使用活性氧敏感荧光探针分析小鼠肠道类器官中的氧化应激

摘要

本方案描述了一种使用定性成像和定量细胞术测定法检测肠道小鼠类器官中活性氧（ROS）的方法。这项工作可以潜在地扩展到其他荧光探针，以测试所选化合物对ROS的影响。

摘要

活性氧（ROS）在肠道稳态中起着至关重要的作用。ROS是细胞代谢的天然副产品。它们是在粘膜水平上对感染或损伤作出反应而产生的，因为它们参与抗菌反应和伤口愈合。它们也是关键的次级信使，调节多种途径，包括细胞生长和分化。另一方面，过量的ROS水平会导致氧化应激，这对细胞有害，有利于肠道疾病，如慢性炎症或癌症。这项工作提供了一种直接的方法，通过使用市售的荧光探针，通过活体成像和流式细胞术检测肠道小鼠类器官中的ROS。在这里，该协议描述了测定调节肠道类器官氧化还原平衡并检测特定肠道细胞类型中的ROS水平的化合物的作用，此处通过分析用GFP遗传标记的肠干细胞来举例说明。该协议可与其他荧光探针一起使用。

引言

活性氧（ROS）是细胞代谢的天然副产物。它们也可以由专门的酶复合物主动产生，例如膜结合的NADPH-氧化酶（NOX）和双氧化酶（DUOX），它们产生超氧阴离子和过氧化氢¹。通过表达抗氧化酶和ROS清除剂，细胞可以微调其氧化还原平衡，从而保护组织稳态²。虽然ROS可能对细胞具有剧毒并破坏DNA，蛋白质和脂质，但它们是至关重要的信号分子²。在肠上皮中，茎和祖细胞增殖需要适度的ROS水平³;高ROS水平导致其凋亡⁴。慢性氧化应激与许多胃肠道疾病有关，例如炎症性肠病或癌症。例如，在Wnt驱动的肠癌小鼠模型中，发现癌细胞增殖需要通过激活NADPH-氧化酶来提高ROS的产生^5，6。定义肠道细胞，特别是干细胞，干细胞如何管理氧化应激以及细胞环境如何影响这种能力对于更好地了解这种疾病的病因^{至关重要7}。

在组织中，不同的细胞类型呈现基底氧化状态，该状态可能根据其功能和代谢以及不同水平的氧化剂和抗氧化剂分子的表达而变化^4，

研究方案

所有动物实验均在巴斯德使用委员会研究所和法国农业部批准后进行，编号为2016-0022。所有步骤都在组织培养罩内进行。

1. 肠道类器官培养试剂和材料的制备

1. 为了制备生长培养基，混合先进的DMEM / F-12补充1x谷氨酰胺，1x青霉素/链霉素（P / S）溶液，10mM的HEPES，50ng / mL的小鼠EGF，20μg/ mL小鼠Noggin 500ng / mL小鼠R-Spondin1（ 见材料表）。在隐窝提取期间将培养基保持在室温（RT）。
   注意：将未使用的培养基在-20°C下以等分试样冷冻。 避免冷冻和解冻。
2. 在 50 mL 试管中加入 40 mL 高级 DMEM/F-12，并将其放在冰上。
   注意：将未使用的培养基保持在4°C。 它将用于类器官的传代。
3. 在37°C下在培养箱中预热细胞培养板（μ-Slide 8孔室和/或96孔圆底）。
4. 在冰上解冻基底膜基质（BMM）（见 材料表）等分试样（在开始方案之前或在电镀隐窝前至少1小时）。
   注意：如果不保持低温，BMM会迅速凝固。
5. 准备洗涤/冲洗溶液，将1%青霉素 - 链霉素溶液添加到DPBS（DPBS-P / S）中。
6. 在 10 mm 培养皿中加入 10 mL 冷 DPBS-P/S.用 10 mL DPBS 填充六个 ....

结果

作为所述方案的概念证明，从Lgr5-eGFP-IRES-CreERT2小鼠系获得的隐窝被用于其中肠干细胞显示由Barker等人建立的镶嵌GFP表达，以最初表征肠干细胞¹⁰ 并允许基于其GFP表达绘制这些细胞。因此，提供了一个模型来比较不同处理下特定细胞类型群体中的ROS水平。使用ROS抑制剂（NAC）和诱导剂（tBHP），已知其作用于细胞ROS以可视化其水平的变化。

图1A<.......

讨论

这项工作提供了一个循序渐进的方案，以分离小鼠空肠隐窝，将其培养成3D类器官，并通过将ROS敏感的荧光探针与整个类器官的定性显微镜成像相结合，并在类器官解离后使用流式细胞术对单个细胞进行定量ROS测量来分析类器官中的ROS。

此方法中的第一个关键步骤是加密提取过程。事实上，隐窝制剂的质量是成功形成类器官的关键。因此，获得具有富集隐窝和少量细胞碎片或.......

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Mice
Lgr5-EGFP-IRES-creERT2 (Lgr5-GFP)	The Jackson Laboratory
Growth culture medium
Advanced DMEM F12 (DMEM/F12)	ThermoFisher	12634010
B-27 Supplement, minus vitamin A	ThermoFisher	12587010	Stock Concentration: 50x
GlutaMAX (glutamine)	ThermoFisher	35050038	Stock Concentration: 100x
Hepes	ThermoFisher	15630056	Stock Concentration: 1 M
Murine EGF	R&D	2028-EG-200	Stock Concentration: 500 µg/mL in PBS
murine Noggin	R&D	1967-NG/CF	Stock Concentration: 100 µg/mL in PBS
Murine R-spondin1	R&D	3474-RS-050	Stock Concentration: 50 µg/mL in PBS
N-2 Supplement	ThermoFisher	17502048	Stock Concentration: 100x
Penicillin-Streptomycin (P/S)	ThermoFisher	15140122	Stock Concentration: 100x (10,000 units/mL of penicillin and 10,000 µg/mL of streptomycin)
Material
70 µm cell strainer	Corning	352350
96-well round bottom	Corning	3799
ball tip scissor	Fine Science Tools GMBH	14086-09
CellROX® Deep Red Reagent	ThermoFisher	C10422
DAPI (4’,6-diamidino-2-phénylindole, dichlorhydrate) (fluorgenic probe)	ThermoFisher	D1306	stock at 10 mg/mL
DPBS 1x no calcium no magnesium (DPBS)	ThermoFisher	14190144
FLuoroBrite DMEM (DMEM no phenol red)	ThermoFisher	A1896701
Hoechst 33342	ThermoFisher	H3570	stock at 10 mg/mL
Matrigel Growth Factor Reduced, Phenol Red Free (Basement Membrane Matrix)	Corning	356231	once received thaw o/n in the fridge, keep for 1h on ice and, make 500 mL aliquots and store at -20 °C
µ-Slide 8 Well chambers	Ibidi	80826
N-acetylcysteine (NAC)	Sigma	A9165
tert-Butyl hydroperoxide (tBCHP)solution (70%wt. In H2O2)	Sigma	458139
TrypLE Express Enzyme (1X), no phenol red (trypsin)	ThermoFisher	12604013
UltraPure 0.5 M EDTA, pH8.0	ThermoFisher	15575020
Y-27632	Sigma	Y0503	Rock-inhibitor to be used to minimize cell death upon tissue dissociation
Programs and Equipment
Attune NxT (Flow Cytometer)	ThermoFischer		Flow cytometer analyzer
Fiji/ImageJ	https://imagej.net/software/fiji/downloads		images generation
FlowJo	BD Bioscience		FACS analysis
Observer.Z1	Zeiss		confocal system
Opterra (swept-field confocal)	Bruker		confocal system
high speed EMCCD Camera Evolve Delta 512	Photometrics		confocal system
Prism	GraphPad Software		statistical analysis