Nukleosidtriphosphat-Hydrolasen-Assay in Toxoplasma gondii und Neospora caninum für das Hochdurchsatz-Screening mit einem Roboterarm

Zusammenfassung

Infektionen mit Toxoplasma gondii und Neospora caninum kommen bei Menschen und Tieren vor und führen zu ernsthaften gesundheitlichen Problemen. Die beiden Parasiten teilen sich ähnliche Nukleosidtriphosphat-Hydrolasen und spielen eine wichtige Rolle bei der Vermehrung und dem Überleben. Wir haben einen High-Standard-Assay der Enzyme etabliert, die den Einsatz von Roboterarmen erfordern.

Zusammenfassung

Protozoen-Parasiten infizieren den Menschen und viele warmblütige Tiere. Toxoplasma gondii, ein wichtiger Protozoen-Parasit, kommt häufig bei HIV-positiven Patienten, Empfängern von Organtransplantaten und schwangeren Frauen vor, was zu dem schweren Gesundheitszustand Toxoplasmose führt. Ein weiteres wichtiges Protozoen, Neospora caninum, das viele Ähnlichkeiten mit Toxoplasma gondii aufweist, verursacht bei Tieren schwere Krankheiten, ebenso wie Enzephalomyelitis und Myositis-Polyradikulitis bei Hunden und Kühen, die zu totgeborenen Kälbern führen. Alle diese wiesen ähnliche Nukleosidtriphosphat-Hydrolasen (NTPase) auf. Neospora caninum hat eine NcNTPase, während Toxoplasma gondii eine TgNTPase-I hat. Es wird angenommen, dass die Enzyme eine entscheidende Rolle bei der Vermehrung und dem Überleben spielen. Um Verbindungen und/oder Extrakte zu etablieren, die eine Protozoeninfektion verhindern, haben wir diese Enzyme für die Wirkstoffforschung ins Visier genommen. Der nächste Schritt bestand darin, einen neuartigen, hochsensitiven und hochgenauen Assay zu etablieren, indem ein konventioneller biochemischer Enzymassay mit einem Fluoreszenzassay kombiniert wurde, um den ADP-Gehalt zu bestimmen. Wir haben auch validiert, dass der neuartige Assay die Kriterien für die Durchführung eines Hochdurchsatz-Screenings (HTS) in den beiden Protozoen-Enzymen erfüllt. Wir führten HTS durch und identifizierten 19 Verbindungen und sechs Extrakte aus zwei synthetischen Wirkstoffbibliotheken bzw. einer Extraktbibliothek aus Meeresbakterien. In dieser Studie wurde eine detaillierte Erklärung zur Durchführung von HTS eingeführt, einschließlich Informationen über die Vorbereitung von Reagenzien, Geräten, Roboterarm usw.

Einleitung

Die Robotik hat sich als hochentwickeltes und leistungsfähiges Werkzeug etabliert, um bedeutende Durchbrüche in verschiedenen Bereichen jenseits der Industrie und der Fabrikationstechnik zu erzielen, wie z. B. Biochemie, Molekularbiologie und klinische Forschung, insbesondere HTS ^1,2,3. Toxoplasma gondii ist ein wichtiger Parasit und ein einzelliger parasitärer Eukaryot⁴, der beim Menschen⁵ und vielen homöothermen Tieren⁴ ernsthafte Gesundheitsprobleme verursacht, was zu Infektionen führt, die zu Toxoplasmose führen, einer besonders schweren Erkrankung bei AIDS-Patienten⁶, Organtransplantierten⁷ und schwangeren Frauen⁸. Neospora caninum, die zum Stamm Apicomplexa⁹ gehört, infiziert hauptsächlich Hunde und Kühe⁶, was bei Hunden zu Enzephalomyelitis und Myositis-Polyradikulitis^{führt 10,11} und bei Kühen zu Aborten^12,13. Darüber hinaus weist Neospora caninum morphologische und phylogenetisch große Ähnlichkeiten mit Toxoplasma gondii^{auf 9,14}. Zusätzlich verfügen sie über eine Nukleosidtriphosphathydrolase (NTPase; EC3.6.1.15)¹⁴. Die Enzyme unterscheiden sich deutlich von der herkömmlichen Ekto-ATPase¹⁴. Diese Parasiten erzeugen eine beträchtliche Menge an NTPase-Proteinen, 2%-8% des Gesamtproteins und spielen eine wichtige Rolle als ruhende Enzyme in ihrem Tachyzoitenstadium¹⁵. Es ist zu beachten, dass in dichten sekretorischen Granulaten diese^{kondensiert sind 16} und in die parasitophore Vakuole¹⁶ sezerniert werden. Als biochemischer enzymatischer Charakter wird die NTPase durch Dithiothreitol¹⁷ aktiviert. Es wird vorhergesagt, dass die Induktoren wie die Dithiolverbindung, ein nicht identifiziertes Enzym wie die Dithioldisulfid-Oxidoreduktase und ein weiteres die gleiche Natur aufweisen. Bei Parasiten wurden sie bisher nicht nachgewiesen. Das Enzym spielt jedoch eine wichtige Rolle bei der Freisetzung von Tachyzoit aus infizierten Wirtszellen¹⁷.

Toxoplasma gondii weist zwei NTPase-Isoformen¹⁸ auf: das Typ-I-Enzym TgNTPase-I und das Typ-II-Enzym TgNTPase-II¹⁸. Ersteres verwendet bevorzugt Triphosphatnukleoside als Substrat¹⁸. Letzteres hydrolysiert sowohl Triphosphat- als auch Diphosphatnukleoside¹⁸. Die Homologie beträgt 97% in den Aminosäuregehalten¹⁸. Neospora caninum hat auch einen Ortholog der TgNTPase-I namens NcNTPase¹⁹. Die Homologie beträgt 73% in den Aminosäuregehalten¹⁹. Prof. Asai und Prof. Harada erzeugten Rekombinanten beider NTPase mit Hilfe von E. coli. und veränderten die konstitutiv aktiven Mutanten dieser Mutanten, wie bereits berichtet^{wurde 20}. Sie haben den beiden aktiven Mutanten freundlicherweise ein Geschenk gemacht. Beide Enzyme können ATP in vitro in ADP umwandeln ²⁰. Vor kurzem haben wir die Aktivität der NTPase anhand des ADP-Gehalts gemessen, der von den Enzymen hydrolysiert wird. Schließlich ist es uns gelungen, den High-Standard-Assay durch den Prozess der Bestimmung des ADP-Gehalts mit einer Kombination aus Fluoreszenz und enzymatischer Reaktion zu etablieren, wie bereits berichtet^21,22. Wir haben auch ein Hochdurchsatz-Screening (HTS)²² durchgeführt.

Diese Studie stellt detaillierte Verfahren eines neuartigen hochpräzisen und dynamischen Assays²¹ vor und eine detaillierte Erklärung, wie Reagenzien zur Messung der Enzymaktivität und zur Entwicklung der Fluoreszenzintensität mit einem Roboterarm für HTS hergestellt werden.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protokoll

1. Expression und Aufreinigung der rekombinanten TgNTPase-I und NcNTPase

1. Bereiten Sie das Expressionsplasmid vor und führen Sie es in die E. coli ein. Stamm BL21.
   HINWEIS: Detaillierte Informationen zu Konstrukten und Verfahren wurden in einem früheren Bericht¹⁴ gezeigt. In dieser Studie wurden sowohl TgNTPase-I- als auch NcNTPase-konstitutiv aktive Mutanten freundlicherweise von Prof. Asai und Prof. Harada zur Verfügung gestellt.

2. Vorbereitung und Platzierung der biofluoreszierenden Reaktionslösung auf der Platte

1. Bereiten Sie 2x Biofluoreszenz-Reaktionslösung wie in Tabelle 1 beschrieben für 2 ml Mastermix für einen 400-Well-Assay im 384-Well-Format vor.
2. Herstellung von Stammlösungen mit destilliertem Wasser (DW) für jede angegebene Konzentration mit Ausnahme von Resazurin und N-Ethylmaleimid. Die verbleibenden zwei Reagenzien werden mit DMSO in der entsprechenden Konzentration gelöst. Lagern Sie dann die Reagenzien bei -30 °C, bis die Experimente durchgeführt werden können.
3. Geben Sie 15 μl 2x Biofluoreszenz-Reaktionslösung in jede der 368 Vertiefungen (384-Well-Format).
   HINWEIS: Die erste Platte dient als Reservoir, um genügend Reagenz für die zweimalige Durchführung von Experimenten zu haben.

3. Geben Sie die Testverbindungen oder Extrakte auf den Boden jeder Vertiefung in der Assay-Platte

1. Geben Sie 0,5 μl jeder Verbindung mit einem Roboterarm von der Mutterplatte der Bibliothek auf den Boden der Platte, einschließlich der Testverbindungen.
2. Fügen Sie 0,5 μl DMSO sowohl zur Negativ- als auch zur Positivkontrolle hinzu.

4. Vorbereitung des Enzymreaktionsgemisches und Beginn der Reaktion

1. Die Enzymreaktionslösung wird wie in Tabelle 2 angegeben hergestellt.
2. Geben Sie NTPase (Endkonzentration beträgt 0,0002 μg/ml) zu 50 mL des Enzymreaktionsgemisches, mischen Sie es schnell und geben Sie es in ein Kunststoffreservoir.
3. Fahren Sie fort, mit dem Roboterarm gleichzeitig 4,5 μl in jede Vertiefung zu injizieren, mit Ausnahme der negativen Kontrollleitung.
4. Geben Sie die gleiche Menge des Enzymreaktionsgemisches mit PBS anstelle des Enzyms, dem die gleichzeitige Injektion vorausging.
5. Stellen Sie die Platte für 10 min bei 37 °C in einen Inkubator.

5. Durchführung von Echtzeitmessungen enzymatischer Aktivitäten mit einem Mikroplatten-Reader

1. Nach 10 Minuten Inkubation gleichzeitig 5 μl 2x Biofluoreszenz-Reaktionslösung sofort mit dem Roboterarm in jede Vertiefung geben.
2. Halten Sie den Roboterarm vorübergehend an, um die Lösung in jeder Spitze über der Stelle zu halten, an der die Platte platziert werden soll.
3. Sobald die Assay-Platte an Ort und Stelle ist, starten Sie den Roboterarm neu.
   HINWEIS: Um eine Sättigung des erzeugten ADP zu vermeiden, messen Sie sofort die Fluoreszenzintensität.
4. Drehen Sie die Platte schnell herunter (200 x g für 1 min) und legen Sie die Platte in den Tellerleser.
5. Starten Sie die Echtzeitmessung der Fluoreszenz bei 540 nm/590 nm (Anregung/Emission) jede Minute für 1 h.

6. Analyse der Ergebnisse

1. Berechnung der Werte als Mittelwert ± Standardfehler des Mittelwerts (SEM) aus den angezeigten und replizierten Stichproben in jeder Versuchsgruppe; Replizieren Sie Experimente, um Konsistenz zu gewährleisten.
2. Führen Sie die statistische Signifikanz mit dem t-Test eines Schülers durch.
3. Berechnen Sie Werte als statistisch signifikant, wenn die P-Werte P < 0,05 sind.
4. Berechnen Sie das Signal-zu-Hintergrund-Verhältnis (S/B), das Signal-Rausch-Verhältnis (S/N) und den Z'-Faktor mit den folgenden Formeln:
   S/B = Durchschnittlicher Ligand/Durchschnittliches Vehikel
   S/N = (Durchschnittlicher Ligand - Durchschnittliches Fahrzeug)/Fahrzeug mit Standardabweichung
   Z'-Faktor = 1 - (3 x Standardabweichung Ligand + Standardabweichung Fahrzeug)/(Durchschnittlicher Ligand - Durchschnittliches Fahrzeug)
5. Stellen Sie sicher, dass der S/B-, S/N- und Z'-Faktor größer als 3, 10 bzw. 0,5 ist.
   HINWEIS: Bestätigen Sie, ob jeder Versuch das allgemeine Kriterium erfüllt, das für die Durchführung von HTS ausreicht, wie in den vorherigen Berichten^23,24 angegeben.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Ergebnisse

Ein Prinzip des Assays ist in der ergänzenden Abbildung 1 zusammengefasst und basiert auf einem früheren Bericht^12,18. Der Assay wurde in einem 384-Well-Format entwickelt, wie in Abbildung 1 dargestellt. Die äußersten rechten und linken Linien wurden auf der Platte vermieden. Die beiden Linien neben der linken und rechten Linie wurden dann als Negativ- bzw. Positivkontrolle mit o...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Diskussion

Es ist uns gelungen, einen neuartigen High-Dynamic-Range- und -Accuracy-Assay mit einer Kombination aus einem klassischen Enzymassay und einem Fluoreszenzassay für ADP zu etablieren, das das Endprodukt durch ATPase ist, einschließlich Tg und Nc^{ATPase 22}. Für die Durchführung von HTS ist es wichtig, dass der Assay bessere Werte für S/B, S/N und Z'-Faktor aufweist als ein klassischer Enzymassay^15,22. Da...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
12 stage-workstation EDR-384 SX	Biotec Co., Ltd.	EDR-384SX	Robot arm Pippeting system
384 well tips	Biotech Co., Ltd.		Custom made
ADP-hexokinase	Asahi Kasei Pharma Co., Ltd.	T-92
ATP	Oriental Yeast, Co, Ltd.	45140000
BSA	Wako Pure Chemical Industries, Ltd.	011-15144
Diaphorase-I	Unitika Ltd.	Di-1
DMSO	Nacalai Tesch, Inc.	13406-55
G6P dehydrogenase	Oriental Yeast, Co, Ltd.	306-50143
Glucose	Wako Pure Chemical Industries, Ltd.	049-31165
Greiner 384 well micro-plate non-binding shallow well Black		#784900
HEPES	Wako Pure Chemical Industries, Ltd.	342-01375
Mg(CH3COO)2	Wako Pure Chemical Industries, Ltd.	130-00095
NADP	Oriental Yeast, Co, Ltd.	44332000
N-ethylmaleimide	Wako Pure Chemical Industries, Ltd.	056-02062
PHERAstar FS	BMG LABTECH JAPAN L.t.d.	PHERAstar FS	Multimode microplate reader
Resazurin	Wako Pure Chemical Industries, Ltd.	191-07581
Seahorse Labware 384 Well Low profile reservoirs		S30022 25/CS
TrisHCl	Wako Pure Chemical Industries, Ltd.	W01COBQE-4120
Triton X-100	Nacalai Tesch, Inc.	35501-02