JoVE Logo
Yazarlar
Bize Ulaşın

Oturum Aç

Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliği gereklidir. Oturum açın veya ücretsiz deneme sürümünü başlatın.

Bu Makalede

  • Özet
  • Özet
  • Giriş
  • Protokol
  • Sonuçlar
  • Tartışmalar
  • Açıklamalar
  • Teşekkürler
  • Malzemeler
  • Referanslar
  • Yeniden Basımlar ve İzinler

Özet

Toxoplasma gondii ve Neospora caninum enfeksiyonları insanlarda ve hayvanlarda bulunur ve ciddi sağlık sorunlarına yol açar. İki parazit benzer nükleosit trifosfat hidrolazlarını paylaşır ve yayılma ve hayatta kalmada önemli roller oynar. Robot kol kullanımı gerektiren enzimlerin yüksek standartlı bir tahlilini oluşturduk.

Özet

Protozoan parazitler insanları ve birçok sıcakkanlı hayvanı enfekte eder. Önemli bir protozoan parazit olan Toxoplasma gondii, HIV pozitif hastalarda, organ nakli alıcılarında ve hamile kadınlarda yaygın olarak bulunur ve bu da ciddi sağlık durumu olan Toksoplazmoz ile sonuçlanır. Toxoplasma gondii ile birçok benzerlik taşıyan bir diğer önemli protozoan olan Neospora caninum, köpeklerde ve Ensefalomiyelit ve Miyozit-Poliradikülit gibi hayvanlarda ciddi hastalıklara neden olarak ölü doğan buzağılara neden olur. Bütün bunlar benzer nükleosit trifosfat hidrolazlar (NTPaz) sergiledi. Neospora caninum'un bir NcNTPase'si varken, Toxoplasma gondii'nin bir TgNTPase-I'i vardır. Enzimlerin yayılma ve hayatta kalmada çok önemli roller oynadığı düşünülmektedir. Protozoan enfeksiyonunu önleyen bileşikler ve / veya ekstraktlar oluşturmak için, bu enzimleri ilaç keşfi için hedefledik. Bir sonraki adım, ADP içeriğini belirlemek için geleneksel bir biyokimyasal enzim testini bir floresan testi ile birleştirerek yeni, oldukça hassas ve son derece hassas bir test oluşturmaktı. Ayrıca, yeni testin iki protozoan enzimde yüksek verimli tarama (HTS) gerçekleştirme kriterlerini karşıladığını da doğruladık. HTS gerçekleştirdik, sırasıyla iki sentetik bileşik kütüphanesinden 19 bileşik ve altı ekstrakt ve deniz bakterilerinden türetilen bir ekstrakt kütüphanesi tanımladık. Bu çalışmada, reaktiflerin, cihazların, robot kolunun vb. hazırlanması hakkında bilgiler de dahil olmak üzere HTS'nin nasıl gerçekleştirileceğine dair ayrıntılı bir açıklama sunulmuştur.

Giriş

Robotik, biyokimya, moleküler biyoloji ve klinik araştırma gibi endüstri ve imalat mühendisliğinin ötesinde çeşitli alanlarda ve özellikle HTS 1,2,3'te önemli atılımlar elde etmek için sofistike ve güçlü araçlar olarak kurulmuştur. Toxoplasma gondii, insanlarda5 ve birçok homeotermik hayvanda 4 ciddi sağlık sorunlarınaneden olan ve AIDS hastalarında6, organ nakli alıcılarında7 ve hamile kadınlarda8 özellikle ciddi bir durum olan Toksoplazmoza yol açan enfeksiyonlara neden olan önemli bir parazit ve tek hücreli bir parazit ökaryottur4. Phylum Apicomplexa9'a ait Neospora caninum esas olarak köpekleri ve6 enfekte eder, bu da köpeklerde Ensefalomiyelit ve Miyozit-Poliradikülit10,11 vekürtaj 12,13 ile sonuçlanır. Ayrıca, Neospora caninum, Toxoplasma gondii 9,14'ün morfolojik ve filogenetik yakın benzerliklerini sergiler. Ek olarak, bir nükleosit trifosfat hidrolaz (NTPase; EC3.6.1.15)14. Enzimler, geleneksel ekto-ATPaz14'ten oldukça farklıdır. Bu parazitler, toplam proteinin %2-8'i olan önemli miktarda NTPaz proteini üretir ve taşizoit evre15'te hareketsiz enzimler olarak önemli bir rol oynar. Yoğun salgı granüllerinde, bunlarınyoğunlaştırıldığına 16 ve parazitohoroz vakuol16'ya salgılandığına dikkat edilmelidir. Biyokimyasal bir enzimatik karakter olarak NTPaz, ditiyotreitol17 ile aktive edilir. Ditiol bileşiği, ditiol-disülfid oksidoredüktaz gibi tanımlanamayan bir enzim ve başka bir enzim gibi indükleyicilerin aynı doğayı sergilediği tahmin edilmektedir. Parazitlerde henüz tanımlanmamıştır. Bununla birlikte, enzim, enfekte konakçı hücrelerden taşizoitin salınmasında önemli bir rol oynar17.

Toxoplasma gondii'nin iki NTPaz izoformu18 vardır: tip I enzim TgNTPase-I ve tip II enzim TgNTPase-II18. İlki, tercihen bir substrat olarak trifosfat nükleositleri kullanır18. İkincisi, hem trifosfat hem de difosfat nükleozitlerinihidrolize eder 18. Amino asit seviyelerindehomoloji %97'dir 18. Neospora caninum ayrıca NcNTPase19 adlı bir TgNTPase-I ortologuna sahiptir. Amino asit seviyelerindehomoloji %73'tür 19. Prof. Asai ve Prof. Harada, E. coli kullanarak her iki NTPaz'ın rekombinantlarını ürettiler ve bunların yapısal olarak aktif mutantlarını daha önce bildirildiği gibi değiştirdiler20. Nezaketle iki aktif mutantı hediye ettiler. Her iki enzim de ATP'yi in vitro 20'de ADP'ye dönüştürebilir. Çok yakın zamanda, enzimler tarafından hidrolize edilen ADP içeriğini kullanarak NTPaz'ın aktivitesini ölçtük. Son olarak, daha önce bildirildiği gibi floresan ve enzimatik reaksiyonun bir kombinasyonu ile ADP içeriğini belirleme süreci yoluyla yüksek standartlı tahlili oluşturmayı başardık21,22. Ayrıca yüksek verimli tarama (HTS) yaptık22.

Bu çalışma, yeni bir yüksek doğruluk ve dinamik aralık testinin21 ayrıntılı prosedürlerini ve HTS için bir robot kolu kullanarak enzim aktivitesini ölçmek ve floresan yoğunluğu geliştirmek için reaktiflerin nasıl hazırlanacağına dair ayrıntılı bir açıklama sunmaktadır.

Protokol

1. Rekombinant TgNTPase-I ve NcNTPase'nin ekspresyonu ve saflaştırılması

  1. Plazmid ifadesini hazırlayın ve E. coli'ye tanıtın.BL21'i süzün.
    NOT: Yapılar ve prosedürler hakkında ayrıntılı bilgi önceki bir rapordagösterilmiştir 14. Bu çalışmada, hem TgNTPase-I hem de NcNTPase yapısal olarak aktif mutantlar Prof. Asai ve Prof. Harada tarafından nazikçe hediye edildi.

2. Biyofloresan reaksiyon çözeltisinin plaka üzerine hazırlanması ve yerleştirilmesi

  1. 384 oyuklu formatta 400 oyuklu bir tahlil için 2 mL ana karışım için Tablo 1'de tarif edildiği gibi 2x biyofloresan reaksiyon çözeltisi hazırlayın.
  2. Resazurin ve N-etilmaleimid hariç, belirtilen her konsantrasyon için damıtılmış su (DW) kullanarak stok çözeltileri hazırlayın. Kalan iki reaktifi DMSO ile uygun konsantrasyonda çözün. Ardından, reaktifleri deneylerin yapılacağı zamana kadar -30 °C'de saklayın.
  3. 368 kuyucuğun her birine (384 kuyu formatı) 15 μL 2x biyofloresan reaksiyon çözeltisi ekleyin.
    NOT: İlk plaka, deneyleri iki kez yürütmek için yeterli reaktife sahip olmak için bir rezervuar görevi görür.

3. Test bileşiklerini veya ekstraktlarını tahlil plakasındaki her bir oyuğun dibine koyun

  1. Test bileşikleri de dahil olmak üzere kütüphane ana plakasından bir robot kolu kullanarak her bir bileşiğin 0.5 μL'sini plakanın altına koyun.
  2. Hem negatif hem de pozitif kontrole 0,5 μL DMSO ekleyin.

4. Enzim reaksiyon karışımının hazırlanması ve reaksiyonun başlaması

  1. Enzim reaksiyon çözeltisini Tablo 2'de verildiği gibi hazırlayın.
  2. 50 mL enzim reaksiyon karışımına NTPaz (Son konsantrasyon 0.0002 μg/mL'dir) ekleyin, hızlı bir şekilde karıştırın ve plastik bir hazneye aktarın.
  3. Robot kolunu kullanarak negatif kontrol hattı dışında her bir kuyucuğa aynı anda 4,5 μL enjekte etmeye devam edin.
  4. Eşzamanlı enjeksiyondan önce gelen enzim yerine PBS ile aynı miktarda enzim reaksiyon karışımı ekleyin.
  5. Plakayı 37 °C'de 10 dakika boyunca bir inkübatöre yerleştirin.

5. Bir mikroplaka okuyucu kullanarak enzimatik aktivitelerin gerçek zamanlı ölçümünü yapın

  1. 10 dakikalık inkübasyondan sonra, robot kolunu kullanarak hemen her bir oyuğa aynı anda 5 μL 2x biyofloresan reaksiyon çözeltisi ekleyin.
  2. Çözeltiyi plakanın yerleştirileceği yerin üzerinde her bir uçta tutmak için robot kolunu geçici olarak durdurun.
  3. Tahlil plakası yerleştirildikten sonra robot kolunu yeniden başlatın.
    NOT: Oluşturulan ADP'nin doygunluğunu önlemek için, floresan yoğunluğunu hemen ölçün.
  4. Plakayı hızlı bir şekilde döndürün (1 dakika boyunca 200 x g ) ve plakayı plaka okuyucuya yerleştirin.
  5. 1 saat boyunca her dakika 540 nm/590 nm'de (uyarma/emisyon) gerçek zamanlı floresan ölçümünü başlatın.

6. Sonuçların analizi

  1. Değerleri, her deney grubundaki belirtilen ± tekrarlanan örneklerden ortalamanın (SEM) ortalama ve standart hatası olarak hesaplayın; Tutarlılığı sağlamak için denemeleri çoğaltın.
  2. Bir Student'ın t-testini kullanarak istatistiksel anlamlılık gerçekleştirin.
  3. P değerleri P < 0,05 ise değerleri istatistiksel olarak anlamlı olarak hesaplayın.
  4. Aşağıdaki formülleri kullanarak Sinyal-Arka Plan oranını (S/B), Sinyal-Gürültü oranını (S/N) ve Z' faktörünü hesaplayın:
    S/B = Ortalama ligand/Ortalama araç
    S/N = (Ortalama ligand - Ortalama araç)/Standart sapma aracı
    Z' faktörü = 1 - (3 x Standart sapma ligandı + Standart sapma aracı)/(Ortalama ligand - Ortalama araç)
  5. S/B, S/N ve Z' faktörünün sırasıyla 3, 10 ve 0,5'ten büyük olduğundan emin olun.
    NOT: Her deneyin, önceki raporlarda23,24 belirtildiği gibi HTS yapmak için yeterli genel kriteri karşılayıp karşılamadığını onaylayın.

Sonuçlar

Tahlilin bir prensibi Ek Şekil 1'de özetlenmiştir ve önceki bir raporadayanmaktadır 12,18. Tahlil, Şekil 1'de gösterildiği gibi 384 oyuklu bir formatta tasarlanmıştır. Plakada en sağ ve sol çizgilerden kaçınıldı. En sol ve sağ çizgilerin yanındaki iki çizgi daha sonra sırasıyla enzim olsun veya olmasın negatif kontrol ve pozitif kontrol olarak kullanıldı (n ...

Tartışmalar

Tg ve Nc ATPase22 dahil olmak üzere ATPase yoluyla son ürün olan ADP için klasik bir enzim testi ve bir floresan testinin bir kombinasyonu ile yeni bir yüksek dinamik aralık ve doğruluk testi oluşturmayı başardık. HTS'yi gerçekleştirmek için, testin klasik bir enzim testinden daha iyi S / B, S / N ve Z' faktörü değerlerine sahip olması önemlidir15,22. Ek olarak, HCl gibi bir asitle enzim...

Açıklamalar

Yazarların bu çalışmada herhangi bir maddi çıkarı yoktur.

Teşekkürler

Bu çalışma kısmen, Japonya Bilimi Teşvik Derneği'nden (JSPS-21K06566) Bilimsel Araştırma için Yardım Hibesi (C) olan İlaç Keşfi, Bilişim ve Yapısal Yaşam Bilimleri Platformu tarafından desteklenmiştir. Yazarlar, Asai'ye (Keio Üniversitesi Tıp Fakültesi) ve Harada'ya (Kyoto Teknoloji Enstitüsü) ve Stephen Stratton'a sırasıyla iki NTPase aktif mutantını rekombinant hediye ettikleri ve bu el yazmasının hazırlanmasındaki katkıları için içtenlikle teşekkür ederler.

Malzemeler

NameCompanyCatalog NumberComments
12 stage-workstation EDR-384 SXBiotec Co., Ltd.EDR-384SXRobot arm Pippeting system
384 well tipsBiotech Co., Ltd.Custom made
ADP-hexokinaseAsahi Kasei Pharma Co., Ltd.T-92
ATPOriental Yeast, Co, Ltd.45140000
BSAWako Pure Chemical Industries, Ltd.011-15144
Diaphorase-IUnitika Ltd.Di-1
DMSONacalai Tesch, Inc.13406-55
G6P dehydrogenaseOriental Yeast, Co, Ltd.306-50143
GlucoseWako Pure Chemical Industries, Ltd.049-31165
Greiner 384 well micro-plate non-binding shallow well Black#784900
HEPESWako Pure Chemical Industries, Ltd.342-01375
Mg(CH3COO)2Wako Pure Chemical Industries, Ltd.130-00095
NADPOriental Yeast, Co, Ltd.44332000
N-ethylmaleimideWako Pure Chemical Industries, Ltd.056-02062
PHERAstar FSBMG LABTECH JAPAN L.t.d.PHERAstar FSMultimode microplate reader
ResazurinWako Pure Chemical Industries, Ltd.191-07581
Seahorse Labware 384 Well Low profile reservoirsS30022 25/CS
TrisHClWako Pure Chemical Industries, Ltd.W01COBQE-4120
Triton X-100Nacalai Tesch, Inc.35501-02

Referanslar

  1. Bianca, C. B., et al. A robotic platform to screen aqueous two-phase systems for overcoming inhibition in enzymatic reactions. Bioresource Technology. 280, 37-50 (2019).
  2. Aliaksei, V., Jan, D. B. Robot-scientists will lead tomorrow's biomaterials discovery. Current Opinion in Biomedical Engineering. 6, 74-80 (2018).
  3. Mandeep, D., Kusum, P., Dharini, P., Nikolaos, E. L., Pratyoosh, S. Robotics for enzyme technology: innovations and technological perspectives. Applied Microbiology and Biotechnology. 105, 4089-4097 (2021).
  4. Dubey, J. P. . Toxoplasmosis of Animals and Man. , (1988).
  5. Michael, C., Sneller, H., Clifford, L. . Infections in the Immunocompromised Host in Clinical Immunology., 3rd ed. , (2008).
  6. Schäfer, G., et al. Immediate versus deferred antiretroviral therapy in HIV-infected patients presenting with acute AIDS-defining events (toxoplasmosis, Pneumocystis jirovecii-pneumonia): A prospective, randomized, open-label multicenter study (IDEAL-study). AIDS Research and Therapy. 16, 34 (2019).
  7. Ramanan, P., et al. Toxoplasmosis in non-cardiac solid organ transplant recipients: A case series and review of literature. Transplant Infectious Disease. 26, 13218 (2019).
  8. Rivera, E. M., et al. Toxoplasma gondii seropositivity associated to peri-urban living places in pregnant women in a rural area of Buenos Aires province, Argentina. Parasite Epidemiology and Control. 7, 00121 (2019).
  9. Donahoe, S. L., Lindsay, S. A., Krockenberger, M., Phalen, D., Šlapeta, J. A review of neosporosis and pathologic findings of Neospora caninum infection in wildlife. International Journal of Parasitology: Parasites and Wildlife. 4, 216-238 (2015).
  10. Crookshanks, J. L., Taylor, S. M., Haines, D. M., Shelton, G. D. Treatment of canine pediatric Neospora caninum myositis following immunohistochemicalidentification of tachyzoites in muscle biopsies. TheCanadian Veterinary Journal. 48, 506-508 (2007).
  11. Bartner, L. R., et al. Testing for Bartonella ssp. DNA in cerebrospinal fluid of dogs with inflammatory central nervous system disease. Journal of Veterinary Internal Medicine. 32, 1983-1988 (2018).
  12. Changoluisa, D., Rivera-Olivero, I. A., Echeverria, G., Garcia-Bereguiain, M. A., de Waard, J. H. Working group "Applied Microbiology" of the School of Biological Sciences and Engineering at Yachay Tech University. Serology for Neosporosis, Q fever and Brucellosis to assess the cause of abortion in two dairy cattleherds in Ecuador. BMC Veterinary Research. 15, 194 (2019).
  13. Serrano-Martínez, M. E., et al. Evaluation of abortions spontaneously induced by Neospora caninum and risk factors in dairy cattle from Lima, Peru. Revista Brasileira de Parasitologia Veterinaria. 28, 215-220 (2019).
  14. Matoba, K., et al. Crystallization and preliminary X-ray structural analysis of nucleoside triphosphate hydrolases from Neospora caninum and Toxoplasma gondii. Acta Crystallographica Section F Structural Biology Communications. 66, 1445-1448 (2010).
  15. Nakaar, V., Beckers, C. J., Polotsky, V., Joiner, K. A. Basis for substrate specificity of the Toxoplasma gondii nucleoside triphosphate hydrolase. Molecular and Biochemical Parasitology. 97, 209-220 (1998).
  16. Pastor-Fernández, I., et al. The tandemly repeated NTPase (NTPDase) from Neospora caninum is a canonical dense granuleprotein whose RNA expression, protein secretion and phosphorylation coincides with the tachyzoite egress. Parasites and Vectors. 9, 352 (2016).
  17. Silverman, J. A., et al. Induced activation of the Toxoplasma gondii nucleoside triphosphate hydrolase leads to depletion of host cell ATP levels and rapid exit of intracellular parasites from infected cells. Journal of Biological Chemistry. 273, 12352-12359 (1998).
  18. Olias, P., Sibley, L. D. Functional analysis of the role of Toxoplasma gondii nucleoside triphosphate hydrolases I and II in acute mouse virulence and immune suppression. Infection and Immunity. 84, 1994-2001 (2016).
  19. Leineweber, M., et al. First Characterization of the Neospora caninum Dense Granule Protein GRA9. BioMed Research International. 2017, 6746437 (2017).
  20. Krug, U., Zebisch, M., Krauss, M., Sträter, N. Structural insight into activation mechanism of Toxoplasma gondii nucleoside triphosphatediphosphohydrolases by disulfide reduction. Journal of Biological Chemistry. 287, 3051-3066 (2012).
  21. Kumagai, K., Kojima, H., Okabe, T., Nagano, T. Development of a highly sensitive, high-throughput assay for glycosyltransferases using enzyme-coupled fluorescence detection. Analytical Biochemistry. , 146-155 (2014).
  22. Harada, M., et al. Establishment of novel high-standard chemiluminescent assay for NTPase in two protozoans and its high-throughput screening. Marine Drugs. 18, 161 (2020).
  23. Kurata, R., et al. Establishment of novel reporter cells stably maintaining transcription factor-driven human secreted alkaline phosphatase expression. Current Pharmaceutical Biotechnology. 19, 224-231 (2018).
  24. Zhang, J. H., Chung, T. D. Y., Oldenburg, K. R. A simple statistical parameter for use in evaluation and validation of high throughput screening assays. Journal of Biomolecular Screening. 4, 67-73 (1999).
  25. Nakajima-Nakano, K., Makioka, A., Yamashita, N., Matsuo, N., Asai, T. Evaluation of serodiagnosis of toxoplasmosis by using the recombinant nucleoside triphosphate hydrolase isoforms expressed in Escherichia coli. Parasitology International. 48, 215-222 (2000).

Yeniden Basımlar ve İzinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya resimlerini yeniden kullanma izni talebi

Izin talebi

Daha Fazla Makale Keşfet

N kleosit Trifosfat HidrolazlarToxoplasma GondiiNeospora CaninumY ksek Verimli TaramaProtozoan Parazitlerla Ke fiNcNTPaseTgNTPase IEnzim TestiFloresan TestiADP eri iHTS Bile ikleriDeniz Bakteri z

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Gizlilik

Kullanım Şartları

İlkeler

Bize Ulaşın

KÜTÜPHANEYE TAVSİYE ET

JoVE HABER BÜLTENLERİ

Araştırma

Eğitim

Yazarlar

Kütüphaneciler

JoVE Hakkında

Telif Hakkı © 2020 MyJove Corporation. Tüm hakları saklıdır