Funcionalización de vesículas extracelulares derivadas de plaquetas de implantes ti

Resumen

Aquí, presentamos un método para el aislamiento de vesículas extracelulares (EV) derivadas de los lisados plaquetarios (PL) y su uso para recubrir superficies de implantes de titanio (Ti). Describimos el método de recubrimiento de fundición por gota, el perfil de liberación de EV de las superficies y la biocompatibilidad in vitro de las superficies Ti recubiertas de EV.

Resumen

Las vesículas extracelulares (EV) son nanovesículas biológicas que desempeñan un papel clave en la comunicación celular. Su contenido incluye biomoléculas activas como proteínas y ácidos nucleicos, que presentan un gran potencial en medicina regenerativa. Más recientemente, los EV derivados del lisado plaquetario (PL) han demostrado una capacidad osteogénica comparable a pl. Además, los biomateriales se utilizan con frecuencia en ortopedia o restauración dental. Aquí, proporcionamos un método para funcionalizar las superficies de Ti con EV derivados de PL para mejorar sus propiedades osteogénicas.

Los EV se aíslan de PL mediante cromatografía de exclusión de tamaño, y luego las superficies de Ti se funcionalizan con PL-EV mediante fundición por gota. La funcionalización se demuestra mediante la liberación de EV y su biocompatibilidad mediante el ensayo de liberación de lactato deshidrogenasa (LDH).

Introducción

Los EV son vesículas de membrana (30-200 nm) secretadas por cualquier célula y desempeñan un papel clave en la comunicación de célula a célula al entregar su carga. Contienen una variedad de biomoléculas activas que pueden incluir ácidos nucleicos, factores de crecimiento o lípidos bioactivos1. Por estas razones, los EV han sido evaluados por su uso potencial en terapias. En términos de ortopedia y regeneración ósea, se han probado evs de diferentes fuentes. Entre ellos, se ha demostrado que los EV derivados de plaquetas inducen un efecto de diferenciación sobre las células madre manteniendo un perfil citotóxico ^bajo2,3<....

Protocolo

El Lisado plaquetario (PL) se obtiene como se describió anteriormente de acuerdo con las directrices ^{institucionales3} utilizando como material de partida capas de buffy frescas proporcionadas por el Biobanco IdISBa. Su uso para el proyecto actual fue aprobado por su Comité de Ética (IB 1995/12 BIO).

1. Aislamiento de evs de PL

1. Extracción de cuerpos más grandes
   1. Descongele PL a temperatura ambiente.
   2. Centrífuga PL a 1.500 x g durante 15 min a 4 °C. Deseche el pellet ya que contiene restos celulares.
   3. Recoge el sobrenadante y realiza dos centrifugaciones consecutivas a 10.....

Resultados

El método presentado en este artículo permite obtener discos de titanio funcionalizados evs. Los vehículos eléctricos están físicamente unidos a la superficie, lo que permite una liberación sostenida en el tiempo. La cantidad de vehículos eléctricos liberados puede ser medida por NTA en los días 2, 6, 10 y 14. Las primeras mediciones, en el día 2, muestran que se liberan alrededor de ¹⁰⁹ EV, seguidos de una liberación sostenida en el día 6 (~ ¹⁰⁸ EV); día 10 (~¹⁰⁷ EV) y día.......

Discusión

Este protocolo tiene como objetivo proporcionar instrucciones claras para la funcionalización de los vehículos eléctricos en las superficies ti. El método presentado se basa en una estrategia de drop casting, que es un tipo de funcionalización de fisiorción. Existe una bibliografía deficiente con respecto a la funcionalización de los evs en las superficies de Ti, aunque hay pocos estudios que muestren diferentes ventajas al inmovilizar los EV en ^Ti10. De todos modos, algunas de las estrate.......

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
0,8 µm syringe filter	Sartorius	16592K
1.5 mL Centrifuge tube	SPL life sciences	PLC60015
1mL syringe	BD	303174
96-well culture plate	SPL life sciences	PLC30096
Absolut ethanol	Scharlau	ET0006005P	Used to prepare 20 %  ethanol with Milli-Q® water
AKTA purifier System	GE Healthcare	8149-30-0014
Allegra X-15R Centrifuge	Beckman Coutler	392934	SX4750A swinging rotor
Centrifuge 5430 R	Eppendorf	5428000210	F-45-48-11 rotor
Conical Tube, Conical Bottom, 50ml	SPL life sciences	PLC50050
Cytotoxicity Detection Kit (LDH)	Roche	11644793001
Disposable Syringes 10 ml	Becton Dickinson	BDH307736
DMEM Low Glucose Glutamax	GIBCO	21885025
Dulbecco's PBS (1x)	Capricorn Scientific	PBS-1A
Fetal Bovine Serum (FBS) Embrionic Certified	GIBCO	16000044
Filtropur S 0.2 µm syringe filter	Sarstedt	83.1826.001
HiPrep 16/60 Sephacryl S-400 HR	GE Healthcare	28-9356-04	Precast columns
human umbilical cord-derived mesenchymal stem cells (hUC-MSC)	IdISBa Biobank
Nanodrop 2000 spectrophotometer	ThermoFisher	ND-2000
NanoSight NS300 nanoparticle tracking analysis	Malvern	NS300	Device with embedded laser at λ= 532 nm and camera sCMOS
Needle	Terumo	946077135
Nitric acid 69,5%	Scharlau	AC16071000
Optima L-100 XP Ultracentrifuge	Beckman Coulter	8043-30-1124	SW-32Ti Rotor
Penicillin-Streptomycin Solution 100X	Biowest	L0022
pH Test strips 4.5-10.0	Sigma	P-4536
Platelet Lysate (PL)	IdISBa Biobank		Obtained from  buffy coats discarded after blood donation
Polypropylene centrifuge tubs	Beckman Coutler	326823
Power wave HT	BioTek	10340763
Screw cap tube, 15 ml, (LxØ): 120 x 17 mm, PP, with print	Sarstedt	62554502
Sodium hidroxide	Sharlau	SO04251000
Titanium implants replicas	Implantmedia, SA	NA	Titanium grade IV. Diameter: 6,2 mm. Height: 1,95 mm
Trypsin-EDTA 1 X	Biowest	L0930
Tryton X100	Sigma	T8787