使用活性氧敏感荧光探针分析小鼠肠道类器官中的氧化应激

摘要

本方案描述了一种使用定性成像和定量细胞术测定法检测肠道小鼠类器官中活性氧（ROS）的方法。这项工作可以潜在地扩展到其他荧光探针，以测试所选化合物对ROS的影响。

摘要

活性氧（ROS）在肠道稳态中起着至关重要的作用。ROS是细胞代谢的天然副产品。它们是在粘膜水平上对感染或损伤作出反应而产生的，因为它们参与抗菌反应和伤口愈合。它们也是关键的次级信使，调节多种途径，包括细胞生长和分化。另一方面，过量的ROS水平会导致氧化应激，这对细胞有害，有利于肠道疾病，如慢性炎症或癌症。这项工作提供了一种直接的方法，通过使用市售的荧光探针，通过活体成像和流式细胞术检测肠道小鼠类器官中的ROS。在这里，该协议描述了测定调节肠道类器官氧化还原平衡并检测特定肠道细胞类型中的ROS水平的化合物的作用，此处通过分析用GFP遗传标记的肠干细胞来举例说明。该协议可与其他荧光探针一起使用。

引言

活性氧（ROS）是细胞代谢的天然副产物。它们也可以由专门的酶复合物主动产生，例如膜结合的NADPH-氧化酶（NOX）和双氧化酶（DUOX），它们产生超氧阴离子和过氧化氢¹。通过表达抗氧化酶和ROS清除剂，细胞可以微调其氧化还原平衡，从而保护组织稳态²。虽然ROS可能对细胞具有剧毒并破坏DNA，蛋白质和脂质，但它们是至关重要的信号分子²。在肠上皮中，茎和祖细胞增殖需要适度的ROS水平³;高ROS水平导致其凋亡⁴。慢性氧化应激与许多胃肠道疾病有关，例如炎症性肠病或癌症。例如，在Wnt驱动的肠癌小鼠模型中，发现癌细胞增殖需要通过激活NADPH-氧化酶来提高ROS的产生^5，6。定义肠道细胞，特别是干细胞，干细胞如何管理氧化应激以及细胞环境如何影响这种能力对于更好地了解这种疾病的病因^{至关重要7}。

在组织中，不同的细胞类型呈现基底氧化状态，该状态可能根据其功能和代谢以及不同水平的氧化剂和抗氧化剂分子的表达而变化^4，7。 在体内 监测ROS是非常具有挑战性的。已经开发出根据其氧化还原状态发射荧光的细胞渗透染料，以可视化和测量活细胞和动物中的细胞ROS。然而，它们的功效取决于它们在活组织内的扩散和快速读数，使它们难以在动物模型中使用⁸。

过去，化合物对ROS产生的影响的研究是使用细胞系完成的，但这可能无法反映体内情况。由Clevers9小组开发的肠道类器官模型使肠道原代细胞的离体生长成为可能。在存在确定的生长因子的情况下，在基质中培养肠隐窝，导致称为类器官（迷你肠道）的三维结构，其复制隐窝组织，来自不同上皮谱系的细胞排列在内腔内，肠干细胞驻留在小隐窝样突起中。

在这里，利用该模型，描述了一种简单的方法，通过将市售的ROS敏感染料添加到类器官培养基中，以单细胞分辨率研究原代肠细胞中的氧化应激。

读板器通常用于检测总种群中的ROS产量。该协议使用流式细胞术或成像测定来检测具有转基因细胞或特异性抗体染色的特定细胞类型中的ROS。这项工作涉及小鼠肠道类器官培养和通过共聚焦成像和流式细胞术定量的ROS可视化。使用Lgr5-GFP小鼠衍生的小肠类器官，可以特异性分析不同处理后肠干细胞中的氧化应激水平。该协议可用于测试外源分子（例如微生物群衍生的穆拉米基二肽（MDP）¹⁰）在用所选化合物刺激类器官后对ROS平衡的影响。

研究方案

所有动物实验均在巴斯德使用委员会研究所和法国农业部批准后进行，编号为2016-0022。所有步骤都在组织培养罩内进行。

1. 肠道类器官培养试剂和材料的制备

1. 为了制备生长培养基，混合先进的DMEM / F-12补充1x谷氨酰胺，1x青霉素/链霉素（P / S）溶液，10mM的HEPES，50ng / mL的小鼠EGF，20μg/ mL小鼠Noggin 500ng / mL小鼠R-Spondin1（ 见材料表）。在隐窝提取期间将培养基保持在室温（RT）。
   注意:将未使用的培养基在-20°C下以等分试样冷冻。 避免冷冻和解冻。
2. 在 50 mL 试管中加入 40 mL 高级 DMEM/F-12，并将其放在冰上。
   注意:将未使用的培养基保持在4°C。 它将用于类器官的传代。
3. 在37°C下在培养箱中预热细胞培养板（μ-Slide 8孔室和/或96孔圆底）。
4. 在冰上解冻基底膜基质（BMM）（见 材料表）等分试样（在开始方案之前或在电镀隐窝前至少1小时）。
   注意:如果不保持低温，BMM会迅速凝固。
5. 准备洗涤/冲洗溶液，将1%青霉素 - 链霉素溶液添加到DPBS（DPBS-P / S）中。
6. 在 10 mm 培养皿中加入 10 mL 冷 DPBS-P/S.用 10 mL DPBS 填充六个 15 mL 试管，并在 F1 至 F6 之间贴上标签。
7. 通过在DPBS中稀释0.5 M EDTA来制备30 mL的10 mM EDTA溶液。用 10 mL 10 mM EDTA 填充两个 15 mL 试管，并标记它们 E1 和 E2。
8. 将所有溶液预冷至4°C，并在手术过程中将其保持在冰上。

2. 肠道类器官培养

1. 根据国家规章制度，牺牲一只8-10周龄的LGr5-EGFP-IRES-creERT2（Lgr5-GFP）小鼠。
2. 收集5-8厘米的空肠，包括十二指肠（距胃5厘米）和回肠（距盲肠10厘米）之间的区域，并保持在冰上冷的DPBS-P / S中。
3. 通过用5-10毫升冷DPBS-P / S冲洗肠道内容物。
   注意:通过将200 μL吸头插入10 mL注射器喷嘴即可获得自制冲洗注射器。
4. 使用球尖剪刀纵向打开肠道（ 材料表） （以防止损伤组织）。
5. 使用镊子将组织转移到室温下含有冷DPBS-P / S的培养皿中，然后摇动以冲洗。
6. 使用塑料巴斯德移液器，通过抽吸抓住肠道并将其转移到标有 E1 的15 mL管中，该管含有10 mL冷10 mM EDTA。
7. 倒置管子3次，在冰上孵育10分钟。
8. 使用塑料巴斯德移液器，将组织转移到含有10 mL DPBS的管 F1 中。涡旋2分钟（在正常涡旋下，用手握住管子并确保肠道旋转良好）。
9. 将10μL馏分放入培养皿中，并在显微镜下评估馏分的质量。
   注:所有涡旋步骤均以最大速度进行，应在显微镜下评估每个馏分的质量（图1）。
10. 使用塑料巴斯德移液器，通过抽吸抓住肠道并将其转移到含有10 mL DPBS的管 F2 中并涡旋2分钟。
11. 重复步骤2.10，将组织转移到含有10mL DPBS的管 F3 中并涡旋2分钟。
12. 重复EDTA孵育，如步骤2.6所示，将组织转移到含有10mM EDTA的管 E2 中。
13. 倒置管子3次，在冰上孵育5分钟。
14. 重复步骤2.10，将组织转移到含有10mL DPBS的管 F4 中并涡旋3分钟。
15. 重复步骤2.14，将组织转移到含有10mL DPBS的管 F5 中并涡旋3分钟。
16. 重复步骤2.15，将组织转移到含有10mL DPBS的管 F6 中并涡旋3分钟。
17. 通过70μm细胞过滤器将重力过滤的最佳组分组合到50 mL管（冰上）中，以消除绒毛和重要碎屑。
    注意:通常，F5和F6是包含许多隐窝和较少碎片的馏分。
18. 在4°C下以150× g 旋转隐窝3分钟。
19. 清空试管，机械破坏沉淀，并加入5 mL冷DMEM / F12。
20. 将10μL悬浮液放入培养皿中，并在显微镜下手动计算等分试样中存在的隐窝数量。
    注意:不要计算单个细胞或小碎片。
21. 计算以μL为单位所需的隐窝悬浮液的体积（V），考虑到每孔接种300个隐窝，W是孔数，N是10μL悬浮液中计数的隐窝数。将隐窝转移到新的15 mL管中。
    注:V = 300 x W x 10/N。如果在计划的实验中使用小体积，则可以使用1.5 mL离心管。
22. 在4°C下以200× g 旋转隐窝3分钟。
23. 使用移液器小心地除去上清液。
24. 机械破坏沉淀并轻轻加入生长培养基以获得90隐窝/ μL的浓度。
25. 加入2体积未稀释的BMM，最终浓度为30隐窝/ μL。小心地上下移液，不要将气泡引入混合物中。
    注意:始终将管子放在冰上，以避免BMM凝固。
26. 将10μL隐窝/ BMM的板混合到每个孔中。对于流式细胞术分析，使用圆底96孔板。将10μL作为圆顶分布在每个孔的中心。对于成像，使用μ载玻片8孔（见 材料表），并将10μL沉积为薄层。
    注:将类器官作为成像测定的薄层，以实现其深入成像。
27. 将板在室温下放置5分钟，以使BMM凝固。将板置于37°C和5%CO ₂ 的培养箱中15分钟。
28. 向每个孔中加入250μL生长培养基，注意不要分离BMM。
29. 将板置于37°C和5%CO ₂的培养箱中。
30. 在培养的第4天和第6天之间进行ROS分析。否则，在出现几个长萌芽结构以及当死细胞积聚到类器官腔中时，改变培养基并分裂类器官。

3. 类器官传代

1. 从培养^的第 6天开始传代小肠类器官，此时已经形成显着的萌芽结构，并且类器官腔已经变暗。
   注意:由于死细胞，碎片和粘液的积累，类器官的管腔变暗。避免在分裂前让类器官过度生长。分裂比例取决于类器官的生长。建议在第6天以1:2的比例和第10天以1:3的比例传代类器官。
2. 在 15 mL 的试管中加入 4 mL 冷的高级 DMEM/F-12，并将其放在冰上。
   注:这里提供了96孔培养板的体积。如果使用其他格式，请相应地调整音量。
3. 用移液器或真空泵小心地从孔中吸出介质，不要接触BMM圆顶，然后将其丢弃。
4. 每孔加入100μL冷高级DMEM / F-12。上下移液以分解BMM并将孔中的内容物转移到15 mL管中。
5. 用200μL冷高级DMEM / F-12洗涤孔，并将其收集在同一管中。
   注意:如果从相同的实验条件下传导多个孔，则孔的内容物可以汇集在同一个15 mL收集管中。
6. 在4°C下以100 x g 旋转15 mL收集管5分钟。
7. 弃去上清液，向沉淀中加入1mL冷高级DMEM / F-12。使用 P1000 吸头时，拿起 P10 吸头（不带过滤器）并上下移液至少 20 次。
8. 将 4 mL 冷高级 DMEM/F-12 加入试管中。在4°C下以300 x g 旋转5分钟。
9. 用移液管或真空泵吸出上清液，而不会干扰沉淀。然后，机械地破坏颗粒。
10. 加入稀释在生长培养基中的BMM（2:1比例）。小心地上下移液，不要将气泡引入混合物中。
11. 将10μL隐窝/ BMM的板混合到每个孔中。
12. 将板在室温下保持5分钟，以使BMM凝固。将板置于37°C和5%CO ₂ 的培养箱中15分钟。
13. 向每个孔中加入250μL生长培养基。
    注:小心不要拆下 BMM。
14. 将板置于37°C和5%CO ₂的培养箱中。

4. 制备用于评估肠道类器官氧化应激的试剂和材料

1. 制备抑制剂N-乙酰半胱氨酸（NAC）的250mM储备溶液（见 材料表），重悬10mg和245μLDPBS。在1 mM终浓度下使用。
2. 制备50mM诱导剂叔丁基过氧化氢（tBHP）的储备溶液，在水中70%，用496.8μLDPBS稀释3.22μL。在200μM最终浓度下使用。
3. 对于流式细胞术研究，通过将储备溶液稀释在DMSO中1/10来制备250μM荧光探针的工作溶液（见 材料表）。在1μM终浓度下使用。
   注:如制造商说明所示，荧光探头对光和氧气敏感。股票和等分试样不应打开和关闭太多次。
4. 对于成像研究，通过将储备溶液稀释在DMSO中1/2来制备荧光探针的1.25mM工作溶液。在5μM终浓度下使用。
5. 在DPBS中制备0.1μg/ mL DAPI的最终溶液，用于流式细胞术测定中的死细胞鉴别。
6. 将Hoechst 33342稀释至1.25 mg / mL的DPBS。以5μg/ mL终浓度使用，用于成像测定中的核染色。
7. 在37°C下温暖无酚红的DMEM。
   注意:这些步骤描述了使用任何测定中必须包含的阴性和阳性对照，使用 图2A中指示的条件。该测定可用于测试抗氧化或促氧化化合物。步骤是相同的，唯一的区别是在使用荧光染料之前添加化合物的时间。

5. 通过共聚焦显微镜可视化3D类器官中的氧化应激

1. 取在μ-Slide 8孔室中接种的类器官，并在相应的孔中加入1μL NAC储备溶液，以获得1mM的最终浓度。
2. 在37°C和5%CO ₂下孵育1小时。
3. 在相应的孔中加入1μLtBHP储备溶液，以获得200μM的最终浓度。
4. 在37°C和5%CO ₂下孵育30分钟。
5. 每孔加入1.25mM稀释的荧光探针1μL，以获得5μM的最终浓度。
6. 每孔加入1.25 mg / mL稀释的Hoescht，以获得5μg/ mL的最终浓度。
7. 在37°C和5%CO ₂下孵育30分钟。
8. 取出介质，不干扰BMM。轻轻加入250μL不含酚红的温热DMEM。
   注意:如果计划长期收购，请在没有酚红的DMEM中添加生长因子化合物。
9. 使用配备热室和气体供应的共聚焦显微镜对类器官进行成像，该气体供应可检测荧光探针（ROS）。
   注意:荧光探针的激发/发射（ex/em）为644/665，Hoechst（细胞核）的ex/em为361/486，GFP（来自Lgr5-GFP小鼠的肠干细胞）的ex/em为488/510。63x油浸物镜用于检测干细胞中的信号。请勿在样品之间更改激光设置。20倍目标可用于概述ROS生产。
10. 使用正对照设置ROS信号的激光强度和时间暴露，并检查该信号在负极对照中是否较低。
11. 使用目镜筛选载玻片来识别表达的GFP类器官并调整激光强度。
    注意:此步骤是手动执行的。
12. 定义位置以获得整个类器官的拼接图像。设置25μm（步长5μm）的z-stack，以获得显示一层细胞的类器官的一部分。
    注:请参阅显微镜用户手册以优化设置。使用活细胞，采集应在孵育结束后1小时内完成。
13. 在开源图像处理软件中打开图像（请参见 材质表）。
14. 浏览z-stack并选择类器官中间部分，并使用所选区域创建一个新图像。
15. 按照步骤 5.15.1 - 5.15.5 量化图像。
    1. 选择手绘线工具。
    2. 在原子核后面画一条线。
       注意:如果仅分析干细胞，则仅选择显示GFP阳性细胞的区域。
    3. 增加线宽以用线覆盖细胞层，而不包括腔内碎屑。
    4. 选择ROS信号的通道，测量所选区域中的荧光强度并注释值。
    5. 在没有信号的地方画一条线，并测量背景的荧光强度，该荧光强度将被减去到前一个值以获得最终强度。

6. 使用流式细胞仪定量解离类器官上的氧化应激

1. 在孔中加入1μL NAC储备溶液进行阴性对照，以获得1mM的最终浓度。
   注意:使用镀在96孔圆底板中的类器官。
2. 在37°C和5%CO ₂下孵育1小时。
3. 在相应的孔中加入1μLtBHP储备溶液，以获得200μM的最终浓度。
4. 在37°C和5%CO ₂下孵育30分钟。
5. 使用多通道移液器，在不干扰连接的BMM的情况下取出培养基，然后将其转移到另一个96孔圆形底板上。把这个盘子放在一边。
6. 加入100μL胰蛋白酶，并用多通道移液器上下移液至少五次以破坏BMM。
7. 在37°C和5%CO ₂下孵育不超过5分钟。
8. 使用多通道移液器，上下移液至少五次以解离类器官。
9. 在室温下以300 x g 旋转5分钟。
10. 通过倒置板来丢弃上清液。将步骤6.3中收集的培养基重新加入相应的孔中，并通过上下移液5次来重悬细胞。
11. 以1μM的最终浓度加入荧光探针，从250μM稀释液中每孔加入1μL，并在37°C和5%CO ₂下孵育30分钟。
    注意:不要将荧光探头添加到仪器设置所需的孔中（图2B）。
12. 在室温下以300 x g 旋转5分钟。
13. 用250μL0.1μg/ mL DAPI溶液重悬细胞。将样品转移到适当的流式细胞术管中，将试管保持在冰上，然后继续进行分析。
    注意:将PBS而不是DAPI添加到仪器设置所需的孔中（图2B）。
14. 使用单色样品优化未染色控制和激光电极上的正向和侧面散射电压设置。
15. 使用适当的门控策略（图 4A），收集至少 20，000 个事件。
    注意:首选 50，000 个事件。详细的采集设置因所用仪器而异。

结果

作为所述方案的概念证明，从Lgr5-eGFP-IRES-CreERT2小鼠系获得的隐窝被用于其中肠干细胞显示由Barker等人建立的镶嵌GFP表达，以最初表征肠干细胞¹⁰ 并允许基于其GFP表达绘制这些细胞。因此，提供了一个模型来比较不同处理下特定细胞类型群体中的ROS水平。使用ROS抑制剂（NAC）和诱导剂（tBHP），已知其作用于细胞ROS以可视化其水平的变化。

图1A<...

讨论

这项工作提供了一个循序渐进的方案，以分离小鼠空肠隐窝，将其培养成3D类器官，并通过将ROS敏感的荧光探针与整个类器官的定性显微镜成像相结合，并在类器官解离后使用流式细胞术对单个细胞进行定量ROS测量来分析类器官中的ROS。

此方法中的第一个关键步骤是加密提取过程。事实上，隐窝制剂的质量是成功形成类器官的关键。因此，获得具有富集隐窝和少量细胞碎片或...

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Mice
Lgr5-EGFP-IRES-creERT2 (Lgr5-GFP)	The Jackson Laboratory
Growth culture medium
Advanced DMEM F12 (DMEM/F12)	ThermoFisher	12634010
B-27 Supplement, minus vitamin A	ThermoFisher	12587010	Stock Concentration: 50x
GlutaMAX (glutamine)	ThermoFisher	35050038	Stock Concentration: 100x
Hepes	ThermoFisher	15630056	Stock Concentration: 1 M
Murine EGF	R&D	2028-EG-200	Stock Concentration: 500 µg/mL in PBS
murine Noggin	R&D	1967-NG/CF	Stock Concentration: 100 µg/mL in PBS
Murine R-spondin1	R&D	3474-RS-050	Stock Concentration: 50 µg/mL in PBS
N-2 Supplement	ThermoFisher	17502048	Stock Concentration: 100x
Penicillin-Streptomycin (P/S)	ThermoFisher	15140122	Stock Concentration: 100x (10,000 units/mL of penicillin and 10,000 µg/mL of streptomycin)
Material
70 µm cell strainer	Corning	352350
96-well round bottom	Corning	3799
ball tip scissor	Fine Science Tools GMBH	14086-09
CellROX® Deep Red Reagent	ThermoFisher	C10422
DAPI (4’,6-diamidino-2-phénylindole, dichlorhydrate) (fluorgenic probe)	ThermoFisher	D1306	stock at 10 mg/mL
DPBS 1x no calcium no magnesium (DPBS)	ThermoFisher	14190144
FLuoroBrite DMEM (DMEM no phenol red)	ThermoFisher	A1896701
Hoechst 33342	ThermoFisher	H3570	stock at 10 mg/mL
Matrigel Growth Factor Reduced, Phenol Red Free (Basement Membrane Matrix)	Corning	356231	once received thaw o/n in the fridge, keep for 1h on ice and, make 500 mL aliquots and store at -20 °C
µ-Slide 8 Well chambers	Ibidi	80826
N-acetylcysteine (NAC)	Sigma	A9165
tert-Butyl hydroperoxide (tBCHP)solution (70%wt. In H2O2)	Sigma	458139
TrypLE Express Enzyme (1X), no phenol red (trypsin)	ThermoFisher	12604013
UltraPure 0.5 M EDTA, pH8.0	ThermoFisher	15575020
Y-27632	Sigma	Y0503	Rock-inhibitor to be used to minimize cell death upon tissue dissociation
Programs and Equipment
Attune NxT (Flow Cytometer)	ThermoFischer		Flow cytometer analyzer
Fiji/ImageJ	https://imagej.net/software/fiji/downloads		images generation
FlowJo	BD Bioscience		FACS analysis
Observer.Z1	Zeiss		confocal system
Opterra (swept-field confocal)	Bruker		confocal system
high speed EMCCD Camera Evolve Delta 512	Photometrics		confocal system
Prism	GraphPad Software		statistical analysis