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In questo articolo

  • Riepilogo
  • Abstract
  • Introduzione
  • Protocollo
  • Risultati
  • Discussione
  • Divulgazioni
  • Riconoscimenti
  • Materiali
  • Riferimenti
  • Ristampe e Autorizzazioni

Riepilogo

Le infezioni da Toxoplasma gondii e Neospora caninum si riscontrano nell'uomo e negli animali e portano a gravi problemi di salute. I due parassiti condividono nucleosidi trifosfato idrolasi simili e svolgono un ruolo importante nella propagazione e nella sopravvivenza. Abbiamo stabilito un test di alto livello degli enzimi che richiedono l'uso di un braccio robotico.

Abstract

I parassiti protozoi infettano gli esseri umani e molti animali a sangue caldo. Il Toxoplasma gondii, un importante parassita protozoo, si trova comunemente nei pazienti sieropositivi, nei riceventi di trapianto di organi e nelle donne in gravidanza, causando la grave condizione di salute della toxoplasmosi. Un altro importante protozoo, Neospora caninum, che ha molte somiglianze con il Toxoplasma gondii, causa gravi malattie negli animali, così come l'encefalomielite e la miosite-poliradicolite nei cani e nelle mucche, con conseguente nascita di vitelli morti. Tutti questi presentavano nucleosidi trifosfato idrolasi (NTPasi) simili. Neospora caninum ha una NcNTPasi, mentre Toxoplasma gondii ha una TgNTPasi-I. Si ritiene che gli enzimi svolgano un ruolo cruciale nella propagazione e nella sopravvivenza. Al fine di stabilire composti e/o estratti che prevengano l'infezione da protozoi, abbiamo preso di mira questi enzimi per la scoperta di farmaci. Il passo successivo è stato quello di stabilire un nuovo test, altamente sensibile e altamente accurato, combinando un test enzimatico biochimico convenzionale con un test fluorescente per determinare il contenuto di ADP. Abbiamo anche convalidato che il nuovo test soddisfa i criteri per eseguire lo screening ad alto rendimento (HTS) nei due enzimi protozoari. Abbiamo eseguito l'HTS, identificato 19 composti e sei estratti da due librerie di composti sintetici e una libreria di estratti derivati da batteri marini, rispettivamente. In questo studio, è stata introdotta una spiegazione dettagliata su come eseguire l'HTS, comprese le informazioni sulla preparazione di reagenti, dispositivi, braccio robotico, ecc.

Introduzione

La robotica si è affermata come strumenti sofisticati e potenti per ottenere scoperte significative in vari campi oltre all'industria e all'ingegneria di fabbricazione, come la biochimica, la biologia molecolare e la ricerca clinica, e in particolare HTS 1,2,3. Il Toxoplasma gondii è un importante parassita e un eucariote parassita unicellulare4 che causa seri problemi di salute nell'uomo5 e in molti animali omeotermi4, con conseguenti infezioni che portano alla toxoplasmosi, una condizione particolarmente grave nei pazienti con AIDS6, nei destinatari di trapianti di organi7 e nelle donne in gravidanza8. Neospora caninum appartenente al Phylum Apicomplexa9 infetta principalmente cani e mucche6, provocando encefalomielite e miosite-poliradicolite nei cani10,11 e aborto nelle mucche12,13. Inoltre, Neospora caninum mostra strette somiglianze morfologiche e filogenetiche con Toxoplasma gondii 9,14. Inoltre, hanno un nucleoside trifosfato idrolasi (NTPasi; EC3.6.1.15)14. Gli enzimi sono molto diversi dalla convenzionale ecto-ATPasi14. Questi parassiti generano una notevole quantità di proteine NTPasi, il 2%-8% della proteina totale e svolgono un ruolo importante come enzimi dormienti nel loro stadio tachizoite15. Va notato che nei granuli secretori densi, questi sono condensati16 e secreti nel vacuolo parassitoforo16. Come carattere biochimico enzimatico, la NTPasi è attivata dal ditiotreitolo17. Si prevede che gli induttori come il composto ditiolo, un enzima non identificato come la ditiolo-disolfuro ossidoreduttasi e un altro presentino la stessa natura. Non sono ancora stati identificati nei parassiti. Tuttavia, l'enzima svolge un ruolo importante nel rilascio di tachizoite dalle cellule ospiti infette17.

Il Toxoplasma gondii ha due isoforme18 di NTPasi: l'enzima di tipo I TgNTPasi-I e l'enzima di tipo II TgNTPasi-II18. Il primo utilizza preferenzialmente i nucleosidi trifosfato come substrato18. Quest'ultimo idrolizza sia i nucleosidi trifosfato che quelli difosfato18. L'omologia è del 97% nei livelli di aminoacidi18. Neospora caninum ha anche un ortologo di TgNTPasi-I chiamato NcNTPasi19. L'omologia è del 73% nei livelli di aminoacidi19. Il Prof. Asai e il Prof. Harada hanno generato ricombinanti di entrambe le NTPasi utilizzando E. coli e hanno modificato i mutanti costitutivamente attivi di questi come precedentemente riportato20. Hanno gentilmente regalato i due mutanti attivi. Entrambi gli enzimi possono convertire l'ATP in ADP in vitro20. Molto recentemente, abbiamo misurato l'attività della NTPasi utilizzando il contenuto di ADP idrolizzato dagli enzimi. Infine, siamo riusciti a stabilire il test di alto livello attraverso il processo di determinazione del contenuto di ADP con una combinazione di fluorescenza e reazione enzimatica come precedentemente riportato21,22. Abbiamo anche eseguito lo screening ad alto rendimento (HTS)22.

Questo studio introduce le procedure dettagliate di un nuovo saggio ad alta precisione e a gamma dinamica21 e una spiegazione dettagliata su come preparare i reagenti per misurare l'attività enzimatica e sviluppare l'intensità fluorescente utilizzando un braccio robotico per HTS.

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Protocollo

1. Espressione e purificazione di TgNTPasi-I e NcNTPasi ricombinanti

  1. Preparare il plasmide di espressione e introdurlo nell'E. coli. ceppo BL21.
    NOTA: Informazioni dettagliate su costrutti e procedure sono riportate in un precedente rapporto14. In questo studio, sia i mutanti costitutivamente attivi della TgNTPasi-I che quelli costitutivamente attivi sono stati gentilmente donati dal Prof. Asai e dal Prof. Harada.

2. Preparazione e posizionamento della soluzione di reazione biofluorescente sulla piastra

  1. Preparare 2 soluzioni di reazione biofluorescenti come descritto nella Tabella 1 per 2 mL di miscela master per un saggio a 400 pozzetti in formato a 384 pozzetti.
  2. Preparare le soluzioni madre utilizzando acqua distillata (DW) per ciascuna concentrazione indicata, ad eccezione della Resazurina e della N-etilmaleimmide. Sciogliere i due reagenti rimanenti con DMSO alla concentrazione appropriata. Quindi, conservare i reagenti a -30 °C fino al momento di condurre gli esperimenti.
  3. Aggiungere 15 μl di soluzione di reazione biofluorescente 2x a ciascuno dei 368 pozzetti (formato da 384 pozzetti).
    NOTA: La prima piastra funge da serbatoio per avere abbastanza reagente per condurre esperimenti due volte.

3. Mettere i composti di prova o gli estratti sul fondo di ciascun pozzetto nella piastra di analisi

  1. Mettere 0,5 μl di ciascun composto sul fondo della piastra utilizzando un braccio robotico dalla piastra madre della libreria, compresi i composti di prova.
  2. Aggiungere 0,5 μl di DMSO sia al controllo negativo che a quello positivo.

4. Preparazione della miscela di reazione enzimatica e inizio della reazione

  1. Preparare la soluzione di reazione enzimatica come indicato nella Tabella 2.
  2. Aggiungere NTPasi (la concentrazione finale è 0,0002 μg/mL) a 50 mL della miscela di reazione enzimatica, mescolare rapidamente e trasferire in un serbatoio di plastica.
  3. Procedere all'iniezione simultanea di 4,5 μl in ciascun pozzetto, ad eccezione della linea di controllo negativa, utilizzando il braccio robotico.
  4. Aggiungere la stessa quantità della miscela di reazione enzimatica con PBS invece dell'enzima preceduto dall'iniezione simultanea.
  5. Mettere la piastra in un'incubatrice a 37 °C per 10 minuti.

5. Effettuare misurazioni in tempo reale delle attività enzimatiche utilizzando un lettore di micropiastre

  1. Dopo 10 minuti di incubazione, aggiungere contemporaneamente 5 μl di soluzione di reazione biofluorescente 2x a ciascun pozzetto immediatamente utilizzando il braccio robotico.
  2. Arrestare temporaneamente il braccio del robot per tenere la soluzione in ogni punta sopra la posizione in cui deve essere posizionata la piastra.
  3. Una volta posizionata la piastra di analisi, riavviare il braccio del robot.
    NOTA: Per evitare la saturazione dell'ADP generato, misurare immediatamente l'intensità della fluorescenza.
  4. Ruotare rapidamente verso il basso (200 x g per 1 min) la piastra e posizionare la piastra nel lettore di piastre.
  5. Avviare la misurazione in tempo reale della fluorescenza a 540 nm/590 nm (eccitazione/emissione) ogni minuto per 1 ora.

6. Analisi dei risultati

  1. Calcolare i valori come media ± errore standard della media (SEM) dai campioni indicati e replicati in ciascun gruppo sperimentale; Replicare gli esperimenti per garantire la coerenza.
  2. Eseguire la significatività statistica utilizzando un test t di Student.
  3. Calcola i valori come statisticamente significativi se i valori P sono P < 0,05.
  4. Calcola il rapporto segnale/sfondo (S/B), il rapporto segnale/rumore (S/N) e il fattore Z' utilizzando le seguenti formule:
    S/B = Legante medio/Veicolo medio
    S/N = (Ligando medio - Veicolo medio)/Veicolo a deviazione standard
    Fattore Z' = 1 - (3 x Ligando a deviazione standard + Veicolo a deviazione standard)/(Ligando medio - Veicolo medio)
  5. Assicurarsi che il fattore S/B, S/N e Z' siano rispettivamente superiori a 3, 10 e 0,5.
    NOTA: Confermare se ogni esperimento soddisfa il criterio generale sufficiente per eseguire l'HTS come indicato nei rapporti precedenti23,24.

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Risultati

Un principio del saggio è riassunto nella Figura 1 supplementare e basato su un precedente rapporto12,18. Il test è stato progettato in un formato a 384 pozzetti, come mostrato nella Figura 1. Le linee di estrema destra e sinistra sono state evitate sulla targa. Le due linee accanto alle linee all'estrema sinistra e destra sono state quindi utilizzate rispettivamente come controllo...

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Discussione

Siamo riusciti a stabilire un nuovo test ad alta gamma dinamica e accuratezza con una combinazione di un saggio enzimatico classico e un test fluorescente per ADP, che è il prodotto finale attraverso l'ATPasi, tra cui Tg e Nc ATPasi22. Per eseguire l'HTS, è importante che il test abbia valori migliori di fattore S/B, S/N e Z' rispetto a un classico test enzimatico15,22. Inoltre, omettendo il passaggio di...

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Divulgazioni

Gli autori non hanno alcun interesse finanziario in questo studio.

Riconoscimenti

Questo lavoro è stato in parte sostenuto dalla Piattaforma per la scoperta di farmaci, l'informatica e le scienze strutturali della vita, una sovvenzione per la ricerca scientifica (C) della Japan Society for Promotion of Science (JSPS-21K06566). Gli autori ringraziano sinceramente Asai (Keio University School of medicine) e Harada (Kyoto Institute of Technology) e Stephen Stratton per aver donato rispettivamente due mutanti attivi NTPasi ricombinanti e il suo contributo nella preparazione di questo manoscritto.

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Materiali

NameCompanyCatalog NumberComments
12 stage-workstation EDR-384 SXBiotec Co., Ltd.EDR-384SXRobot arm Pippeting system
384 well tipsBiotech Co., Ltd.Custom made
ADP-hexokinaseAsahi Kasei Pharma Co., Ltd.T-92
ATPOriental Yeast, Co, Ltd.45140000
BSAWako Pure Chemical Industries, Ltd.011-15144
Diaphorase-IUnitika Ltd.Di-1
DMSONacalai Tesch, Inc.13406-55
G6P dehydrogenaseOriental Yeast, Co, Ltd.306-50143
GlucoseWako Pure Chemical Industries, Ltd.049-31165
Greiner 384 well micro-plate non-binding shallow well Black#784900
HEPESWako Pure Chemical Industries, Ltd.342-01375
Mg(CH3COO)2Wako Pure Chemical Industries, Ltd.130-00095
NADPOriental Yeast, Co, Ltd.44332000
N-ethylmaleimideWako Pure Chemical Industries, Ltd.056-02062
PHERAstar FSBMG LABTECH JAPAN L.t.d.PHERAstar FSMultimode microplate reader
ResazurinWako Pure Chemical Industries, Ltd.191-07581
Seahorse Labware 384 Well Low profile reservoirsS30022 25/CS
TrisHClWako Pure Chemical Industries, Ltd.W01COBQE-4120
Triton X-100Nacalai Tesch, Inc.35501-02

Riferimenti

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