Dosage des hydrolases de nucléosides triphosphates chez Toxoplasm gondii et Neospora caninum pour le criblage à haut débit à l’aide d’un bras robotisé

Résumé

Les infections à Toxoplasma gondii et Neospora caninum sont présentes chez les humains et les animaux et entraînent de graves problèmes de santé. Les deux parasites partagent des hydrolases nucléosidiques triphosphates similaires et jouent un rôle important dans la propagation et la survie. Nous avons établi un test de haute qualité des enzymes nécessitant l’utilisation d’un bras robotisé.

Résumé

Les parasites protozoaires infectent les humains et de nombreux animaux à sang chaud. Toxoplasma gondii, un parasite protozoaire majeur, est couramment trouvé chez les patients séropositifs, les receveurs de greffes d’organes et les femmes enceintes, entraînant un grave problème de santé, la toxoplasmose. Un autre protozoaire majeur , Neospora caninum, qui présente de nombreuses similitudes avec Toxoplasma gondii, provoque des maladies graves chez les animaux, tout comme l’encéphalomyélite et la myosite-polyradiculite chez les chiens et les vaches, entraînant des veaux mort-nés. Tous ces derniers présentaient des nucléosides triphosphate hydrolases (NTPase) similaires. Neospora caninum a une NcNTPase, tandis que Toxoplasma gondii a une TgNTPase-I. On pense que les enzymes jouent un rôle crucial dans la propagation et la survie. Afin d’établir des composés et/ou des extraits prévenant l’infection par des protozoaires, nous avons ciblé ces enzymes pour la découverte de médicaments. L’étape suivante a consisté à établir un nouveau test très sensible et très précis en combinant un test enzymatique biochimique conventionnel avec un test fluorescent pour déterminer la teneur en ADP. Nous avons également validé que le nouveau test répond aux critères permettant d’effectuer un criblage à haut débit (HTS) dans les deux enzymes protozoaires. Nous avons effectué une HTS, identifié 19 composés et six extraits de deux banques de composés synthétiques et d’une bibliothèque d’extraits dérivés de bactéries marines, respectivement. Dans cette étude, une explication détaillée a été introduite sur la façon de réaliser les SHD, y compris des informations sur la préparation des réactifs, des dispositifs, du bras du robot, etc.

Introduction

La robotique s’est imposée comme un outil sophistiqué et puissant permettant de réaliser des percées significatives dans divers domaines au-delà de l’industrie et de l’ingénierie de fabrication, tels que la biochimie, la biologie moléculaire et la recherche clinique, et notamment HTS ^1,2,3. Toxoplasma gondii est un parasite majeur et un eucaryote parasite unicellulaire⁴ qui cause de graves problèmes de santé chez les humains⁵ et de nombreux animaux homéothermes⁴, entraînant des infections conduisant à la toxoplasmose, une maladie particulièrement grave chez les patients atteints du sida⁶, les receveurs de greffes d’organes⁷ et les femmes enceintes⁸. Neospora caninum appartenant à l’embranchement Apicomplexa⁹ infecte principalement les chiens et les vaches⁶, ce qui entraîne une encéphalomyélite et une myosite-polyradiculite chez les chiens^10,11 et un avortement chez les vaches^12,13. De plus, Neospora caninum présente des similitudes morphologiques et phylogénétiques étroites avec Toxoplasma gondii ^9,14. De plus, ils ont une nucléoside triphosphate hydrolase (NTPase ; EC3.6.1.15)¹⁴. Les enzymes sont très différentes de l’ecto-ATPase¹⁴ conventionnelle. Ces parasites génèrent une quantité considérable de protéines NTPase, soit 2 à 8 % de la protéine totale et jouent un rôle important en tant qu’enzymes dormantes au stade¹⁵ de tachyzoïte. Il convient de noter que dans les granules sécrétoires denses, ceux-ci sont condensés¹⁶ et sécrétés dans la vacuole parasitophore¹⁶. En tant que caractère enzymatique biochimique, la NTPase est activée par le dithiothréitol¹⁷. Il est prédit que les inducteurs tels que le composé dithiol, une enzyme non identifiée telle que la dithiol-disulfure oxydoréductase et une autre présentent la même nature. Ils n’ont pas encore été identifiés chez les parasites. Cependant, l’enzyme joue un rôle important dans la libération de tachyzoïte à partir des cellules hôtes infectées¹⁷.

Toxoplasma gondii possède deux isoformes de la NTPase¹⁸ : l’enzyme de type I TgNTPase-I et l’enzyme de type II TgNTPase-II¹⁸. Le premier utilise préférentiellement des nucléosides triphosphates comme substrat¹⁸. Ce dernier hydrolyse à la fois les nucléosides triphosphate et diphosphate¹⁸. L’homologie est de 97 % dans les niveaux^{d’acides aminés 18}. Neospora caninum a également un orthologue de TgNTPase-I nommé NcNTPase¹⁹. L’homologie est de 73 % dans les niveaux d’acides aminés¹⁹. Le professeur Asai et le professeur Harada ont généré des recombinants de la NTPase à l’aide d’E. coli. et ont modifié les mutants constitutivement actifs de ceux-ci, comme indiqué précédemment²⁰. Ils ont gentiment offert les deux mutants actifs. Les deux enzymes peuvent convertir l’ATP en ADP in vitro²⁰. Très récemment, nous avons mesuré l’activité de la NTPase en utilisant le contenu en ADP hydrolysé par les enzymes. Enfin, nous avons réussi à établir le test de haute qualité grâce au processus de détermination de la teneur en ADP avec une combinaison de fluorescence et de réaction enzymatique, comme indiqué précédemment^21,22. Nous avons également effectué des contrôles à haut débit (HTS)^22.

Cette étude présente les procédures détaillées d’un nouveau test de haute précision et de plage dynamique²¹ et une explication détaillée de la façon de préparer les réactifs pour mesurer l’activité enzymatique et développer l’intensité fluorescente à l’aide d’un bras robotique pour HTS.

Protocole

1. Expression et purification de la TgNTPase-I et de la NcNTPase recombinantes

1. Préparez le plasmide d’expression et introduisez-le dans E . coli. souche BL21.
   REMARQUE : Des renseignements détaillés sur les concepts et les procédures figurent dans un rapport précédent¹⁴. Dans cette étude, les mutants constitutivement actifs TgNTPase-I et NcNTPase ont été gracieusement offerts par le professeur Asai et le professeur Harada.

2. Préparation et placement de la solution réactionnelle biofluorescente sur la plaque

1. Préparer 2 solutions réactionnelles biofluorescentes comme décrit au tableau 1 pour 2 mL de mélange maître pour un essai à 400 puits en format à 384 puits.
2. Préparer des solutions mères à l’aide d’eau distillée pour chaque concentration indiquée, à l’exception de la résazurine et du N-éthylmaléimide. Dissoudre les deux réactifs restants avec du DMSO à la concentration appropriée. Ensuite, conservez les réactifs à -30 °C jusqu’au moment de réaliser les expériences.
3. Ajouter 15 μL de solution réactionnelle biofluorescente 2x dans chacun des 368 puits (format 384 puits).
   REMARQUE : La première plaque sert de réservoir pour avoir suffisamment de réactif pour mener des expériences deux fois.

3. Placez les composés ou extraits d’essai au fond de chaque puits de la plaque d’essai.

1. Déposer 0,5 μL de chaque composé sur le fond de la plaque à l’aide d’un bras robotique provenant de la plaque mère de la bibliothèque, y compris les composés d’essai.
2. Ajouter 0,5 μL de DMSO aux témoins négatifs et positifs.

4. Préparation du mélange de réaction enzymatique et début de la réaction

1. Préparez la solution de réaction enzymatique comme indiqué dans le tableau 2.
2. Ajouter la NTPase (concentration finale de 0,0002 μg/mL) à 50 mL du mélange de réaction enzymatique, mélanger rapidement et transférer dans un réservoir en plastique.
3. Procéder à l’injection simultanée de 4,5 μL dans chaque puits, à l’exception de la ligne de contrôle négative à l’aide du bras du robot.
4. Ajouter la même quantité du mélange de réaction enzymatique avec du PBS au lieu de l’enzyme précédée de l’injection simultanée.
5. Placez la plaque dans un incubateur à 37 °C pendant 10 min.

5. Effectuer une mesure en temps réel des activités enzymatiques à l’aide d’un lecteur de microplaques

1. Après 10 min d’incubation, ajoutez simultanément 5 μL de solution réactionnelle biofluorescente 2x dans chaque puits immédiatement à l’aide du bras robotisé.
2. Arrêtez temporairement le bras du robot pour maintenir la solution dans chaque pointe au-dessus de l’endroit où la plaque doit être placée.
3. Une fois la plaque de test en place, redémarrez le bras du robot.
   REMARQUE : Pour éviter la saturation de l’ADP généré, mesurez immédiatement l’intensité fluorescente.
4. Essorez rapidement (200 x g pendant 1 min) la plaque et placez la plaque dans le lecteur de plaques.
5. Démarrez la mesure en temps réel de la fluorescence à 540 nm/590 nm (excitation/émission) toutes les minutes pendant 1 h.

6. Analyse des résultats

1. Calculer les valeurs comme la moyenne ± l’erreur type de la moyenne (SEM) à partir des échantillons indiqués et répétés dans chaque groupe expérimental ; Reproduire les expériences pour assurer la cohérence.
2. Effectuez une signification statistique à l’aide d’un test t de Student.
3. Calculez les valeurs comme statistiquement significatives si les valeurs P sont P < 0,05.
4. Calculez le rapport signal/bruit (S/B), le rapport signal/bruit (S/N) et le facteur Z' à l’aide des formules suivantes :
   S/B = Ligand moyen/Véhicule moyen
   S/N = (Ligand moyen - Véhicule moyen)/Écart-type véhicule
   Facteur Z' = 1 - (3 x Ligand d’écart type + Véhicule d’écart type)/(Ligand moyen - Véhicule moyen)
5. Assurez-vous que les facteurs S/B, S/N et Z' sont supérieurs à 3, 10 et 0,5, respectivement.
   REMARQUE : Confirmer si chaque expérience satisfait au critère général suffisant pour effectuer le HTS tel qu’indiqué dans les rapports précédents^23,24.

Résultats

Un principe de l’essai est résumé dans la figure supplémentaire 1 et basé sur un rapport précédent^12,18. L’analyse a été conçue dans un format de 384 puits, comme le montre la figure 1. Les lignes d’extrême droite et de gauche ont été évitées sur la plaque. Les deux lignes à côté des lignes les plus à gauche et à droite ont ensuite été utilisées comme cont...

Discussion

Nous avons réussi à établir un nouveau test à haute plage dynamique et à haute précision avec une combinaison d’un test enzymatique classique et d’un test fluorescent pour l’ADP, qui est le produit final par ATPase, y compris Tg et Nc ATPase²². Afin d’effectuer un test HTS, il est important que le test ait de meilleures valeurs de S/B, S/N et du facteur Z' qu’un test enzymatique classique^15,22

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
12 stage-workstation EDR-384 SX	Biotec Co., Ltd.	EDR-384SX	Robot arm Pippeting system
384 well tips	Biotech Co., Ltd.		Custom made
ADP-hexokinase	Asahi Kasei Pharma Co., Ltd.	T-92
ATP	Oriental Yeast, Co, Ltd.	45140000
BSA	Wako Pure Chemical Industries, Ltd.	011-15144
Diaphorase-I	Unitika Ltd.	Di-1
DMSO	Nacalai Tesch, Inc.	13406-55
G6P dehydrogenase	Oriental Yeast, Co, Ltd.	306-50143
Glucose	Wako Pure Chemical Industries, Ltd.	049-31165
Greiner 384 well micro-plate non-binding shallow well Black		#784900
HEPES	Wako Pure Chemical Industries, Ltd.	342-01375
Mg(CH3COO)2	Wako Pure Chemical Industries, Ltd.	130-00095
NADP	Oriental Yeast, Co, Ltd.	44332000
N-ethylmaleimide	Wako Pure Chemical Industries, Ltd.	056-02062
PHERAstar FS	BMG LABTECH JAPAN L.t.d.	PHERAstar FS	Multimode microplate reader
Resazurin	Wako Pure Chemical Industries, Ltd.	191-07581
Seahorse Labware 384 Well Low profile reservoirs		S30022 25/CS
TrisHCl	Wako Pure Chemical Industries, Ltd.	W01COBQE-4120
Triton X-100	Nacalai Tesch, Inc.	35501-02