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摘要

刚地弓形虫 和 犬新孢子 虫感染存在于人类和动物中，并导致严重的健康问题。这两种寄生虫具有相似的核苷三磷酸水解酶，在繁殖和存活中起重要作用。我们建立了需要使用机械臂的酶的高标准测定法。

摘要

原生动物寄生虫感染人类和许多温血动物。 弓形虫是一种主要的原生动物寄生虫，常见于 HIV 阳性患者、器官移植受者和孕妇，导致严重的健康状况，即弓形虫病。另一种主要的原生动物犬 新孢子虫与 刚地弓形 虫有许多相似之处，可导致动物患上严重疾病，狗和牛的脑脊髓炎和肌炎-多发性神经根炎也是如此，导致死产小牛。所有这些都表现出相似的核苷三磷酸水解酶 （NTPase）。 犬新孢子虫 具有 NcNTP 酶，而 刚地弓形虫 具有 TgNTPase-I。这些酶被认为在繁殖和生存中起着至关重要的作用。为了建立防止原生动物感染的化合物和/或提取物，我们将这些酶靶向用于药物发现。下一步是通过将常规生化酶测定与荧光测定相结合来确定 ADP 含量，从而建立一种新颖、高灵敏度和高精度的测定方法。我们还验证了这种新型检测方法符合在两种原生动物酶中进行高通量筛选 （HTS） 的标准。我们进行了 HTS，分别从两个合成化合物库和一个来自海洋细菌的提取物库中鉴定了 19 种化合物和 6 种提取物。在本研究中，对如何进行 HTS 进行了详细说明，包括有关试剂、设备、机械臂等的制备信息。

引言

机器人技术已被确立为在工业和制造工程以外的各个领域实现重大突破的复杂而强大的工具，例如生物化学、分子生物学和临床研究，尤其是 HTS 1,2,3。刚地弓形虫是一种主要的寄生虫和单细胞寄生真核生物4（to-cell parasitic eukaryote），它会导致人类5（human）和许多恒温动物4（homethermal animals）出现严重的健康问题，导致感染导致弓形虫病（Toxoplasmosis），弓形虫病在艾滋病患者6（AIDS patients）、器官移植受者7（organ transplant holders）和孕妇8（Pregnant states）中尤为严重。属于顶复门 9 （Phylum Apicomplexa） 的犬新孢子虫 （Neospora caninum） 主要感染狗和牛6 （bull），导致狗 10,11 患上脑脊髓炎和肌炎-多发性神经根炎（Myositis-Polyradiculitis） 和牛流产12,13 （13）。此外，犬新孢子虫 （Neospora caninum） 在形态和系统发育上与刚地弓形虫 （Toxoplasma gondii） 非常相似 9,14。此外，它们还具有核苷三磷酸水解酶 （NTPase;EC3.6.1.15）14.这些酶与传统的胞外 ATP 酶14 完全不同。这些寄生虫产生大量的 NTPase 蛋白，占总蛋白的 2%-8%，并在其速殖子阶段15 中作为休眠酶发挥重要作用。应该注意的是，在致密的分泌颗粒中，这些颗粒缩合16 并分泌到寄生液泡16 中。作为一种生化酶特性，NTP 酶被二硫苏糖醇17 激活。据预测，诱导剂（如二硫醇化合物）、一种未鉴定的酶（如二硫醇-二硫键氧化还原酶）和另一种表现出相同的性质。它们尚未在寄生虫中被鉴定出来。然而，该酶在从受感染的宿主细胞中释放速殖子方面确实起着重要作用17。

刚地弓形虫有两种 NTP 酶同工型18：I 型酶 TgNTPase-I 和 II 型酶 TgNTPase-II18。前者优先利用三磷酸核苷作为底物18。后者水解三磷酸和二磷酸核苷18。氨基酸水平的同源性为 97%18。犬新孢子虫也具有名为 NcNTPase19 的 TgNTPase-I 直系同源物。氨基酸水平的同源性为 73%19。Asai 教授和 Harada 教授使用大肠杆菌生成了两种 NTP 酶的重组体。并改变了这些重组体，如以前报道的那样20。他们好心地送给了这两个活跃的变种人。两种酶都可以在体外将 ATP 转化为 ADP 20。最近，我们使用酶水解的 ADP 含量测量了 NTPase 的活性。最后，我们通过荧光和酶反应的组合测定 ADP 含量的过程成功地建立了高标准测定法，如前所述 21,22。我们还进行了高通量筛选 （HTS）22。

本研究介绍了一种新的高精度和动态范围测定21 的详细程序，并详细说明了如何使用用于 HTS 的机械臂制备试剂来测量酶活性和产生荧光强度。

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研究方案

1. 重组 TgNTPase-I 和 NcNTPase 的表达和纯化

  1. 制备表达质粒并将其引入 大肠杆菌中。 菌株 BL21。
    注意：有关结构和程序的详细信息显示在之前的报告14 中。在这项研究中，TgNTPase-I 和 NcNTPase 组成型活性突变体均由 Asai 教授和 Harada 教授慷慨赠送。

2. 制备生物荧光反应溶液并将其放置在板上

  1. 如 表 1 所述，制备 2x 生物荧光反应溶液，用于 2 mL 预混液，用于 384 孔形式的 400 孔测定。
  2. 使用蒸馏水 （DW） 制备每种指定浓度的储备液，刃天青和 N-乙基马来酰亚胺除外。用适当浓度的 DMSO 溶解其余两种试剂。然后，将试剂储存在 -30 °C 直至进行实验的时间。
  3. 向 368 个孔（384 孔格式）中的每个孔中加入 15 μL 2x 生物荧光反应溶液。
    注意：第一个板用作储液器，有足够的试剂进行两次实验。

3. 将测试化合物或提取物放在检测板的每个孔的底部

  1. 使用文库母板上的机械臂将 0.5 μL 每种化合物（包括测试化合物）放在板底部。
  2. 向阴性对照和阳性对照中加入 0.5 μL DMSO。

4. 酶反应混合物的制备和反应的开始

  1. 如 表 2 所示制备酶反应溶液。
  2. 将 NTP 酶（终浓度为 0.0002 μg/mL）添加到 50 mL 酶反应混合物中，快速混合并转移到塑料储液槽中。
  3. 继续使用机械臂将 4.5 μL 同时注入每个孔中，阴性对照线除外。
  4. 加入等量的酶反应混合物与 PBS，而不是同时注射前的酶。
  5. 将板置于 37 °C 的培养箱中 10 分钟。

5. 使用酶标仪实时测量酶活性

  1. 孵育 10 分钟后，立即使用机械臂向每个孔中同时添加 5 μL 2x 生物荧光反应溶液。
  2. 暂时停止机械臂，将每个尖端的溶液保持在要放置板的位置上。
  3. 检测板就位后，重新启动机械臂。
    注：为避免生成的 ADP 饱和，请立即测量荧光强度。
  4. 快速旋转（200 x g 1 分钟）板，然后将板放入读板器中。
  5. 开始每分钟 540 nm/590 nm（激发/发射）的荧光实时测量，持续 1 小时。

6. 结果分析

  1. 从每个实验组中指示±复制的样品中计算平均值标准误差的值;重复实验以确保一致性。
  2. 使用学生 t 检验执行统计显著性。
  3. 如果 P 值为 P < 0.05，则计算值为统计显著性值。
  4. 使用以下公式计算信噪比 （S/B）、信噪比 （S/N） 和 Z' 因子：
    S/B = 平均配体/平均载体
    S/N =（平均配体 - 平均载体）/标准差载体
    Z'因子 = 1 - （3 x 标准差配体 + 标准差载体）/（平均配体 - 平均载体）
  5. 确保 S/B、S/N 和 Z' 因子分别大于 3、10 和 0.5。
    注：确认每个实验是否满足先前报告23,24 中所述的足以进行 HTS 的一般标准。

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结果

补充图 1 总结了该测定的原理，并基于之前的报告12,18。该测定法设计为 384 孔格式，如图 1 所示。在盘子上避免了最右边和最左边的线条。然后将最左侧和右侧线旁边的两条线分别用作阴性对照和阳性对照，有或没有酶 （n = 16）。这使得板上的 320 种化合物易于检查。图 1B

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讨论

我们成功地建立了一种新的高动态范围和准确度测定方法，结合了经典酶测定和 ADP 荧光测定，ADP 是通过 ATP 酶的最终产物，包括 Tg 和 Nc ATP 酶22。为了进行 HTS，重要的是该测定具有比经典酶测定更好的 S/B、S/N 和 Z' 因子值15,22。此外，省略了用 HCl 等酸停止酶反应的步骤，并在 1 小时内每分钟对所有孔中的荧?...

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披露声明

作者对这项研究没有经济利益。

致谢

这项工作得到了药物发现、信息学和结构生命科学平台的部分支持，该平台是日本科学振兴会 （JSPS-21K06566） 的科学研究资助 （C）。作者衷心感谢 Asai（庆应义塾大学医学院）和 Harada（京都工业大学）和 Stephen Stratton 分别赠送重组两个 NTPase 活性突变体以及他在准备本手稿中的贡献。

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材料

NameCompanyCatalog NumberComments
12 stage-workstation EDR-384 SXBiotec Co., Ltd.EDR-384SXRobot arm Pippeting system
384 well tipsBiotech Co., Ltd.Custom made
ADP-hexokinaseAsahi Kasei Pharma Co., Ltd.T-92
ATPOriental Yeast, Co, Ltd.45140000
BSAWako Pure Chemical Industries, Ltd.011-15144
Diaphorase-IUnitika Ltd.Di-1
DMSONacalai Tesch, Inc.13406-55
G6P dehydrogenaseOriental Yeast, Co, Ltd.306-50143
GlucoseWako Pure Chemical Industries, Ltd.049-31165
Greiner 384 well micro-plate non-binding shallow well Black#784900
HEPESWako Pure Chemical Industries, Ltd.342-01375
Mg(CH3COO)2Wako Pure Chemical Industries, Ltd.130-00095
NADPOriental Yeast, Co, Ltd.44332000
N-ethylmaleimideWako Pure Chemical Industries, Ltd.056-02062
PHERAstar FSBMG LABTECH JAPAN L.t.d.PHERAstar FSMultimode microplate reader
ResazurinWako Pure Chemical Industries, Ltd.191-07581
Seahorse Labware 384 Well Low profile reservoirsS30022 25/CS
TrisHClWako Pure Chemical Industries, Ltd.W01COBQE-4120
Triton X-100Nacalai Tesch, Inc.35501-02

参考文献

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