血小板衍生的Ti植入物的细胞外囊泡功能化

摘要

在这里，我们提出了一种分离来自血小板裂解物（PL）的细胞外囊泡（EV）的方法及其用于包衣钛（Ti）植入物表面的方法。我们描述了滴铸涂层方法，电动汽车从表面的释放曲线，以及电动汽车涂层Ti表面的 体外 生物相容性。

摘要

细胞外囊泡（EV）是生物纳米囊泡，在细胞通讯中起关键作用。其含量包括蛋白质和核酸等活性生物分子，在再生医学中具有巨大的潜力。最近，来自血小板裂解物（PL）的EV显示出与PL相当的成骨能力。此外，生物材料经常用于骨科或牙齿修复。在这里，我们提供了一种用PL衍生的EV功能化Ti表面的方法，以改善其成骨性能。

通过尺寸排阻色谱法从PL中分离出EV，然后通过滴铸将Ti表面与PL-EV功能化。功能化通过EV释放和乳酸盐脱氢酶（LDH）释放测定的生物相容性得到证明。

引言

EV是由任何细胞分泌的膜囊泡（30-200nm），通过传递其货物在细胞间通信中起着关键作用。它们含有多种活性生物分子，其中可能包括核酸、生长因子或生物活性脂质¹。由于这些原因，电动汽车已被评估其在治疗中的潜在用途。在骨科和骨再生方面，来自不同来源的EV已经过测试。其中，血小板衍生的EV已被证明可以诱导干细胞的分化作用，同时保持低细胞毒性^2，3。因此，需要进一步的研究来探索将EV与生物材料相结合的可能性，以便在日常临床实践中使用它们。

钛基生物材料由于其机械性能、高生物相容性和长期耐用性，被广泛用作骨愈合临床干预的支架⁴。然而，Ti植入物是一种生物惰性材料，因此与周围骨组织的结合能力较差⁵。因此，正在研究钛改性，以便通过在其表面实现功能更强大的微环境来提高其性能^4，6，7。从这个意义上说，电动汽车可以通过化学⁸ 或物理相互作用与钛锚定^9，10。来自干细胞或巨噬细胞的固定化EV通过促进细胞粘附和增殖来增强Ti的生物活性，从而诱导成骨作用^8，9，10。

本文将重点介绍使用PL衍生的EV涂覆Ti表面的液滴铸造策略。此外，我们将评估EV在一段时间内从包被表面的释放曲线，并在 体外确认其细胞生物相容性。

研究方案

血小板裂解物（PL）按照先前所述使用IdISBa生物库提供的新鲜白蛋白涂层作为起始材料获得，符合机构指南³ 。它们在当前项目中的使用得到了其道德委员会的批准（IB 1995/12 BIO）。

1. 电动汽车与PL隔离

1. 较大的身体移除
   1. 在室温下解冻PL。
   2. 在4°C下以1，500× g 离心PL15分钟。 丢弃含有细胞碎片的沉淀。
   3. 收集上清液并在4°C下以10，000× g 连续离心30分钟。
      注意:沉淀对应于较大的EV，例如微泡，在这种情况下，它被丢弃。
   4. 过滤上清液首先通过0.8μm多孔膜，然后通过0.2μm多孔膜。
      注意:这些步骤将删除所有不需要的电动汽车。
   5. 将过滤后的PL池化并储存在-20°C直至使用。
2. 尺寸排阻色谱
   1. 用过滤的PBS以所需的流速平衡耦合到色谱设备的色谱柱。
      注:使用的流速取决于色谱柱特性;在这种情况下，它被设置为0.5毫升/分钟。
   2. 用注射器将处理后的PL（5 mL）装载到设备上。
   3. 将PL注入色谱柱中，并开始在15 mL管中收集5 mL级分。
   4. 收集EV富集馏分并将其储存在-80°C直至使用。
      注意:首次进行实验时，通过蛋白质定量和免疫检测表征所有组分，以确定富含EVs的组分^3，11。在这个实验中，收集了^第 9个分数。
   5. 用30mL的0.2%NaOH溶液洗涤色谱柱，一旦达到平衡，将其储存在20%乙醇溶液中。

图1:血小板裂解物（PL）细胞外囊泡（EV）分离的示意图。 PL首先以1，500 x g 离心，然后以10，000 x g 离心以除去较大的主体。上清液通过0.8和0.2μm过滤器过滤。将处理后的PL加载到色谱柱上，并通过尺寸排阻色谱分离EV。 请点击此处查看此图的放大版本。

2. 电动汽车特性描述

注:EV表征是进行功能研究所必需的¹²。电子显微镜或蛋白质印迹表征以前已有报道¹³。本报告将重点介绍Ti表面功能化的基本表征技术。

1. 纳米颗粒跟踪分析
   1. 将EV（1:1000）稀释在0.2μm过滤的PBS中。
      注意:过于浓缩的样品或太稀释的样品将超出NTA测定的范围，并且需要进行调整。
   2. 用注射器将1 mL稀释的EV加载到NTA设备中，并将其注入NTA设备。
   3. 遵循制造商的颗粒浓度和尺寸分布测定协议。
2. 蛋白质浓度
   1. 使用1μLEV溶液测定浓度。使用分光光度计测量波长为280nm的吸光度。
      注意:与颗粒数量相比，电动汽车的蛋白质水平应该较低。
   2. 按照制造商的说明使用分光光度计获取吸光度读数。

3. 钛表面功能化

注:在这种方法中，使用机加工的钛圆盘，c.p.等级IV，直径6.2毫米，高度2毫米。这些光盘可以用Ti镊子操纵，但重要的是不要划伤表面。此外，在整个过程中，机加工侧必须朝上。

1. 钛盘清洗
   注:用于Ti洗涤的溶液体积应足以覆盖Ti盘。将Ti圆盘放入玻璃烧杯中，并将溶液倒入其中。然后，通过倾析取溶液。
   1. 用去离子（DI）水清洗Ti植入物，然后丢弃水。
   2. 用乙醇洗涤Ti植入物70%，然后倾析以除去溶液。
   3. 将植入物置于DI水中，并在50°C下超声处理5分钟。丢弃水。
   4. 将Ti植入物在40%NaOH溶液中孵育50°C并搅拌10分钟。丢弃解决方案。
      注意:NaOH溶液在制备过程中会变暖。该溶液具有腐蚀性，应在通风橱内使用。
   5. 将植入物在50°C的DI水中超声处理5分钟，然后取出水。
   6. 用去离子水（至少5次）进行几次洗涤，直到达到中性pH值。使用pH指示剂检查pH值。
   7. 在50°C的DI水中超声处理植入物5分钟，然后取出水。
   8. 将Ti植入物在50°C的50%_HNO3 溶液中孵育10分钟，搅拌。删除解决方案。
      注意:_HNO3 是一种腐蚀性和氧化性物质，应在通风橱内使用。
   9. 将植入物在50°C的DI水中超声处理5分钟。取出水。
   10. 用去离子水（至少5次）进行几次洗涤，直到获得中性pH值。使用pH指示剂检查pH值。
   11. 将植入物在50°C的DI水中超声处理5分钟。取出水。
       注意:此时，可以通过将Ti植入物储存在70%乙醇溶液中来停止实验。
2. 钛钝化
   注:Ti钝化步骤是通过按下面列出的顺序用不同的溶液完全覆盖Ti光盘来执行的。将Ti圆盘放入玻璃烧杯中，并将溶液轻轻倒在上面。所有洗涤步骤中使用的体积必须完全覆盖植入物，并通过倾析去除。
   1. 将Ti植入物在30%_HNO3 溶液中孵育30分钟，在室温下温和搅拌。删除解决方案。
   2. 用去离子水（至少5次）进行几次洗涤，直到达到中性pH值。使用pH指示剂检查pH值。
   3. 将Ti植入物在室温下在DI水中孵育过夜。
   4. 在40°C的真空条件下干燥植入物10分钟。
3. 电动汽车下降铸件
   注意:对于细胞功能研究，在细胞培养柜中工作很重要。
   1. 将Ti植入物置于96孔板中，加工面朝上。
      注意:如果植入物倒置，可以使用针头将其放回去。
   2. 解冻电动汽车溶液，并将其与搅拌混合。使用涡旋脉冲3秒。
   3. 将EV沉积在Ti表面上。在这项研究中，将滴剂40μL的EV溶液滴到Ti上，根据NTA确定的浓度，每个植入物最多固定4 x ¹⁰¹¹ 个EV。
   4. 将含有Ti的板置于37°C的真空条件下，直到滴完全干燥（〜2小时）。
      注意:根据植入物的数量和真空室中存在的水来调整时间。

图2:Ti钝化和EV通过液滴铸造功能化的原理图。 Ti植入物首先在室温下在30%_HNO3 溶液中孵育30分钟，钝化。用去离子水洗涤几次后，pH值达到中性。然后，将Ti植入物在室温下在DI水中孵育过夜。之后，植入物在40°C的真空条件下干燥。 对于EV固定化，将40μLEV溶液沉积到Ti植入物上。接下来，植入物在真空下孵育2小时，直到EV物理结合到表面。 请点击此处查看此图的放大版本。

4. Ti 表面表征

1. 发布研究
   1. 在37°C下用200μL过滤的PBS孵育Ti表面。
      注:PBS经过滤波，以避免干扰NTA测量。
   2. 在不同的时间点更换PBS并储存在-80°C。
      注意:在这项研究中，分析了2天，6天，10天和14天的时间点。
   3. 根据制造商的说明，NTA分析存储的PBS以进行颗粒研究。
      注:PBS中不同时间的颗粒浓度是电动汽车随时间变化的释放曲线的表示。
2. 生物相容性研究
   注意:人脐带来源间充质干细胞（hUC-MSC）是根据机构指南从IdISBa生物库获得的。
   1. 在补充 20% FBS 的 DMEM 低血糖中维持 hUC-MSC，直至使用。每周更换两次培养基。
   2. 对于细胞接种，用5 mL PBS在烧瓶中洗涤细胞两次。
   3. 通过加入 1 mL 胰蛋白酶溶液对 hUC-MSC 进行胰蛋白酶消化。确保它完全覆盖细胞的单层。除去胰蛋白酶溶液并将细胞培养瓶置于37°C约2分钟。在显微镜下观察细胞脱离。分离的细胞将呈现圆形，并将处于悬浮状态。
   4. 将细胞重悬于 DMEM 低葡萄糖中，1% 的 EV 耗尽 FBS。
      注意:准备补充有1%FBS的培养基，然后以120，000× g 超速离心18小时以除去FBS-EV。重要的是要去除EV以避免与血小板EV的干扰。
   5. 通过用Neubauer室计数细胞数量来确定细胞浓度¹⁴。
   6. 使hUC-MSC达到50，000个细胞/ mL的浓度。
   7. 将200μL细胞溶液接种到Ti植入物上。
   8. 48小时后，根据制造商的协议，收集50μL培养基并使用乳酸脱氢酶（LDH）活性试剂盒进行细胞毒性测定。

结果

本文中介绍的方法允许获得EV功能化的钛盘。电动汽车与表面物理粘合，这允许随着时间的推移持续释放。NTA可以在第2天，第6天，第10天和第14天测量释放的EV数量。第2天的第一次测量显示，大约有¹⁰⁹ 辆电动汽车被释放，然后在第6天持续释放（约¹⁰⁸ 辆电动汽车）;第10天（约¹⁰⁷ 辆电动汽车）和第14天（约¹⁰⁷ 辆电动汽车）。这证实了持续释放，尽管随着时间的推移?...

讨论

该协议旨在为电动汽车在Ti表面上的功能化提供明确的说明。所提出的方法基于液滴铸造策略，这是一种物理吸附类型的功能化。关于Ti表面上的EV功能化，书目很差，尽管很少有研究表明在^Ti10上固定EV具有不同的优势。无论如何，探索的一些策略包括生化结合⁸，聚合物截留⁹ 或滴铸¹⁰。虽然通过共价键使用化学涂层可能会实?...

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
0,8 µm syringe filter	Sartorius	16592K
1.5 mL Centrifuge tube	SPL life sciences	PLC60015
1mL syringe	BD	303174
96-well culture plate	SPL life sciences	PLC30096
Absolut ethanol	Scharlau	ET0006005P	Used to prepare 20 %  ethanol with Milli-Q® water
AKTA purifier System	GE Healthcare	8149-30-0014
Allegra X-15R Centrifuge	Beckman Coutler	392934	SX4750A swinging rotor
Centrifuge 5430 R	Eppendorf	5428000210	F-45-48-11 rotor
Conical Tube, Conical Bottom, 50ml	SPL life sciences	PLC50050
Cytotoxicity Detection Kit (LDH)	Roche	11644793001
Disposable Syringes 10 ml	Becton Dickinson	BDH307736
DMEM Low Glucose Glutamax	GIBCO	21885025
Dulbecco's PBS (1x)	Capricorn Scientific	PBS-1A
Fetal Bovine Serum (FBS) Embrionic Certified	GIBCO	16000044
Filtropur S 0.2 µm syringe filter	Sarstedt	83.1826.001
HiPrep 16/60 Sephacryl S-400 HR	GE Healthcare	28-9356-04	Precast columns
human umbilical cord-derived mesenchymal stem cells (hUC-MSC)	IdISBa Biobank
Nanodrop 2000 spectrophotometer	ThermoFisher	ND-2000
NanoSight NS300 nanoparticle tracking analysis	Malvern	NS300	Device with embedded laser at λ= 532 nm and camera sCMOS
Needle	Terumo	946077135
Nitric acid 69,5%	Scharlau	AC16071000
Optima L-100 XP Ultracentrifuge	Beckman Coulter	8043-30-1124	SW-32Ti Rotor
Penicillin-Streptomycin Solution 100X	Biowest	L0022
pH Test strips 4.5-10.0	Sigma	P-4536
Platelet Lysate (PL)	IdISBa Biobank		Obtained from  buffy coats discarded after blood donation
Polypropylene centrifuge tubs	Beckman Coutler	326823
Power wave HT	BioTek	10340763
Screw cap tube, 15 ml, (LxØ): 120 x 17 mm, PP, with print	Sarstedt	62554502
Sodium hidroxide	Sharlau	SO04251000
Titanium implants replicas	Implantmedia, SA	NA	Titanium grade IV. Diameter: 6,2 mm. Height: 1,95 mm
Trypsin-EDTA 1 X	Biowest	L0930
Tryton X100	Sigma	T8787