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Resumo

As infecções por Toxoplasma gondii e Neospora caninum são encontradas em humanos e animais e levam a sérios problemas de saúde. Os dois parasitas compartilham hidrolases de trifosfato de nucleosídeo semelhantes e desempenham papéis importantes na propagação e sobrevivência. Estabelecemos um ensaio de alto padrão das enzimas que requerem o uso do braço robótico.

Resumo

Os parasitas protozoários infectam humanos e muitos animais de sangue quente. O Toxoplasma gondii, um dos principais parasitas protozoários, é comumente encontrado em pacientes HIV-positivos, receptores de transplante de órgãos e mulheres grávidas, resultando na grave condição de saúde, Toxoplasmose. Outro protozoário importante, Neospora caninum, que tem muitas semelhanças com o Toxoplasma gondii, causa doenças graves em animais, assim como a encefalomielite e a miostite-polirradiculite em cães e vacas, resultando em bezerros natimortos. Todos estes exibiram nucleosídeos trifosfato hidrolases semelhantes (NTPase). Neospora caninum tem uma NcNTPase, enquanto Toxoplasma gondii tem uma TgNTPase-I. Acredita-se que as enzimas desempenhem papéis cruciais na propagação e sobrevivência. A fim de estabelecer compostos e/ou extratos que previnam a infecção por protozoários, direcionamos essas enzimas para a descoberta de medicamentos. O próximo passo foi estabelecer um ensaio novo, altamente sensível e altamente preciso, combinando um ensaio enzimático bioquímico convencional com um ensaio fluorescente para determinar o conteúdo de ADP. Também validamos que o novo ensaio preenche os critérios para realizar triagem de alto rendimento (HTS) nas duas enzimas protozoárias. Realizamos HTS, identificamos 19 compostos e seis extratos de duas bibliotecas de compostos sintéticos e uma biblioteca de extratos derivados de bactérias marinhas, respectivamente. Neste estudo, foi introduzida uma explicação detalhada sobre como realizar o HTS, incluindo informações sobre a preparação de reagentes, dispositivos, braço robótico, etc.

Introdução

A robótica foi estabelecida como ferramentas sofisticadas e poderosas para alcançar avanços significativos em vários campos além da indústria e da engenharia de fabricação, como bioquímica, biologia molecular e pesquisa clínica, e notadamente HTS 1,2,3. O Toxoplasma gondii é um dos principais parasitas e um eucariota parasita unicelular4 que causa sérios problemas de saúde em humanos5 e muitos animais homeotérmicos4, resultando em infecções que levam à toxoplasmose, uma condição particularmente grave em pacientes com AIDS6, receptores de transplante de órgãos7 e mulheres grávidas8. Neospora caninum pertencente ao filo Apicomplexa9 infecta principalmente cães e vacas6, o que resulta em encefalomielite e miosite-polirradiculite em cães10,11 e aborto em vacas12,13. Além disso, Neospora caninum exibe semelhanças morfológicas e filogenéticas próximas de Toxoplasma gondii 9,14. Além disso, eles têm uma nucleosídeo trifosfato hidrolase (NTPase; EC3.6.1.15)14. As enzimas são bastante diferentes da ecto-ATPase14 convencional. Esses parasitas geram uma quantidade considerável de proteínas NTPase, 2% a 8% da proteína total e desempenham um papel importante como enzimas dormentes em seu estágio de taquizoíto15. Deve-se notar que em grânulos secretores densos, estes são condensados16 e secretados no vacúolo parasitóforo16. Como caráter enzimático bioquímico, a NTPase é ativada pelo ditiotreitol17. Prevê-se que os indutores, como o composto ditiol, uma enzima não identificada, como a ditiol-dissulfeto oxidorredutase, e outra exibam a mesma natureza. Eles ainda não foram identificados em parasitas. No entanto, a enzima desempenha um papel importante na liberação de taquizoíto das células hospedeiras infectadas17.

O Toxoplasma gondii possui duas isoformas de NTPase18: enzima tipo I TgNTPase-I e enzima tipo II TgNTPase-II18. O primeiro utiliza preferencialmente nucleosídeos trifosfato como substrato18. Este último hidrolisa os nucleosídeos trifosfato e difosfato18. A homologia é de 97% nos níveis de aminoácidos18. Neospora caninum também tem um ortólogo de TgNTPase-I chamado NcNTPase19. A homologia é de 73% nos níveis de aminoácidos19. O Prof. Asai e o Prof. Harada geraram recombinantes de ambas as NTPase usando E. coli. e alteraram os mutantes constitutivamente ativos destes conforme relatado anteriormente20. Eles gentilmente presentearam os dois mutantes ativos. Ambas as enzimas podem converter ATP em ADP in vitro20. Muito recentemente, medimos a atividade da NTPase usando o conteúdo de ADP hidrolisado pelas enzimas. Finalmente, conseguimos estabelecer o ensaio de alto padrão por meio do processo de determinação do conteúdo de ADP com uma combinação de fluorescência e reação enzimática, conforme relatado anteriormente 21,22. Também fizemos triagem de alto rendimento (HTS)22.

Este estudo apresenta procedimentos detalhados de um novo ensaio de alta precisão e faixa dinâmica21 e uma explicação detalhada sobre como preparar reagentes para medir a atividade enzimática e desenvolver intensidade fluorescente usando um braço robótico para HTS.

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Protocolo

1. Expressão e purificação de TgNTPase-I e NcNTPase recombinantes

  1. Preparar o plasmídeo de expressão e introduzi-lo na E. coli. cepa BL21.
    NOTA: Informações detalhadas sobre construtos e procedimentos são mostradas em um relatório anterior14. Neste estudo, os mutantes TgNTPase-I e NcNTPase constitutivamente ativos foram gentilmente presenteados pelo Prof. Asai e pelo Prof. Harada.

2. Preparação e colocação da solução de reação biofluorescente na placa

  1. Prepare 2x solução de reação biofluorescente conforme descrito na Tabela 1 para 2 mL de master mix para um ensaio de 400 poços no formato de 384 poços.
  2. Preparar soluções-mãe utilizando água destilada (DW) para cada concentração indicada, com excepção da Resazurina e da N-etilmaleimida. Dissolver os dois reagentes restantes com DMSO na concentração adequada. Em seguida, armazenar os reagentes a -30 °C até ao momento de realizar as experiências.
  3. Adicione 15 μL de solução de reação biofluorescente 2x a cada um dos 368 poços (formato de 384 poços).
    NOTA: A primeira placa serve como um reservatório para ter o suficiente do reagente para realizar experimentos duas vezes.

3. Coloque compostos ou extratos de teste no fundo de cada poço na placa de ensaio

  1. Coloque 0,5 μL de cada composto na parte inferior da placa usando um braço robótico da placa-mãe da biblioteca, incluindo compostos de teste.
  2. Adicione 0,5 μL de DMSO ao controle negativo e positivo.

4. Preparação da mistura de reação enzimática e início da reação

  1. Preparar a solução de reacção enzimática como indicado no quadro 2.
  2. Adicione NTPase (a concentração final é de 0,0002 μg / mL) a 50 mL da mistura de reação enzimática, misture rapidamente e transfira para um reservatório de plástico.
  3. Prossiga para injetar simultaneamente 4,5 μL em cada poço, exceto para a linha de controle negativo usando o braço robótico.
  4. Adicione a mesma quantidade da mistura de reação enzimática com PBS em vez da enzima precedida pela injeção simultânea.
  5. Coloque a placa em uma incubadora a 37 °C por 10 min.

5. Realize medições em tempo real de atividades enzimáticas usando um leitor de microplacas

  1. Após 10 minutos de incubação, adicione simultaneamente 5 μL de solução de reação biofluorescente 2x a cada poço imediatamente usando o braço robótico.
  2. Pare temporariamente o braço do robô para segurar a solução em cada ponta sobre o local onde a placa será colocada.
  3. Assim que a placa de ensaio estiver no lugar, reinicie o braço do robô.
    NOTA: Para evitar a saturação do ADP gerado, meça imediatamente a intensidade fluorescente.
  4. Gire rapidamente (200 x g por 1 min) a placa e coloque-a no leitor de placas.
  5. Inicie a medição em tempo real da fluorescência a 540 nm/590 nm (excitação/emissão) a cada minuto durante 1 h.

6. Análise dos resultados

  1. Calcular valores como média ± erro padrão da média (EPM) das amostras indicadas e replicadas em cada grupo experimental; replicar experimentos para garantir consistência.
  2. Realize significância estatística usando um teste t de Student.
  3. Calcule os valores como estatisticamente significativos se os valores de P forem P < 0,05.
  4. Calcule a relação sinal-fundo (S/B), a relação sinal-ruído (S/N) e o fator Z' usando as seguintes fórmulas:
    S/B = Ligante médio/Veículo médio
    S/R = (Ligante médio - Veículo médio)/Veículo com desvio padrão
    Fator Z' = 1 - (3 x ligante de desvio padrão + veículo de desvio padrão)/(Ligante médio - veículo médio)
  5. Certifique-se de que os fatores S/B, S/N e Z' sejam maiores que 3, 10 e 0,5, respectivamente.
    NOTA: Confirme se cada experimento atende ao critério geral suficiente para fazer HTS, conforme declarado em relatórios anteriores 23,24.

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Resultados

Um princípio do ensaio está resumido na Figura Suplementar 1 e baseado em um relatório anterior12,18. O ensaio foi projetado em um formato de 384 poços, conforme mostrado na Figura 1. As linhas extrema-direita e esquerda foram evitadas na placa. As duas linhas próximas às linhas esquerda e direita foram então usadas como controle negativo e controle positivo com ou sem a enzim...

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Discussão

Conseguimos estabelecer um novo ensaio de alta faixa dinâmica e precisão com uma combinação de um ensaio enzimático clássico e um ensaio fluorescente para ADP, que é o produto final através da ATPase, incluindo Tg e Nc ATPase22. Para a realização do HTS, é importante que o ensaio tenha melhores valores de S/B, S/R e fator Z' do que um ensaio enzimático clássico15,22. Além disso, omitir a etap...

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Divulgações

Os autores não têm interesse financeiro neste estudo.

Agradecimentos

Este trabalho foi parcialmente apoiado pela Plataforma para Descoberta de Medicamentos, Informática e Ciências da Vida Estrutural, uma Bolsa de Ajuda para Pesquisa Científica (C) da Sociedade Japonesa para Promoção da Ciência (JSPS-21K06566). Os autores agradecem sinceramente a Asai (Escola de Medicina da Universidade Keio) e Harada (Instituto de Tecnologia de Kyoto) e Stephen Stratton por presentear dois mutantes ativos NTPase recombinantes e sua contribuição na preparação deste manuscrito, respectivamente.

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Materiais

NameCompanyCatalog NumberComments
12 stage-workstation EDR-384 SXBiotec Co., Ltd.EDR-384SXRobot arm Pippeting system
384 well tipsBiotech Co., Ltd.Custom made
ADP-hexokinaseAsahi Kasei Pharma Co., Ltd.T-92
ATPOriental Yeast, Co, Ltd.45140000
BSAWako Pure Chemical Industries, Ltd.011-15144
Diaphorase-IUnitika Ltd.Di-1
DMSONacalai Tesch, Inc.13406-55
G6P dehydrogenaseOriental Yeast, Co, Ltd.306-50143
GlucoseWako Pure Chemical Industries, Ltd.049-31165
Greiner 384 well micro-plate non-binding shallow well Black#784900
HEPESWako Pure Chemical Industries, Ltd.342-01375
Mg(CH3COO)2Wako Pure Chemical Industries, Ltd.130-00095
NADPOriental Yeast, Co, Ltd.44332000
N-ethylmaleimideWako Pure Chemical Industries, Ltd.056-02062
PHERAstar FSBMG LABTECH JAPAN L.t.d.PHERAstar FSMultimode microplate reader
ResazurinWako Pure Chemical Industries, Ltd.191-07581
Seahorse Labware 384 Well Low profile reservoirsS30022 25/CS
TrisHClWako Pure Chemical Industries, Ltd.W01COBQE-4120
Triton X-100Nacalai Tesch, Inc.35501-02

Referências

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  4. Dubey, J. P. Toxoplasmosis of Animals and Man. , CRC Press. Boca Raton, FL, USA. (1988).
  5. Michael, C., Sneller, H., Clifford, L. Infections in the Immunocompromised Host in Clinical Immunology., 3rd ed. , Elsevirer. Amsterdam, The Netherlands. (2008).
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  24. Zhang, J. H., Chung, T. D. Y., Oldenburg, K. R. A simple statistical parameter for use in evaluation and validation of high throughput screening assays. Journal of Biomolecular Screening. 4, 67-73 (1999).
  25. Nakajima-Nakano, K., Makioka, A., Yamashita, N., Matsuo, N., Asai, T. Evaluation of serodiagnosis of toxoplasmosis by using the recombinant nucleoside triphosphate hydrolase isoforms expressed in Escherichia coli. Parasitology International. 48, 215-222 (2000).

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