תיוג של שלל חוץ-תאי לניטור הגירה וספיגה של סחוס

Summary

כאן, אנו מציגים פרוטוקול לסימון שלטי דם חוץ-תאיים שמקורם בטסיות דם כדי לפקח על נדידתם וקליטתם בגזירי סחוס המשמשים כמודל לדלקת מפרקים ניוונית.

Abstract

שלל חוץ-תאי (EVs) משמשים במחקרים שונים כדי להוכיח את הפוטנציאל שלהם כטיפול ללא תאים בשל המטען שלהם נגזר מהמקור הסלולרי שלהם, כגון טסיות דם ליסאט (PL). כאשר נעשה שימוש כטיפול, EVs צפויים להיכנס לתאי היעד ולחולל תגובה מאלה. במחקר זה, EVs שמקורו PL נחקרו כטיפול ללא תאים עבור דלקת מפרקים ניוונית (OA). לכן, נקבעה שיטה לסימון רכבים דרכים אלקטרוניים ולבחון את ספיגתם על מגרשי סחוס. כלי עבודה חשמליים שמקורם ב-PL מסומנים בצבע ליפופילי PKH26, נשטפים פעמיים דרך עמוד, ולאחר מכן נבדקים במודל OA מונע דלקת במבחנה למשך 5 שעות לאחר כימות חלקיקים על ידי ניתוח מעקב אחר חלקיקים (NTA). לפי שעה, explants סחוס קבועים, paraffined, לחתוך 6 מקטעים מיקרומטר לעלות על שקופיות, ונצפו תחת מיקרוסקופ קונפוקלי. הדבר מאפשר אימות אם EVs להזין את תאי היעד (chondrocytes) במהלך תקופה זו ולנתח את ההשפעה הישירה שלהם.

Introduction

דלקת מפרקים ניוונית (OA) היא מחלה ניוונית מפרקית המרמזת על דלקת מתקדמת ובלתי הפיכה והרס של המטריצה החוץ תאית של הסחוס המפרקי¹. למרות צורות שונות של דלקת פרקים יש טיפולים רבים^2,3,4, אלה מוגבלים על ידי תופעות הלוואי שלהם ויעילות מוגבלת. טכניקות הנדסת רקמות באמצעות השתלת כונדרוציטים אוטולוגית מיושמות באופן שגרתי לטיפול רגנרטיבי של סחוס פצוע בפצעים סחוס מוקדם OA⁴. טיפולים מבוססי תאים מוגבלים בעיקר בשל המספר המוגבל של כונדרוציטים יציבים פנוטיפיקית או chondroprogenitors המסוגלים לתקן ביעילות את הסחוס³. לכן, פיתוח אסטרטגיות טיפוליות חדשות למניעת התקדמות המחלה וחידוש נגעים סחוס גדולים הוא בעל חשיבות עליונה.

שלל חוץ תאי (EVs) הוצעו כטיפול OA על ידי מחברים שונים^5,6. רכבים יפים הם גופים membranous המופרשים על ידי רוב סוגי התאים, מעורבים איתות בין תאי, הוכחו להפעיל את ההשפעות הטיפוליות של תאי גזע^7,8,9, שבגללם הם עוררו לאחרונה עניין ברפואה רגנרטיבית¹⁰. EVs נגזר תאים סטרומיים mesenchymal (MSCs) הם EVs הטיפולי העיקרי נחקר עבור OA, אם כי תאים אחרים הקשורים למפרקים שימשו כמקורות EV, למשל, chondroprogenitors או תאים חיסוניים^11,12.

תרכיזי טסיות דם, כגון טסיות דם (PLs), משמשים כדי לשפר את ריפוי הפצע בפציעות שונות, כגון כיבים קרנית^13,14,15 או התחדשות רקמת^{גיד 16}, בגלל ההשערה כי רכיב EV של תרכיזי טסיות דם עשוי להיות אחראי על תופעות אלה¹⁷ . מחקרים מסוימים הקשורים למחלות הקשורות למפרקים משתמשים בטסיות דם אלקטרוניות (PL-EVs) כטיפול כדי לשפר מצבים אוסטיאוארטיטיקה. PL-EVs לשפר את התפשטות chondrocyte ונדידת תאים על ידי הפעלת Wnt / β-catenin מסלול¹⁸, קידום הביטוי של סמנים chondrogenic בכונדרוציטים osteoarthritic¹⁹, או מראה רמות גבוהות יותר של חלבונים כונדרוגניים ופחות חריגות tissular בארנבות osteoarthritic שטופלו PL-EVs¹⁸.

רכבים אופניים מכילים חלבונים, שומנים וחומצות גרעין המשוחררים לתא היעד, ומבססים תקשורת בין תאים, שהיא התכונה העיקרית הקשורה ליישומים הטיפוליים שלהם²⁰. ההשפעות של רכבים הפעלה אלקטרוניים תלויות בתאים המגיעים אליהם ובשחרור המטען הבא. השפעה זו יכולה להיות מאושרת בעקיפין על ידי שינויים הנגרמים בתאים, כגון פעילות מטבולית או שינוי ביטוי גנים. עם זאת, שיטות אלה אינן מאפשרות הדמיה של האופן שבו EVs להגיע לתאים כדי להפעיל את הפונקציה שלהם. לכן, מאמר זה מציג שיטה לתייג את אלה PL נגזר רכבים רחפנים לשמש כטיפול עבור דלקת מונע סחוס explants. מיקרוסקופיה קונפוקלית שימשה לניטור ספיגת EV והתקדמות chondrocytes הנוכחי explants ב- time-lapse של 5 שעות.

Protocol

הערה: מגרשי סחוס התקבלו מהביובנק IdISBa (IB 1995/12 BIO) בהתאם להנחיות המוסדיות לאחר אישור אתי של הפרויקט על ידי ה- CEI-IB (IB 3656118 PI).

1. הכנת טורים

1. עקוב אחר עמודות שיווי משקל בהתאם להוראות היצרן או באופן הבא:
   1. הסר את מכסה העמודה ושיילו את העמודה. הסר את מאגר האחסון על ידי אלגנטיות.
   2. לשטוף את העמודה 3 פעמים עם 2.5 מ"ל של תמיסת מלח חוצץ פוספט (PBS). במהלך כל שטיפה, המתן עד שהעמודה תספוג את כל עוצמת הקול.
      הערה: אל תיתן לעמודה להתייבש.
   3. מכסים את העמודה עם המכסה לאחר הכביסה האחרונה ועד הכנת המדגם.

2. תיוג EV

הערה: פרוטוקול תיוג EV זה משתמש במדגם PL-EV שבודד בעבר על-ידי כרומטוגרפיה של אי-הכללת גודל (SEC) עם תנאים שתוארו בעבר^21,22. עם זאת, כל דגימת EV ממקור כלשהו עשויה לשמש עם פרוטוקול זה.

1. מרכז את דגימת EV ואת השליטה (PBS) באמצעות צינור ריכוז.
   1. מקם את הדגימות בצינור ריכוז 15 מ"ל או 500 μL, בהתאם לנפח ההתחלתי של דגימת EV החל. צנטריפוגות הצינורות על פי הוראות היצרן עד לקבלת דגימה כמעט יבשה.
      הערה: דגימת הבקרה נחוצה כדי לבדוק אם יש רקע צבע. למרות שיטה זו אינה דורשת כל נפח ראשוני ספציפי, יש לקחת בחשבון כי סביב 10% של חלקיקים יאבדו במהלך שלבי טיהור.
2. Resuspend הדגימות המרוכזות עם דגימות EV דילול C. Resuspend עם 200 μL וקבוצת הביקורת עם 100 μL ולהעביר אותם צינורות צנטריפוגות 1.5 מ"ל חדשים.
3. להפריד את דגימת EV לשני aliquots של 100 μL. לסמן אחד עם צבע ולהשתמש בו כטיפול (PKH-PL-EV); להשאיר את השני לא מסומן אבל לעבד אותו (NTA-PL-EV) כמו מדגם EV ולהשתמש בו כדי לכמת את ריכוז EV על ידי NTA.
4. הכן פתרון 2x צבע, וכתוצאה מכך 8 מיקרומטר PKH26 פתרון ב- C דילול.
5. לערבב 1 μL של 1 mM PKH26 מקשר לכל 125 μL של דילול C במדגם. הכן אמצעי אחסון הדרוש להוספה לדגימות ביחס של 1:1.
6. הוסיפו תמיסת צבע 2x לדגימות PKH-PL-EV ובקרה ביחס של 1:1 כדי להשיג ריכוז צבע 1x וריכוז PKH26 של 4 מיקרומטר. הוסף את אותו נפח של PBS לדגימת NTA-PL-EV. דגירה במשך 5 דקות בטמפרטורת החדר.
7. הוסף 5% סרום בקר אלבומין-PBS פתרון הדגימות ביחס 1:1 ולהבטיח כי עוצמת הקול הסופי הוא ~ 400 μL.
   הערה: שלב זה מאפשר הסרה של אינטראקציות צבע לא-מיניות או צבע לא מאוגד.
8. המשך להפריד את ה- EVs המסומנים מהצבע הלא מאוגד והאינטראקציות הלא-מדעיות של הצבע עם העמודה.

3. בידוד EV מתויג

1. הסר את המכסה מהעמודה, הוסף 400 μL של המדגם (PKH-PL-EV, NTA-PL-EV, או בקרה), ולהשליך את כל הנוזל eluted.
2. המתן עד שהדוגמה תוזן בעמודה לחלוטין לפני שתמשיך לשלב הבא. מוסיפים 600 μL של PBS ומשליכים את כל הנוזלים הנבהים.
3. המתן עד שה- PBS יכניס את העמודה במלואה לפני שתמשיך לשלב הבא. הוסף 600 μL של PBS ולאסוף שבריר של 600 μL ב 1.5. mL צינור צנטריפוגה (EVs או שליטה).
   הערה: שלבים אלה נדרשים כדי להסיר את הצבע העודף מהדגימות. הפרדה נוספת לפי עמודה נדרשת כדי להשיג EVs טהור יותר. לפיכך, השלבים הבאים צריכים להתבצע בעמודה חדשה שישוות (שלב 4.1)או באותה עמודה לאחר שלב כביסה ראשוני (שלב 4.2).
4. הכן את העמודה לשלב הפרדת EV חדש כדי להשיג EVs טהור יותר. אם זוהי עמודה חדשה, חזור על שלבים 2.1. ו-2.2. אם זה אותו עמודה, לשטוף את העמודה עם 2.5 מ"ל של 20% איזופרופנול ולאחר מכן לחזור על שלבים 2.1 ו 2.2.
5. הוסף 600 μL של EVs eluted בעבר שהושגו בשלב 2.5 לעמודה ולבטל את אמצעי האחסון הנבהר. המתן עד שהנוזל יכניס את העמודה במלואה לפני שתמשיך לשלב הבא.
6. הוסף 400 μL של PBS והשלך את כל אמצעי האחסון הנבה. המתן עד שהנוזל יכניס את העמודה במלואה לפני שתמשיך לשלב הבא.
7. הוסף 600 μL של PBS ולאסוף שבריר של 600 μL בצינור צנטריפוגה 1.5 מ"ל. השתמש בדגימות EVs ובקרה עבור ניתוחים נוספים או לאחסן אותם לילה ב 4 oC.
8. אחסן את העמודות הנמצאות בשימוש עתידי.
   1. לשטוף את העמודה עם 25 מ"ל של 20% איזופרופנול ולהשליך את הנפח eluted. לשטוף את העמודה 3 פעמים עם 2.5 מ"ל של PBS.
   2. הוסף את מאגר האחסון שהוסר בשלב 1.1.1 והמתן לכניסה של המאגר לעמודה. מכסים את העמודה במכסה ומאחסנים ב- 4 oC עד לשימוש הבא.

4. כימות EV

1. הכן 1:1,000 דילול של מדגם NTA-PL-EV ואת מדגם PL-EV הראשוני כמתואר על ידי שני השלבים הבאים.
   1. הכן 1 מ"ל של 1:10 מדולל NTA-PL-EV ו 1 מ"ל של 1:10 PL-EV ראשוני מדולל עם PBS מסונן באמצעות מסנן 0.2 מיקרומטר.
   2. הכן 1 מ"ל של דילול של 1:100 של הדגימות המדוללות הקודמות עם PBS מסונן באמצעות מסנן 0.2 מיקרומטר.
2. הזריקו את דגימת NTA-PL-EV המדוללת 1:1,000 או את דגימת PL-EV הראשונית באמצעות מזרק סטרילי למשאבת NTA. בצע את ההוראות וההמלצות של היצרן לריכוז חלקיקים וקביעת התפלגות גודל.
   הערה: כמו ריכוז EV תלוי בנפח המתנע מדגם, ייתכן שיהיה צורך לקרוא דילול ביניים ולבצע התאמות כדי לקבל קביעת NTA נכונה.

5. EVs המשמש כטיפול עבור דלקת מונעת OA

1. לשטוף את הסחוס פעמיים עם PBS excise אותו באמצעות אגרוף ביופסיה בקוטר 3 מ"מ בתנאים סטריליים.
   הערה: בצע את ההליך מצעדים 5.1 עד 5.6 במכסה המנוע של תרבית התא.
2. מניחים את explants בצלחות תרבות 96-טוב עם בינוני DMEM-F12 בתוספת 1% פניצילין-סטרפטומיצין ב 37 oC, 5% CO₂, ו 80% לחות.
   1. כדי להקים מודל OA מונע דלקת, להשלים את המדיום תרבית התא עם 10 ננוגרם / מ"ל oncostatin M ו 2 ng/ mL גידול נמק גורם-אלפא (TNFα).
3. לטפל explants עם 1 × 10⁹ חלקיקים / גם של EVs מסומן (PKH-PL-EV) או שליטה במדיום תרבית התא בתוספת oncostatin M ו- TNFα.
   הערה: למדוד את עוצמת הקול של המדגם המכיל 1 × 10⁹ חלקיקים / טוב ולהשתמש באותו אמצעי אחסון עבור הפקד.
4. מוציאים את המדיום מלוחות תרבית התאים 96-well המכילים explants סחוס. הוסף 200 μL של המדיום תרבית התא המתואר בשלב 5.3 לכל באר.
   הערה: אם הצלחות 96-באר היו במגע עם סרום בקר עוברי (FBS), לשטוף כל באר שלוש פעמים עם 200 μL של PBS כדי להסיר כל EVs מן FBS.
5. עצור את ההחמרה בזמנים שונים: 0, 1, 2, 3, 4 ו 5 שעות.
6. לשטוף את בארות תרבית התא המכיל את explants הסחוס פעמיים עם 200 μL של PBS.
7. הוסף 100 μL של 4% paraformaldehyde (PFA) לרקמה כדי לתקן את זה עבור 3 שעות ב 4 oC.
   הערה: שלבים הקשורים PFA צריך להתבצע במכסה המנוע אדים בעקבות המלצות גיליון נתוני בטיחות.
8. הסר PFA, להוסיף 100 μL של PBS, לאחסן את הרקמה הקבועה ב 4 °C (50 °F) ולעבד את הדגימות בתוך 48 שעות.

6. הכנה ודמיון מיקרוסקופי

הערה: הליך היסתולוגי זה מורכב התייבשות, הטמעת פרפין, וצעדי התייבשות. שלבים אלה עשויים להפחית את פלואורסצנטיות הצבע הכוללת (מגבלה המוזכרת בגליון הנתונים עבור PKH26). לכן, הליכים אחרים, כגון חתך קפוא, עשויים להתאים יותר להדמיה של EV על ידי מיקרוסקופיה קונפוקלית.

1. הטמע את הרקמות הקבועות בבלוקים פרפין. חותכים את הרקמה ל-6 חלקים בעובי 6 מיקרומטר.
2. דפראפפיניט את מקטעי הרקמה.
   הערה: כל השלבים באמצעות קסילן צריכים להתבצע במכסה אדים.
   1. לטבול את מקטעי הרקמה קסילן במשך 30 דקות, 100% אתנול במשך 2 דקות, 96% אתנול במשך 2 דקות, 75% אתנול במשך 1 דקות, ולבסוף במים מזוקקים במשך 30 s.
3. תחדירו את חלקי הרקמות.
   1. הכן 0.1% תמיסה נתרן ציטוט 0.1% כדי permeabilize הרקמה. מוסיפים טיפה של 20 μL לכל קטע רקמות ודגר במשך 10 דקות בטמפרטורת החדר. לשטוף כל סעיף פעמיים עם 20 μL של PBS.
4. בשקופית מיקרוסקופית, הוסף טיפה של מדיום הרכבה המכיל 4′,6-דיאמידינו-2-פנילינדול (DAPI) עם מדיום הרכבה מימי לשימור פלואורסצנטיות. לכסות את השקופית המכילה 3 מקטעי רקמה מהשלב 6.3.1.
5. לדגור על השקופיות בלילה בטמפרטורת החדר, מוגן מפני אור.
6. יש לאחסן ב-4 °C (75°F), מוגן מפני אור עד למיקרוסקופיה קונפוקלית.

תוצאות

סקירה סכמטית לניטור תיוג וספיגה של EV מוצגת באיור 1. ריכוז החלקיקים וגודל EV שזוהו על ידי NTA בטבלה 1 מראים כי ריכוז EV פוחת במהלך התהליך עקב שלב הטיהור המבוצע פעמיים לאחר תיוג עם העמודה. עם זאת, הסכום המתקבל הוא בטווח האופטימלי של מספר החלקיקים לשימוש לטיפול. ריכוז חלקי?...

Discussion

הדמיית EV מסייעת להבין תכונות EV, כגון מנגנוני השחרור והספיגה שלהם. ההדמיה שלהם מאפשרת ניטור של ההבחנה הביולוגית שלהם ואת אפיון המאפיינים הפרמקוקינטיים שלהם ככלי רכב תרופתיים. עם זאת, דימות EV ומעקב עשוי להיות קשה בשל הגדלים הקטנים שלהם, אם כי מכשירי הדמיה רבים וטכניקות תיוג פותחו כדי לעזור ל...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Material
1.5 mL Centrifuge tube	SPL life sciences	PLC60015
1 mL Syringe BD Plastipak	BD	303174
2-Propanol (Isopropanol)	Panreac AppliChem	1.310.901.211	Prepared at 20% with Milli-Q water
96-well culture plate	SPL life sciences	PLC30096
Absolute ethanol Pharmpur	Scharlab	ET0006005P	Used to prepare 96% and 75% ethanol with Milli-Q water
Biopsy Punch with plunger 3 mm	Scandidact	MTP-33-32
Bovine serum Albumin (BSA)	Sigma-Aldrich	A7030	Prepared at 5% with PBS
Cartilage explants	IdISBa Biobank
Concentrating tube 15 mL Nanosep 100 kD Omega	Pall	MCP100C41
Concentrating tube 500 µL Nanosep 100 kD Omega	Pall	OD003C33
Cover glass 24 x 60 mm	Deltalab	D102460
DMEM-F12 -GlutaMAX medium	Biowest	L0092
Dulbecco's PBS (1x)	Capricorn Scientific	PBS-1A
Embedded paraffin tissue blocks	IdISBa Biobank		Fee for service
Exo-spin mini-HD columns	Cell guidance systems	EX05
Feather S35 Microtome Blade	Feather	43037
Filtropur S 0.2 µm syringe filter	Sarstedt	83.1826.001
Fluoroshield with DAPI	Sigma-Aldrich	F-6057
Oncostatin M Human	Sigma-Aldrich	O9635-10UG	Prepare a stock solution to a final concentration of 0.1 µg/µL diluten in PBS-0.1% BSA
Paraformaldehyde	Sigma-Aldrich	8.18715.1000	Prepared at 4% with PBS and stored at 4 °C
Penicillin-Streptomycin Solution 100x	Biowest	L0022
PKH26 Red Fluorescent Cell Linker Kit for General Cell Membrane Labeling	Sigma-Aldrich	MINI26	PKH26 and Dliuent C included
Sodium citrate dihydrate	Scharlab	SO019911000
Superfrost Plus Microscope Slides	Thermo Scientific	J1800AMNZ
TNFα	R&D systems	210-TA-005	Prepare a stock solution to a final concentration of 0.01 µg/µL diluted in PBS-0.1% BSA
Triton X-100	Sigma-Aldrich	T8787	Used to prepare a 0.1% Triton-0.1% sodium citrate solution with Milli-Q water
Xylene	Scharlab	XI0050005P
Equipment
Centrifuge 5430 R	Eppendorf	5428000210	F-45-48-11 rotor
NanoSight NS300	Malvern	NS300	Device with embedded laser at λ= 532 nm and camera sCMOS
Shandon Finesse 325 Manual Microtome	Thermo Scientific™	A78100101
TCS-SPE confocal microscope	Leica Microsystems	5200000271