26-Konzentration zu erreichen. Fügen Sie der NTA-PL-EV-Probe das gleiche PBS-Volumen hinzu. 5 min bei Raumtemperatur inkubieren.
7. Geben Sie 5% ige Rinderserumalbumin-PBS-Lösung im Verhältnis 1: 1 zu den Proben und stellen Sie sicher, dass das Endvolumen ~ 400 μL beträgt.
   HINWEIS: Dieser Schritt ermöglicht die Entfernung von unspezifischen Farbstoffwechselwirkungen oder ungebundenen Farbstoffen.
8. Trennen Sie die markierten EVs vom ungebundenen Farbstoff und den unspezifischen Wechselwirkungen des Farbstoffs mit der Säule.

3. Gekennzeichnete EV-Isolierung

1. Entfernen Sie die Kappe aus der Säule, fügen Sie 400 μL der Probe hinzu (PKH-PL-EV, NTA-PL-EV oder Kontrolle) und verwerfen Sie die gesamte eluierte Flüssigkeit.
2. Warten Sie, bis das Beispiel vollständig in die Spalte gelangt ist, bevor Sie mit dem nächsten Schritt fortfahren. Fügen Sie 600 μL PBS hinzu und verwerfen Sie die gesamte eluierte Flüssigkeit.
3. Warten Sie, bis der PBS die Spalte vollständig aufgerufen hat, bevor Sie mit dem nächsten Schritt fortfahren. Fügen Sie 600 μL PBS hinzu und sammeln Sie einen Bruchteil von 600 μL in einem 1,5. ml Zentrifugenröhrchen (EVs oder Steuerung).
   HINWEIS: Diese Schritte sind erforderlich, um den überschüssigen Farbstoff aus den Proben zu entfernen. Eine weitere Trennung nach Säulen ist erforderlich, um reinere EVs zu erhalten. Daher sollten die folgenden Schritte in einer neuen äquilibrierten Spalte (Schritt 4.1.) oder derselben Spalte nach einem ersten Waschschritt (Schritt 4.2) durchgeführt werden.
4. Bereiten Sie die Säule für einen neuen EV-Trennschritt vor, um reinere EVs zu erhalten. Wenn es sich um eine neue Spalte handelt, wiederholen Sie die Schritte 2.1. und 2.2. Wenn es sich um dieselbe Säule handelt, waschen Sie die Säule mit 2,5 ml 20% Isopropanol und wiederholen Sie dann die Schritte 2.1 und 2.2.
5. Fügen Sie 600 μL der zuvor eluierten EVs, die in Schritt 2.5 erhalten wurden, in die Spalte und verwerfen Sie das eluierte Volumen. Warten Sie, bis die Flüssigkeit vollständig in die Säule gelangt ist, bevor Sie mit dem nächsten Schritt fortfahren.
6. Fügen Sie 400 μL PBS hinzu und verwerfen Sie das gesamte eluierte Volumen. Warten Sie, bis die Flüssigkeit vollständig in die Säule gelangt ist, bevor Sie mit dem nächsten Schritt fortfahren.
7. Fügen Sie 600 μL PBS hinzu und sammeln Sie einen Bruchteil von 600 μL in einem 1,5 ml Zentrifugenröhrchen. Verwenden Sie die EVs und Kontrollproben für weitere Analysen oder lagern Sie sie über Nacht bei 4 oC.
8. Speichern Sie die verwendeten Spalten für die zukünftige Verwendung.
   1. Waschen Sie die Säule mit 25 ml 20% Isopropanol und verwerfen Sie das eluierte Volumen. Waschen Sie die Säule 3 mal mit 2,5 ml PBS.
   2. Fügen Sie den in Schritt 1.1.1 entfernten Speicherpuffer hinzu, und warten Sie, bis der Puffer in die Spalte gelangt ist. Decken Sie die Säule mit der Kappe ab und lagern Sie sie bis zum späteren Gebrauch bei 4 oC.

4. EV-Quantifizierung

1. Bereiten Sie 1:1.000 Verdünnungen der NTA-PL-EV-Probe und der anfänglichen PL-EV-Probe vor, wie in den folgenden zwei Schritten beschrieben.
   1. Bereiten Sie 1 ml 1:10 verdünntes NTA-PL-EV und 1 ml 1:10 verdünntes anfängliches PL-EV mit PBS vor, das durch einen 0,2 μm-Filter filtriert wird.
   2. Bereiten Sie 1 ml einer 1:100-Verdünnung der zuvor verdünnten Proben mit PBS vor, das durch einen 0,2 μm-Filter filtriert wird.
2. Injizieren Sie die 1:1.000 verdünnte NTA-PL-EV-Probe oder die anfängliche PL-EV-Probe mit einer sterilen Spritze in die NTA-Pumpe. Befolgen Sie die Anweisungen und Empfehlungen des Herstellers zur Bestimmung der Partikelkonzentration und der Größenverteilung.
   HINWEIS: Da die EV-Konzentration vom Probenstartervolumen abhängt, kann es erforderlich sein, Zwischenverdünnungen abzulesen und Anpassungen vorzunehmen, um eine korrekte NTA-Bestimmung zu erhalten.

5. EVs zur Behandlung von entzündungsbedingter OA

1. Waschen Sie den Knorpel zweimal mit PBS und schneiden Sie ihn mit einem Biopsiestempel mit einem Durchmesser von 3 mm unter sterilen Bedingungen aus.
   HINWEIS: Führen Sie das Verfahren aus den Schritten 5.1 bis 5.6 in einer Zellkulturhaube aus.
2. Legen Sie die Explantate in 96-Well-Kulturplatten mit DMEM-F12-Medium, ergänzt mit 1% Penicillin-Streptomycin bei 37 oC, 5%_CO2und 80% Luftfeuchtigkeit.
   1. Um ein entzündungsgetriebenes OA-Modell zu etablieren, ergänzen Sie das Zellkulturmedium mit 10 ng/ml Oncostatin M und 2 ng/ml Tumornekrosefaktor-alpha (TNFα).
3. Behandeln Sie die Explantate mit 1 × 10⁹ Partikeln/Well von markierten EVs (PKH-PL-EV) oder kontrollieren Sie sie in einem Zellkulturmedium, das mit Oncostatin M und TNFα ergänzt wird.
   ANMERKUNG: Messen Sie das Volumen der Probe, die 1 × 10^{9 Partikel/Vertiefung} enthält, und verwenden Sie das gleiche Volumen für die Kontrolle.
4. Entfernen Sie das Medium von den 96-Well-Zellkulturplatten, die Knorpel-Explantate enthalten. Zu jeder Vertiefung werden 200 μL des in Schritt 5.3 beschriebenen Zellkulturmediums gegeben.
   HINWEIS: Wenn die 96-Well-Platten mit fetalem Rinderserum (FBS) in Kontakt gekommen sind, waschen Sie jede Vertiefung dreimal mit 200 μL PBS, um EVs aus dem FBS zu entfernen.
5. Stoppen Sie den In-vitro-Test zu verschiedenen Zeiten: 0, 1, 2, 3, 4 und 5 h.
6. Waschen Sie die Zellkulturtöpfe, die die Knorpelexplantate enthalten, zweimal mit 200 μL PBS.
7. Geben Sie 100 μL 4% Paraformaldehyd (PFA) in das Gewebe, um es für 3 h bei 4 oC zu fixieren.
   HINWEIS: Schritte mit PFA sollten in einem Abzug gemäß den Empfehlungen des Sicherheitsdatenblatts durchgeführt werden.
8. Entfernen Sie die PFA, geben Sie 100 μL PBS hinzu, lagern Sie das fixierte Gewebe bei 4 °C und verarbeiten Sie die Proben innerhalb von 48 h.

6. Vorbereitung und Visualisierung der Mikroskopie

HINWEIS: Dieses histologische Verfahren besteht aus Dehydratisierung, Paraffineinbettung und Rehydratationsschritten. Diese Schritte können die Gesamtfluoreszenz des Farbstoffs reduzieren (eine Einschränkung, die im Datenblatt für PKH26 erwähnt wird). Daher können andere Verfahren, wie z. B. gefrorene Schnitte, für die EV-Visualisierung durch konfokale Mikroskopie besser geeignet sein.

1. Betten Sie die fixierten Gewebe in Paraffinblöcke ein. Schneiden Sie das Gewebe in 6 μm dicke Abschnitte.
2. Entparaffinisieren Sie die Gewebeschnitte.
   HINWEIS: Alle Schritte mit Xylol sollten in einem Abzug durchgeführt werden.
   1. Tauchen Sie die Gewebeschnitte für 30 min in Xylol, 2 min in 100% Ethanol, 2 min in 96% Ethanol, 1 min in 75% Ethanol und schließlich 30 s in destilliertes Wasser.
3. Permeabilisieren Sie die Gewebeschnitte.
   1. Bereiten Sie eine 0,1% ige Triton-0,1% Natriumcitratlösung vor, um das Gewebe zu permeabilisieren. Geben Sie einen 20 μL Tropfen zu jedem Gewebeabschnitt und inkubieren Sie für 10 min bei Raumtemperatur. Waschen Sie jeden Abschnitt zweimal mit 20 μL PBS.
4. Auf einem mikroskopisch kleinen Objektträger wird ein Tropfen Montagemedium mit 4′,6-Diamidino-2-phenylindol (DAPI) mit einem wässrigen Montagemedium zur Erhaltung der Fluoreszenz gegeben. Bedecken Sie das Objektträger mit 3 Gewebeschnitten aus Schritt 6.3.1.
5. Inkubieren Sie die Dias über Nacht bei Raumtemperatur, geschützt vor Licht.
6. Bis zur konfokalen Mikroskopie lichtgeschützt bei 4 °C lagern.

Ergebnisse

Eine schematische Übersicht für die EV-Kennzeichnung und die Überwachung der Aufnahme ist in Abbildung 1 dargestellt. Die von NTA in Tabelle 1 detektierte Partikelkonzentration und EV-Größe zeigen, dass die EV-Konzentration während des Prozesses aufgrund des nach der Markierung mit der Säule zweimal durchgeführten Reinigungsschritts abnimmt. Die erhaltene Menge liegt jedoch im optimalen Bereich der Anzahl der für die Behandlung zu verwendenden Partikel. Diese Partik...

Diskussion

DIE EV-Bildgebung hilft, ev-Eigenschaften zu verstehen, wie z.B. ihre Freisetzungs- und Aufnahmemechanismen. Ihre Bildgebung ermöglicht die Überwachung ihrer Bioverteilung und die Charakterisierung ihrer pharmakokinetischen Eigenschaften als Wirkstoffvehikel. Die Bildgebung und Verfolgung von Elektrofahrzeugen kann jedoch aufgrund ihrer geringen Größe schwierig sein, obwohl viele bildgebende Geräte und Markierungstechniken entwickelt wurden, um Forschern bei der Überwachung von Elektrofahrzeugen unter In-vitro-...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
Material
1.5 mL Centrifuge tube	SPL life sciences	PLC60015
1 mL Syringe BD Plastipak	BD	303174
2-Propanol (Isopropanol)	Panreac AppliChem	1.310.901.211	Prepared at 20% with Milli-Q water
96-well culture plate	SPL life sciences	PLC30096
Absolute ethanol Pharmpur	Scharlab	ET0006005P	Used to prepare 96% and 75% ethanol with Milli-Q water
Biopsy Punch with plunger 3 mm	Scandidact	MTP-33-32
Bovine serum Albumin (BSA)	Sigma-Aldrich	A7030	Prepared at 5% with PBS
Cartilage explants	IdISBa Biobank
Concentrating tube 15 mL Nanosep 100 kD Omega	Pall	MCP100C41
Concentrating tube 500 µL Nanosep 100 kD Omega	Pall	OD003C33
Cover glass 24 x 60 mm	Deltalab	D102460
DMEM-F12 -GlutaMAX medium	Biowest	L0092
Dulbecco's PBS (1x)	Capricorn Scientific	PBS-1A
Embedded paraffin tissue blocks	IdISBa Biobank		Fee for service
Exo-spin mini-HD columns	Cell guidance systems	EX05
Feather S35 Microtome Blade	Feather	43037
Filtropur S 0.2 µm syringe filter	Sarstedt	83.1826.001
Fluoroshield with DAPI	Sigma-Aldrich	F-6057
Oncostatin M Human	Sigma-Aldrich	O9635-10UG	Prepare a stock solution to a final concentration of 0.1 µg/µL diluten in PBS-0.1% BSA
Paraformaldehyde	Sigma-Aldrich	8.18715.1000	Prepared at 4% with PBS and stored at 4 °C
Penicillin-Streptomycin Solution 100x	Biowest	L0022
PKH26 Red Fluorescent Cell Linker Kit for General Cell Membrane Labeling	Sigma-Aldrich	MINI26	PKH26 and Dliuent C included
Sodium citrate dihydrate	Scharlab	SO019911000
Superfrost Plus Microscope Slides	Thermo Scientific	J1800AMNZ
TNFα	R&D systems	210-TA-005	Prepare a stock solution to a final concentration of 0.01 µg/µL diluted in PBS-0.1% BSA
Triton X-100	Sigma-Aldrich	T8787	Used to prepare a 0.1% Triton-0.1% sodium citrate solution with Milli-Q water
Xylene	Scharlab	XI0050005P
Equipment
Centrifuge 5430 R	Eppendorf	5428000210	F-45-48-11 rotor
NanoSight NS300	Malvern	NS300	Device with embedded laser at λ= 532 nm and camera sCMOS
Shandon Finesse 325 Manual Microtome	Thermo Scientific™	A78100101
TCS-SPE confocal microscope	Leica Microsystems	5200000271