Funcionalización de vesículas extracelulares derivadas de plaquetas de implantes ti

Resumen

Aquí, presentamos un método para el aislamiento de vesículas extracelulares (EV) derivadas de los lisados plaquetarios (PL) y su uso para recubrir superficies de implantes de titanio (Ti). Describimos el método de recubrimiento de fundición por gota, el perfil de liberación de EV de las superficies y la biocompatibilidad in vitro de las superficies Ti recubiertas de EV.

Resumen

Las vesículas extracelulares (EV) son nanovesículas biológicas que desempeñan un papel clave en la comunicación celular. Su contenido incluye biomoléculas activas como proteínas y ácidos nucleicos, que presentan un gran potencial en medicina regenerativa. Más recientemente, los EV derivados del lisado plaquetario (PL) han demostrado una capacidad osteogénica comparable a pl. Además, los biomateriales se utilizan con frecuencia en ortopedia o restauración dental. Aquí, proporcionamos un método para funcionalizar las superficies de Ti con EV derivados de PL para mejorar sus propiedades osteogénicas.

Los EV se aíslan de PL mediante cromatografía de exclusión de tamaño, y luego las superficies de Ti se funcionalizan con PL-EV mediante fundición por gota. La funcionalización se demuestra mediante la liberación de EV y su biocompatibilidad mediante el ensayo de liberación de lactato deshidrogenasa (LDH).

Introducción

Los EV son vesículas de membrana (30-200 nm) secretadas por cualquier célula y desempeñan un papel clave en la comunicación de célula a célula al entregar su carga. Contienen una variedad de biomoléculas activas que pueden incluir ácidos nucleicos, factores de crecimiento o lípidos bioactivos1. Por estas razones, los EV han sido evaluados por su uso potencial en terapias. En términos de ortopedia y regeneración ósea, se han probado evs de diferentes fuentes. Entre ellos, se ha demostrado que los EV derivados de plaquetas inducen un efecto de diferenciación sobre las células madre manteniendo un perfil citotóxico ^bajo2,3. Por lo tanto, se requiere más investigación para explorar la posibilidad de combinar evs con biomateriales para usarlos en la práctica clínica diaria.

Los biomateriales a base de titanio son ampliamente utilizados como andamios para intervenciones clínicas de curación ósea debido a sus propiedades mecánicas, alta biocompatibilidad y durabilidad a largo ^plazo4. Sin embargo, los implantes ti son un material bioinerte y, por lo tanto, presentan una escasa capacidad de unión con el tejido óseo ^circundante5. Por este motivo, se están estudiando modificaciones de titanio con el fin de mejorar su rendimiento consiguiendo un microambiente más funcional en su ^{superficie4,6,7}. En este sentido, los vehículos eléctricos pueden anclarse al titanio mediante interacciones ^químicas8 o ^físicas9,10. Los EV inmovilizados derivados de células madre o macrófagos potencian la bioactividad del Ti al favorecer la adhesión y proliferación celular induciendo así un efecto osteogénico8,9,10.

Este artículo se centrará en una estrategia de fundición por gota para recubrir superficies Ti con vehículos eléctricos derivados de PL en detalle. Además, evaluaremos el perfil de liberación de evs de la superficie recubierta a lo largo del tiempo y confirmaremos su biocompatibilidad celular in vitro.

Protocolo

El Lisado plaquetario (PL) se obtiene como se describió anteriormente de acuerdo con las directrices ^{institucionales3} utilizando como material de partida capas de buffy frescas proporcionadas por el Biobanco IdISBa. Su uso para el proyecto actual fue aprobado por su Comité de Ética (IB 1995/12 BIO).

1. Aislamiento de evs de PL

1. Extracción de cuerpos más grandes
   1. Descongele PL a temperatura ambiente.
   2. Centrífuga PL a 1.500 x g durante 15 min a 4 °C. Deseche el pellet ya que contiene restos celulares.
   3. Recoge el sobrenadante y realiza dos centrifugaciones consecutivas a 10.000 x g durante 30 min a 4 °C.
      NOTA: El pellet corresponde a vehículos eléctricos más grandes, como microvesículas, y en este caso, se descarta.
   4. Filtre el sobrenadante primero a través de una membrana porosa de 0,8 μm y luego a través de una membrana porosa de 0,2 μm.
      NOTA: Estos pasos eliminan todos los vehículos eléctricos no deseados.
   5. Acumule el PL filtrado y guárdelo a -20 °C hasta su uso.
2. Cromatografía de exclusión de tamaño
   1. Equilibre la columna acoplada al equipo de cromatografía al caudal deseado con PBS filtrado.
      NOTA: El caudal utilizado depende de las características de la columna; en este caso, se establece en 0,5 ml/min.
   2. Cargue el PL procesado (5 ml) con una jeringa al equipo.
   3. Inyecte el PL en la columna y comience a recolectar fracciones de 5 ml en tubos de 15 ml.
   4. Recoge las fracciones enriquecidas con EV y guárdalas a -80 °C hasta su uso.
      NOTA: Al realizar el experimento por primera vez, caracterizar todas las fracciones mediante cuantificación de proteínas e inmunodetección para determinar la enriquecida con ^EV3,11. En este experimento, se recoge la ^9ª fracción.
   5. Lave la columna cromatográfica con 30 ml de solución de NaOH al 0,2% y guárdela en una solución de etanol al 20% una vez que alcance el equilibrio.

Figura 1: Diagrama esquemático del aislamiento de vesículas extracelulares (EV) de lisado plaquetario (PL). Pl se centrifuga primero a 1.500 x g, y luego a 10.000 x g para eliminar cuerpos más grandes. El sobrenadante se filtra a través de filtros de 0,8 y 0,2 μm. El PL procesado se carga en la columna, y los EV se separan por cromatografía de exclusión de tamaño. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

2. Caracterización de los vehículos eléctricos

NOTA: La caracterización de los EV es necesaria para realizar estudios ^{funcionales12}. Previamente se ha reportado microscopía electrónica o caracterización de western ^blot13. Este informe se centrará en las técnicas de caracterización esenciales para la funcionalización de la superficie de Ti.

1. Análisis de seguimiento de nanopartículas (NTA)
   1. Diluya los EV (1:1000) en PBS filtrados de 0,2 μm.
      NOTA: Las muestras demasiado concentradas o demasiado diluidas estarán fuera del rango para la determinación de NTA, y se requerirá un ajuste.
   2. Cargue 1 ml de los EV diluidos con una jeringa en el equipo NTA e inyértelos en el equipo NTA.
   3. Siga el protocolo del fabricante para la determinación de la concentración de partículas y la distribución del tamaño.
2. Concentración de proteínas
   1. Determine la concentración utilizando 1 μL de la solución de EV. Mida la absorbancia con un espectrofotómetro a una longitud de onda de 280 nm.
      NOTA: Los EV deben presentar niveles bajos de proteínas en comparación con el número de partículas.
   2. Siga las instrucciones del fabricante para obtener la lectura de absorbancia utilizando el espectrofotómetro.

3. Funcionalización de la superficie de titanio

NOTA: En este método, se utilizan discos de titanio mecanizados, c.p. grado IV, 6,2 mm de diámetro y 2 mm de altura. Los discos pueden ser manipulados con pinzas Ti, pero es importante no rayar la superficie. Además, el lado mecanizado debe mirar hacia arriba durante todo el proceso.

1. Lavado de discos Ti
   NOTA: El volumen de soluciones utilizadas para el lavado de Ti debe ser suficiente para cubrir los discos de Ti. Coloque los discos Ti en un vaso de precipitados de vidrio y vierta soluciones sobre ellos. Luego, retire la solución decantando.
   1. Lave los implantes Ti con agua desionizada (DI) y luego deseche el agua.
   2. Lave los implantes Ti con etanol al 70% y luego decante para eliminar la solución.
   3. Coloque los implantes en agua DI y sonice a 50 °C durante 5 min. Deseche el agua.
   4. Incubar los implantes de Ti en una solución de NaOH al 40% a 50 °C durante 10 min con agitación. Deseche la solución.
      PRECAUCIÓN: La solución de NaOH se calienta durante la preparación. La solución es corrosiva y debe usarse dentro de una campana extractora de humos.
   5. Sonicar los implantes en agua DI a 50 °C durante 5 min, y luego retirar el agua.
   6. Realice varios lavados con agua DI (al menos 5) hasta que alcance un pH neutro. Compruebe el pH con indicadores de pH.
   7. Sonicar los implantes en agua DI a 50 °C durante 5 min y retirar el agua.
   8. Incubar los implantes ti en una solución de _HNO3 al 50% a 50 °C durante 10 min con agitación. Retire la solución.
      PRECAUCIÓN: _HNO3 es una sustancia corrosiva y oxidante, y debe usarse dentro de una campana extractora de humos.
   9. Sonicar los implantes en agua DI a 50 °C durante 5 min. Retire el agua.
   10. Realizar varios lavados con agua DI (al menos 5) hasta obtener pH neutro. Compruebe el pH con indicadores de pH.
   11. Sonicar los implantes en agua DI a 50 °C durante 5 min. Retire el agua.
       NOTA: En este punto, el experimento se puede detener almacenando implantes ti en una solución de etanol al 70%.
2. Pasivación ti
   NOTA: Los pasos de pasivación de Ti se realizan cubriendo completamente los discos Ti con las diferentes soluciones en el orden que se enumera a continuación. Los discos ti se colocan en un vaso de precipitados de vidrio y las soluciones se vierten suavemente sobre ellos. Los volúmenes utilizados en todas las etapas de lavado deben cubrir completamente los implantes y se eliminan mediante decantación.
   1. Incubar los implantes Ti en una solución de _{HNO3 al 30} % durante 30 min a temperatura ambiente bajo una agitación suave. Retire la solución.
   2. Realice varios lavados con agua DI (al menos 5) hasta que alcance un pH neutro. Compruebe el pH con indicadores de pH.
   3. Incubar los implantes ti durante la noche a temperatura ambiente en agua DI.
   4. Secar los implantes en condiciones de vacío a 40 °C durante 10 min.
3. Lanzamiento de vehículos eléctricos
   NOTA: Para los estudios funcionales celulares, es importante trabajar en un gabinete de cultivo celular.
   1. Coloque los implantes Ti en una placa de 96 pocillos, con el lado mecanizado hacia arriba.
      NOTA: Si los implantes están volteados boca abajo, se puede usar una aguja para colocarlos hacia atrás.
   2. Descongele la solución de EV y mézclelos con agitación. Use un vórtice para pulsar durante 3 s.
   3. Deposite los vehículos eléctricos en la superficie ti. En este estudio, se colocan gotas de 40 μL de solución de EV sobre el Ti para inmovilizar un máximo de 4 x ¹⁰¹¹ EV por implante de acuerdo con la concentración determinada por NTA.
   4. Coloque las placas que contienen el Ti en condiciones de vacío a 37 °C hasta que las gotas estén completamente secas (~2 h).
      NOTA: Ajuste el tiempo dependiendo del número de implantes y el agua presente en la cámara de vacío.

Figura 2: Diagrama esquemático de pasivación ti y funcionalización de EV por drop casting. Los implantes de Ti se pasivan primero por incubación durante 30 min en una solución de _{HNO3 al 30} % a temperatura ambiente. Después de varios lavados con agua DI, el pH alcanza neutro. Luego, los implantes de Ti se incuban durante la noche a temperatura ambiente en agua DI. Después de eso, los implantes se secan en condiciones de vacío a 40 ° C. Para la inmovilización de EV, 40 μL de solución de EV se depositan en los implantes ti. A continuación, los implantes se incuban al vacío durante 2 h hasta que los EV se unen físicamente a la superficie. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

4. Caracterización de la superficie ti

1. Estudio de lanzamiento
   1. Incubar la superficie de Ti con 200 μL de PBS filtrado a 37 °C.
      NOTA: PBS se filtra para evitar interferencias con la medición NTA.
   2. Reemplace el PBS en diferentes puntos de tiempo y guárdelo a -80 °C.
      NOTA: En este estudio, se analizaron los puntos de tiempo de 2, 6, 10 y 14 días.
   3. Analice el PBS almacenado para estudios de partículas por NTA de acuerdo con las instrucciones del fabricante.
      NOTA: La concentración de partículas en PBS en diferentes momentos es una representación del perfil de liberación de EV a lo largo del tiempo.
2. Estudios de biocompatibilidad
   NOTA: Las células madre mesenquimales derivadas del cordón umbilical humano (hUC-MSC) se obtienen del Biobanco IdISBa de conformidad con las directrices institucionales.
   1. Mantener hUC-MSC en DMEM bajo en glucosa suplementado con 20% FBS hasta su uso. Cambie el medio dos veces por semana.
   2. Para la siembra celular, lave las células en matraces con 5 ml de PBS dos veces.
   3. Tripsinize hUC-MSC añadiendo 1 ml de solución de tripsina. Asegúrese de que cubre completamente la monocapa de células. Retire la solución de tripsina y coloque el matraz de cultivo celular a 37 °C durante 2 min aproximadamente. Vea el desprendimiento celular bajo el microscopio. Las celdas separadas aparecerán de forma redonda y estarán en suspensión.
   4. Células resuspend en DMEM glucosa baja con EV 1% agotado FBS.
      NOTA: Prepare medios suplementados con 1% de FBS, y luego ultracentrífuga a 120,000 x g durante 18 h para eliminar FBS-EV. Es importante eliminar los EV para evitar interferencias con los EV plaquetarios.
   5. Determinar la concentración celular contando el número de células con una cámara de ^Neubauer14.
   6. Llevar hUC-MSC a una concentración de 50.000 células/ml.
   7. Sembra 200 μL de la solución celular sobre los implantes Ti.
   8. Después de 48 h, recolectar 50 μL de medios y realizar la determinación citotóxica utilizando el kit de actividad de lactato deshidrogenasa (LDH), de acuerdo con el protocolo del fabricante.

Resultados

El método presentado en este artículo permite obtener discos de titanio funcionalizados evs. Los vehículos eléctricos están físicamente unidos a la superficie, lo que permite una liberación sostenida en el tiempo. La cantidad de vehículos eléctricos liberados puede ser medida por NTA en los días 2, 6, 10 y 14. Las primeras mediciones, en el día 2, muestran que se liberan alrededor de ¹⁰⁹ EV, seguidos de una liberación sostenida en el día 6 (~ ¹⁰⁸ EV); día 10 (~¹⁰⁷ EV) y día...

Discusión

Este protocolo tiene como objetivo proporcionar instrucciones claras para la funcionalización de los vehículos eléctricos en las superficies ti. El método presentado se basa en una estrategia de drop casting, que es un tipo de funcionalización de fisiorción. Existe una bibliografía deficiente con respecto a la funcionalización de los evs en las superficies de Ti, aunque hay pocos estudios que muestren diferentes ventajas al inmovilizar los EV en ^Ti10. De todos modos, algunas de las estrate...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
0,8 µm syringe filter	Sartorius	16592K
1.5 mL Centrifuge tube	SPL life sciences	PLC60015
1mL syringe	BD	303174
96-well culture plate	SPL life sciences	PLC30096
Absolut ethanol	Scharlau	ET0006005P	Used to prepare 20 %  ethanol with Milli-Q® water
AKTA purifier System	GE Healthcare	8149-30-0014
Allegra X-15R Centrifuge	Beckman Coutler	392934	SX4750A swinging rotor
Centrifuge 5430 R	Eppendorf	5428000210	F-45-48-11 rotor
Conical Tube, Conical Bottom, 50ml	SPL life sciences	PLC50050
Cytotoxicity Detection Kit (LDH)	Roche	11644793001
Disposable Syringes 10 ml	Becton Dickinson	BDH307736
DMEM Low Glucose Glutamax	GIBCO	21885025
Dulbecco's PBS (1x)	Capricorn Scientific	PBS-1A
Fetal Bovine Serum (FBS) Embrionic Certified	GIBCO	16000044
Filtropur S 0.2 µm syringe filter	Sarstedt	83.1826.001
HiPrep 16/60 Sephacryl S-400 HR	GE Healthcare	28-9356-04	Precast columns
human umbilical cord-derived mesenchymal stem cells (hUC-MSC)	IdISBa Biobank
Nanodrop 2000 spectrophotometer	ThermoFisher	ND-2000
NanoSight NS300 nanoparticle tracking analysis	Malvern	NS300	Device with embedded laser at λ= 532 nm and camera sCMOS
Needle	Terumo	946077135
Nitric acid 69,5%	Scharlau	AC16071000
Optima L-100 XP Ultracentrifuge	Beckman Coulter	8043-30-1124	SW-32Ti Rotor
Penicillin-Streptomycin Solution 100X	Biowest	L0022
pH Test strips 4.5-10.0	Sigma	P-4536
Platelet Lysate (PL)	IdISBa Biobank		Obtained from  buffy coats discarded after blood donation
Polypropylene centrifuge tubs	Beckman Coutler	326823
Power wave HT	BioTek	10340763
Screw cap tube, 15 ml, (LxØ): 120 x 17 mm, PP, with print	Sarstedt	62554502
Sodium hidroxide	Sharlau	SO04251000
Titanium implants replicas	Implantmedia, SA	NA	Titanium grade IV. Diameter: 6,2 mm. Height: 1,95 mm
Trypsin-EDTA 1 X	Biowest	L0930
Tryton X100	Sigma	T8787