Murine Bağırsak Organoidlerinde Reaktif Oksijen Türlerine Duyarlı Florojenik Prob Kullanılarak Oksidatif Stresin Analizi

Özet

Mevcut protokol, nitel görüntüleme ve nicel sitometri tahlilleri kullanarak bağırsak murine organoidlerindeki reaktif oksijen türlerini (ROS) tespit etmek için bir yöntem tanımlamaktadır. Bu çalışma, seçilen bileşiklerin ROS üzerindeki etkisini test etmek için potansiyel olarak diğer floresan problara genişletilebilir.

Özet

Reaktif oksijen türleri (ROS) bağırsak homeostazında önemli roller oynar. ROS hücre metabolizmasının doğal yan ürünleridir. Antimikrobiyal yanıtlar ve yara iyileşmesinde rol aldıkları için mukozal düzeyde enfeksiyon veya yaralanmaya yanıt olarak üretilirler. Ayrıca, hücre büyümesi ve farklılaşma da dahil olmak üzere çeşitli yolları düzenleyen kritik ikincil habercilerdir. Öte yandan, aşırı ROS seviyeleri, hücreler için zararlı olabilen ve kronik iltihap veya kanser gibi bağırsak hastalıklarını destekleyen oksidatif strese yol açar. Bu çalışma, bağırsak murine organoidlerindeki ROS'yi canlı görüntüleme ve akış sitometrisi ile, piyasada bulunan florojenik bir prob kullanarak tespit etmek için basit bir yöntem sağlar. Burada protokol, bağırsak organoidlerindeki redoks dengesini modüle eden ve GFP ile genetik olarak etiketlenmiş bağırsak kök hücrelerinin analizi ile örneklenen belirli bağırsak hücre tiplerindeki ROS seviyelerini tespit eden bileşiklerin etkisini test etmeyi açıklamaktadır. Bu protokol diğer floresan problarla kullanılabilir.

Giriş

Reaktif oksijen türleri (ROS) hücresel metabolizmanın doğal yan ürünleridir. Ayrıca, süperoksit anion ve hidrojen ^peroksit1 üreten membran bağlı NADPH-Oxidases (NOX) ve Çift Oksidaz (DUOX) gibi özel enzimatik kompleksler tarafından da aktif olarak üretilebilirler. Antioksidan enzimleri ve ROS çöpçülerini ifade ederek, hücreler redoks dengelerini ince bir şekilde ayarlayabilir ve böylece doku homeostazını ^koruyabilir2. ROS hücreler için oldukça toksik olmasına ve DNA, protein ve lipitlere zarar verebilmesine rağmen, çok önemli sinyal molekülleridir2. Bağırsak epitelinde, kök ve progenitör hücre çoğalması için orta derecede ROS seviyeleri ^gereklidir3; yüksek ROS seviyeleri apoptozlarına yol ^açar4. Kronik oksidatif stres, enflamatuar bağırsak hastalıkları veya kanser gibi birçok gastrointestinal hastalıkla bağlantılıdır. Örnek olarak, Wnt güdümlü bağırsak kanserinin bir fare modelinde, NADPH-oksidazların aktivasyonu yoluyla yüksek ROS üretiminin kanser hücrelerinin hiperproliferasyon için gerekli olduğu ^{bulunmuştur5,6}. Bağırsak hücrelerinin, özellikle kök hücrelerin, kök hücrelerin oksidatif stresi nasıl yönettiğini ve hücresel ortamın bu kapasiteyi nasıl etkileyebileceğini tanımlamak, bu hastalığın etiyolojisini daha iyi anlamak için ^gereklidir7.

Bir dokuda, farklı hücre tipleri işlevlerine ve metabolizmalarına ve değişen oksidan ve antioksidan molekül seviyelerinin ifadelerine göre değişebilen bazal oksidatif bir durum ^sunar4,7. Ros in vivo'nun izlenmesi çok zor. Redoks durumlarına göre floresan yayan hücre geçirgen boyaları, canlı hücrelerde ve hayvanlarda hücresel ROS'yi görselleştirmek ve ölçmek için geliştirilmiştir. Bununla birlikte, etkinliği canlı dokuların içindeki difüzyonlarına ve hızlı okumalarına bağlıdır, bu da onları hayvan modellerinde kullanımını ^{zorlaştırır8}.

Geçmişte, bileşiklerin ROS üretimi üzerindeki etkisinin incelenmesi hücre hatları kullanılarak yapılmıştır, ancak bu in vivo durumu yansıtmayabilir. ^Clevers9 grubu tarafından geliştirilen bağırsak organoid modeli, bağırsak birincil hücrelerinin eks vivo büyümesini sağlar. Matrislerdeki bağırsak mahzenleri kültürü, tanımlanmış büyüme faktörlerinin varlığında, kripto-villus organizasyonuni yeniden üreten organoidler (mini bağırsak) adı verilen üç boyutlu yapılara, iç lümeni kaplayan farklı epitel soyundan hücrelere ve küçük mahzen benzeri çıkıntılarda bulunan bağırsak kök hücrelerine yol açar.

Burada, bu modelden yararlanarak, organoid kültür ortamına ticari olarak mevcut bir ROS duyarlı boya ekleyerek birincil bağırsak hücrelerindeki oksidatif stresi tek hücreli çözünürlükte incelemek için basit bir yöntem tanımlanmıştır.

Plaka okuyucular genellikle toplam popülasyonda ROS üretimini tespit etmek için kullanılır. Bu protokol, genetiği değiştirilmiş hücreler veya spesifik antikor lekeleme ile belirli bir hücre tipinde ROS'yi tespit etmek için akış sitometrisi veya görüntüleme testi kullanır. Bu çalışma fare bağırsak organoid kültürünü ve ros görselleştirmeyi konfokal görüntüleme ve akış sitometrisi ile nicelemesini içerir. Lgr5-GFP fare türevi küçük bağırsak organoidlerini kullanarak, farklı tedaviler üzerine bağırsak kök hücrelerindeki oksidatif stres seviyesini özellikle analiz etmek mümkündür. Bu protokol, seçilen bileşiklerle organoidleri uyarladıktan sonra mikrobiyota türevli muramil-dipeptid (MDP)¹⁰ gibi eksojen moleküllerin ROS dengesi üzerindeki etkisini test etmek için uyarlanabilir.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protokol

Tüm hayvan deneyleri, Institut Pasteur Kullanım Komitesi ve 2016-0022 sayılı Fransa Tarım Bakanlığı tarafından onaylandıktan sonra gerçekleştirildi. Tüm adımlar bir doku kültürü başlığı içinde gerçekleştirilir.

1. Bağırsak organoidlerini kültleme için reaktiflerin ve malzemelerin hazırlanması

1. Büyüme kültürü ortamını hazırlamak için, 1x glutamin, 1x penisilin/streptomisin (P/S) çözeltisi, 10 mM HEPES, 50 ng/mL murine EGF, 20 μg/mL murine Noggin 500 ng/mL fare R-Spondin1 ile desteklenmiş gelişmiş DMEM/ F-12'yi karıştırın (bkz. Mahzenin çıkarılması sırasında ortamı oda sıcaklığında (RT) bırakın.
   NOT: Kullanılmayan ortamı -20 °C'de aliquotlarda dondurun. Donmaktan ve çözülmekten kaçının.
2. 50 mL'lik bir tüpü 40 mL Gelişmiş DMEM/F-12 ile doldurun ve buzda tutun.
   NOT: Kullanılmayan ortamı 4 °C'de tutun. Organoidlerin geçmesi için kullanılacaktır.
3. 37 °C'de inkübatörde hücre kültürü plakalarını (μ-Slide 8 kuyu odaları ve/veya 96 kuyu yuvarlak alt) önceden ısıtın.
4. Bodrum membran matrisini (BMM) çözün (bkz. Malzeme Tablosu) buz üzerinde aliquots (protokole başlamadan önce veya mahzenleri kaplamadan önce en az 1 saat).
   NOT: BMM soğuk tutulmazsa hızla katılaşmayacaktır.
5. DPBS'ye (DPBS-P/S) %1 penisilin-streptomisiin çözeltisi ekleyerek yıkama/yıkama solüsyonu hazırlayın.
6. 100 mm petri kabını 10 mL soğuk DPBS-P/S ile doldurun, altı 15 mL tüpü 10 mL DPBS ile doldurun ve F1'den F6'ya etiketleyin.
7. DPBS'de 0,5 M EDTA'dan seyrelterek 30 mL 10 mM EDTA çözeltisi hazırlayın. İki adet 15 mL tüpü 10 mL 10 mM EDTA ile doldurun ve E1 ve E2 olarak etiketleyin.
8. Tüm çözeltileri önceden 4°C'de soğutun ve işlem sırasında buzun üzerinde tutun.

2. Bağırsak organoidleri kültürü

1. Ulusal kural ve yönetmeliklere göre 8-10 haftalık bir Lgr5-EGFP-IRES-creERT2 (Lgr5-GFP) fareyi kurban edin.
2. Duodenum (mideden 5 cm) ve ileum (cecum'dan 10 cm) arasındaki bölgeyi kapsayan jejunumun 5-8 cm'sini toplayın ve soğuk DPBS-P/ S'de buzda tutun.
3. 5-10 mL soğuk DPBS-P/S ile yıkanarak bağırsak içeriğini temizleyin.
   NOT: Ev yapımı yıkama şırıngları, 10 mL'lik bir şırınna nozülüne 200 μL ucu takılarak elde edilebilir.
4. Top ucu makası kullanarak bağırsağı uzunlamasına açın (bkz. Malzeme Tablosu) (dokuya zarar vermemesi için).
5. Torplas kullanarak, dokuyu oda sıcaklığında soğuk DPBS-P/S içeren bir petri kabına aktarın ve durulamak için çalkalayın.
6. Plastik bir Pasteur pipet ile bağırsağı aspirasyonla tutun ve 10 mL soğuk 10 mM EDTA içeren E1 etiketli 15 mL'lik bir tüpe aktarın.
7. Tüpü 3 kez ters çevirin ve 10 dakika boyunca buzda kuluçkaya yatırın.
8. Plastik bir Pasteur pipet kullanarak, dokuyu 10 mL DPBS içeren F1 tüpüne aktarın. 2 dakika boyunca girdap (normal girdapta, tüpü elle tutmak ve bağırsağın güzelce dönmesine izin verir).
9. Fraksiyonun 10 μL'sini bir petri kabına koyun ve fraksiyonun kalitesini mikroskop altında değerlendirin.
   NOT: Tüm girdap adımları maksimum hızda gerçekleştirilir ve her kesir kalitesi mikroskop altında değerlendirilmelidir (Şekil 1).
10. Plastik bir Pasteur pipet ile bağırsağı aspirasyonla tutun ve 10 mL DPBS ve girdap içeren F2 tüpünde 2 dakika aktarın.
11. 10 mL DPBS ve girdap içeren F3 tüpündeki dokuyu 2 dakika boyunca aktararak 2.10 adımını tekrarlayın.
12. 10 mM EDTA içeren E2 tüpündeki dokuyu transfer ederek 2.6.
13. Tüpü 3 kez ters çevirin ve 5 dakika boyunca buzda kuluçkaya yatırın.
14. 10 mL DPBS ve girdap içeren F4 tüpündeki dokuyu 3 dakika boyunca aktararak 2.10 adımını tekrarlayın.
15. 10 mL DPBS ve girdap içeren F5 tüpündeki dokuyu 3 dakika boyunca aktararak 2.14 adımını tekrarlayın.
16. 10 mL DPBS ve girdap içeren F6 tüpündeki dokuyu 3 dakika boyunca aktararak 2.15 adımını tekrarlayın.
17. Villi ve önemli döküntüleri ortadan kaldırmak için yerçekimi ile 70 μm hücre süzgeçleri aracılığıyla süzülen en iyi fraksiyonları 50 mL'lik bir tüpte (buz üzerinde) birleştirin.
    NOT: Genellikle, F5 ve F6 çok sayıda mahzen ve daha az döküntü içeren kesirlerdir.
18. 4 °C'de 150 x g'daki mahzenleri 3 dakika döndürün.
19. Tüpü boşaltın, peletin mekanik olarak bozulacağı ve 5 mL soğuk DMEM/F12 ekleyin.
20. Süspansiyonun 10 μL'sini bir petri kabına koyun ve aliquot'ta bulunan mahzen sayısını mikroskop altında manuel olarak sayın.
    NOT: Tek hücre veya küçük döküntüleri sayma.
21. Kuyu başına 300 mahzenin kaplandığını, W'nun kuyu sayısı olduğunu ve N'nin süspansiyonun 10 μL'sinde sayılan mahzen sayısı olduğunu göz önünde bulundurarak, μL'de gerekli olan mahzen süspansiyonunun hacmini (V) hesaplayın. Mahzenleri yeni bir 15 mL tüpe aktarın.
    NOT: V = 300 x W x 10/N. Planlanan deneyde küçük bir hacim kullanılırsa, 1,5 mL santrifüj tüpü kullanılabilir.
22. 200 x g'daki mahzenleri 4 °C'de 3 dakika döndürün.
23. Bir pipet kullanarak süpernatant dikkatlice çıkarın.
24. Peleti mekanik olarak bozun ve 90 mahzen / μL konsantrasyon elde etmek için büyüme kültürü ortamını hafifçe ekleyin.
25. 30 mahzen/μL'lik son konsantrasyona sahip olmak için 2 hacim sulandırılmamış BMM ekleyin.
    NOT: BMM katılaşmasını önlemek için tüpü her zaman buzda tutun.
26. Her kuyuya 10 μL'lik mahzen/BMM karışımı plakası. Akış sitometrisi analizi için yuvarlak tabanlı 96 kuyu plakaları kullanın. Her birinin ortasına 10 μL ve bir kubbe dağıtın. Görüntüleme için μ-slide 8 kuyusunu kullanın ( bkz. Malzeme Tablosu) ve 10 μL'yi ince bir tabaka olarak biriktirin.
    NOT: Organoidleri, derinlemesine görüntülemelerini sağlamak için görüntüleme testini için ince bir tabaka olarak plakalayın.
27. BMM'nin katılaşmasını sağlamak için plakayı RT'de 5 dakika bekletin. Plakayı 37 °C'de inkübatöre ve 15 dakika boyunca% 5 _CO2'ye yerleştirin.
28. BMM'yi ayırmamaya dikkat ederek her kuyuya 250 μL büyüme ortamı ekleyin.
29. Plakaları 37 °C ve%5 _CO2'de inkübatöre yerleştirin.
30. Ros analizini kültürün 4 ila 6. Aksi takdirde, ortamı değiştirin ve birkaç ve uzun tomurcuklanan yapının ortaya çıkmasından sonra ve ölü hücreler organoid lümenlerine biriktiğinde organoidleri bölün.

3. Organoidler geçiyor

1. Küçük bağırsak organoidlerini, önemli tomurcuklanma yapılarının oluştuğu ve organoidlerin lümenlerinin karanlıklaştığı kültürün ^6.
   NOT: Organoidin lümeni ölü hücrelerin, döküntülerin ve mukusun birikmesi nedeniyle koyulaşır. Organoidlerin bölünmeden önce aşırı büyümesine izin vermekten kaçının. Bölünme oranı organoidlerin büyümesine bağlıdır. Organoidlerin 6. günde 1:2 ve 10. günde 1:3 oranıyla geçmesi önerilir.
2. 15 mL'lik bir tüpü 4 mL soğuk Gelişmiş DMEM/F-12 ile doldurun ve buzda tutun.
   NOT: Burada, 96 kuyulu bir kültür plakası için hacimler sağlanmaktadır. Farklı bir biçim kullanılıyorsa, ses düzeyini buna göre ayarlayın.
3. Ortamı BMM kubbelerine dokunmadan kuyulardan pipet veya vakum pompası ile dikkatlice emiş ve atın.
4. Kuyu başına 100 μL soğuk Gelişmiş DMEM/F-12 ekleyin. BMM'yi kırmak ve kuyunun içeriğini 15 mL'lik tüpe aktarmak için pipet yukarı ve aşağı.
5. Kuyuyu 200 μL soğuk Gelişmiş DMEM/F-12 ile yıkayın ve aynı tüpte toplayın.
   NOT: Aynı deneysel durumdan birden fazla kuyu geçiyorsa, kuyuların içeriği aynı 15 mL toplama tüpünde birikebilir.
6. 15 mL toplama tüpünü 100 x g'da 4°C'de 5 dakika döndürün.
7. Süpernatantı atın ve peletin içine 1mL soğuk Gelişmiş DMEM/F-12 ekleyin. P1000 ucu kullanarak, bir P10 ucu (filtresiz) ve pipetle en az 20 kez yukarı ve aşağı alın.
8. Tüpe 4 mL soğuk Gelişmiş DMEM/F-12 ekleyin. 4°C'de 5 dakika boyunca 300 x g'da döndürün.
9. Peletin rahatsız etmeden bir pipet veya vakum pompası ile süpernatantı aspire edin. Ardından, peletin mekanik olarak bozulması.
10. Büyüme kültürü ortamında seyreltilmiş BMM ekleyin (2:1 oranı). Karışıma hava kabarcıkları sokmadan dikkatlice yukarı ve aşağı pipet.
11. Her kuyuya 10 μL'lik mahzen/BMM karışımı plakası.
12. BMM'nin katılaşmasını sağlamak için plakayı RT'de 5 dakika tutun. Plakayı 37 °C'de inkübatöre ve 15 dakika boyunca% 5 _CO2'ye yerleştirin.
13. Her kuyuya 250 μL büyüme ortamı ekleyin.
    NOT: BMM'yi ayırmamaya dikkat edin.
14. Plakaları 37 °C ve%5 _CO2'de inkübatöre yerleştirin.

4. Bağırsak organoidlerindeki oksidatif stresi değerlendirmek için reaktiflerin ve malzemelerin hazırlanması

1. inhibitör N-asetilsistein (NAC) için 250 mM stok çözeltisi hazırlayın (bkz. Malzeme Tablosu), 245 μL DPBS ile 10 mg'ı yeniden kullanın. 1 mM son konsantrasyonda kullanın.
2. 50 mM'lik bir indükleyici Tert-butil hidroperoksit (tBHP) stok çözeltisi hazırlayın, suda% 70, 496,8 μL DPBS ile 3,22 μL seyreltin. 200 μM son konsantrasyonda kullanın.
3. Akış sitometrisi çalışması için, DMSO'daki stok çözeltisini 1/10 seyrelterek florojenik bir probun 250 μM çalışma çözeltisini hazırlayın (bkz. Malzeme Tablosu). 1 μM son konsantrasyonda kullanın.
   NOT: Üreticinin talimatlarında belirtildiği gibi, florojenik prob ışığa ve oksijene duyarlıdır. Stoklar ve aliquotlar çok fazla açık ve kapalı olmamalıdır.
4. Görüntüleme çalışması için, DMSO'daki stok çözeltisini 1/2 seyrelterek florojenik probun 1,25 mM'lik bir çalışma çözeltisini hazırlayın. 5 μM son konsantrasyonda kullanın.
5. Akış sitometrisi testinde ölü hücre ayrımcılığı için kullanılmak üzere DPBS'de 0,1 μg/mL DAPI nihai bir çözelti hazırlayın.
6. DPBS'de Hoechst 33342 ila 1.25 mg/mL arasında seyreltin. Görüntüleme testinde nükleer boyama için kullanılacak 5 μg/mL son konsantrasyonda kullanın.
7. 37 °C'de fenol kırmızısı olmadan sıcak DMEM.
   NOT: Bu adımlar, Şekil 2A'da belirtilen koşulları kullanarak, herhangi bir tahlilde yer alınması gereken negatif ve pozitif denetimlerin kullanılmasını açıklar. Test, anti-veya pro-oksidan bileşikleri test etmek için kullanılabilir. Adımlar aynıdır ve tek fark, bileşiklerin florojenik boyayı kullanmadan önce eklenmesidir.

5. 3D organoidlerde oksidatif stresin konfokal mikroskopi ile görselleştirilmesi

1. μ-Slide 8 kuyu odalarına kaplanlanmış organoidleri alın ve 1 mM'lik son bir konsantrasyon elde etmek için ilgili kuyulara 1 μL NAC stok çözeltisi ekleyin.
2. 37 °C'de 1 saat kuluçkaya yaslanın ve% 5 _CO2.
3. 200 μM'lik son bir konsantrasyon elde etmek için ilgili kuyulara 1 μL tBHP stok çözeltisi ekleyin.
4. 37 °C ve %5 CO2'de 30 dakika kuluçkaya _yaslanın.
5. 5 μM'lik son bir konsantrasyon elde etmek için florojenik probun 1,25 mM seyreltilmesinin kuyusu başına 1 μL ekleyin.
6. Son konsantrasyonu elde etmek için Hoescht'in 1,25 mg/mL seyreltilmesinin kuyusu başına 1 μL ekleyin.
7. 37 °C ve %5 CO2'de 30 dakika kuluçkaya _yaslanın.
8. BMM'yi bozmadan ortamı çıkarın. Yavaşça, fenol kırmızısı olmadan 250μL ılık DMEM ekleyin.
   NOT: Uzun vadeli bir satın alma planlanıyorsa, fenol kırmızısı olmadan DMEM'e büyüme faktörleri bileşikleri ekleyin.
9. Organoidleri, florojenik probu (ROS) algılayan bir terik oda ve gaz kaynağı ile donatılmış bir konfokal mikroskop kullanarak görüntüleyin.
   NOT: Florojenik prob için eksitasyon/emisyon (ex/em) 644/665, Hoechst (çekirdek) için ex/em 361/486 ve GFP için ex/em (Lgr5-GFP farelerinden bağırsak kök hücresi) 488/510'dur. Kök hücrelerdeki sinyalleri tespit etmek için 63x yağ daldırma hedefi kullanılır. Örnekler arasında lazer ayarlarını değiştirmeyin. ROS üretimine genel bir bakış sağlamak için 20x hedefi kullanılabilir.
10. ROS sinyali için lazer yoğunluğu ve zamana maruz kalma ayarlamak ve bu sinyalin negatif kontrolde daha düşük olup olmadığını kontrol etmek için pozitif kontrolü kullanın.
11. Lazer yoğunluğunu ifade eden GFP organoidlerini tanımlamak ve ayarlamak için slaytı göz merceği ekranı kullanarak.
    NOT: Bu adım el ile gerçekleştirilir.
12. Tüm organoidin dikişli bir görüntüsünü elde etmek için pozisyonları tanımlayın. Organoidlerin bir hücre katmanını gösteren bir bölümünü elde etmek için 25 μm 'lik (adım boyutu 5 μm) bir z yığını kur.
    NOT: Kurulumu optimize etmek için mikroskop kullanım kılavuzuna bakın. Canlı hücreler kullanılarak, inkübasyonun bitiminden sonra 1 saat içinde edinim yapılmalıdır.
13. Görüntüleri açık kaynaklı bir görüntü işleme yazılımında açın (bkz. Malzeme Tablosu).
14. z yığınından geçin ve organoidlerin ortasının iyi temsil edildiği bölümü seçin ve seçilen alanla yeni bir görüntü oluşturun.
15. Görüntüleri 5.15.1 - 5.15.5 adımlarına göre ölçün.
    1. Serbest çizgi aracını seçin.
    2. Çekirdeği takip eden bir çizgi çizin.
       NOT: Yalnızca kök hücreler analiz edilirse, yalnızca GFP pozitif hücreleri sunan bölgeleri seçin.
    3. Işık döküntülerini dahil etmeden hücre katmanını çizgiyle kaplayacak şekilde çizgi genişliğini artırın.
    4. ROS sinyali için kanalı seçin ve seçilen bölgedeki floresan yoğunluğunu ölçün ve değerlere açıklama ekleme.
    5. Sinyalin olmadığı bir çizgi çizin ve son yoğunluğu elde etmek için önceki değere çıkarılacak arka planın floresan yoğunluğunu ölçün.

6. Akış sitometresi kullanılarak ayrışmış organoidler üzerindeki oksidatif stresin ölçülmesi

1. 1 mM'lik son konsantrasyon elde etmek için negatif kontroller için kuyulara 1 μL NAC stok çözeltisi ekleyin.
   NOT: 96 kuyulu yuvarlak tabanlı plakalarda kaplanmuş organoidleri kullanın.
2. 37 °C'de 1 saat kuluçkaya yaslanın ve% 5 _CO2.
3. 200 μM'lik son bir konsantrasyon elde etmek için ilgili kuyulara 1 μL tBHP stok çözeltisi ekleyin.
4. 37 °C ve %5 CO2'de 30 dakika kuluçkaya _yaslanın.
5. Çok kanallı pipetle, bağlı BMM'yi bozmadan ortamı çıkarın ve başka bir 96 kuyu yuvarlak alt plakaya aktarın. Bu tabağı bir kenara bırak.
6. 100 μL tripsin ekleyin ve çok kanallı bir pipetle, BMM'yi yok etmek için en az beş kez pipet yukarı ve aşağı.
7. 37 °C ve %5 CO2'de 5 dakikadan fazla kuluçkaya _yatmayın.
8. Çok kanallı pipetle, organoidleri ayrıştırmak için en az beş kez pipet yukarı ve aşağı.
9. RT'de 5 dakika boyunca 300 x g'da dön.
10. Plakayı ters çevirerek süpernatant atın. 6.3. adımda toplanan ortamı ilgili kuyulara geri ekleyin ve 5 kez yukarı ve aşağı pipetleme yaparak hücreleri yeniden biriktirin.
11. Florojenik probu 1 μM'lik son konsantrasyonda _ekleyin.
    NOT: Florojenik probu cihazın ayarları için gereken kuyulara eklemeyin (Şekil 2B).
12. RT'de 5 dakika boyunca 300 x g'da dön.
13. Hücreleri 250 μL 0,1 μg/mL DAPI çözeltisi ile yeniden kullanın. Numuneleri uygun Akış sitometri tüplerine aktarın, tüpleri buzda tutun ve analize devam edin.
    NOT: Cihazın ayarları için gereken kuyulara DAPI yerine PBS ekleyin (Şekil 2B).
14. Tek lekeli numuneler kullanarak her florofor için ellenmemiş kontrol ve lazer voltajlarında ileri ve yan dağılım gerilimi ayarlarını optimize edin.
15. Uygun bir gating stratejisi kullanarak (Şekil 4A), en az 20.000 olay toplayın.
    NOT: 50.000 etkinlik tercih edilmektedir. Detaylı alım ayarları kullanılan enstrümana göre değişiklik gösterir.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Sonuçlar

Açıklanan protokolün bir kavram kanıtı olarak, Bağırsak kök hücrelerinin Barker ve arkadaşları tarafından kurulan mozaik GFP ekspresyonunun görüntülendiği Lgr5-eGFP-IRES-CreERT2 fare hattından elde edilen mahzenler, başlangıçta bağırsak kök hücrelerini ^{karakterize etmek için kullanıldı10} ve bu hücreleriN GFP ifadelerine göre haritalandırılmasına izin vermek için. Böylece, farklı tedaviler üzerine belirli bir hücre tipi popülasyondaki ROS seviyelerini karşıla...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Tartışmalar

Bu çalışma, murine jejunal mahzenleri izole etmek, 3D organoidler halinde kültürlemek ve ROS'a duyarlı florojenik bir probu tüm organoidlerin nitel mikroskopisi ve organoid ayrışmasını takiben tek hücrelerde akış sitometrisi kullanarak nicel ROS ölçümü ile birleştirerek organoidlerde ROS'u analiz etmek için adım adım bir protokol sağlar.

Bu yöntemin ilk kritik adımı, mahzen çıkarma prosedürüdür. Gerçekten de, mahzenlerin hazırlanmasının kalitesi başarılı o...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
Mice
Lgr5-EGFP-IRES-creERT2 (Lgr5-GFP)	The Jackson Laboratory
Growth culture medium
Advanced DMEM F12 (DMEM/F12)	ThermoFisher	12634010
B-27 Supplement, minus vitamin A	ThermoFisher	12587010	Stock Concentration: 50x
GlutaMAX (glutamine)	ThermoFisher	35050038	Stock Concentration: 100x
Hepes	ThermoFisher	15630056	Stock Concentration: 1 M
Murine EGF	R&D	2028-EG-200	Stock Concentration: 500 µg/mL in PBS
murine Noggin	R&D	1967-NG/CF	Stock Concentration: 100 µg/mL in PBS
Murine R-spondin1	R&D	3474-RS-050	Stock Concentration: 50 µg/mL in PBS
N-2 Supplement	ThermoFisher	17502048	Stock Concentration: 100x
Penicillin-Streptomycin (P/S)	ThermoFisher	15140122	Stock Concentration: 100x (10,000 units/mL of penicillin and 10,000 µg/mL of streptomycin)
Material
70 µm cell strainer	Corning	352350
96-well round bottom	Corning	3799
ball tip scissor	Fine Science Tools GMBH	14086-09
CellROX® Deep Red Reagent	ThermoFisher	C10422
DAPI (4’,6-diamidino-2-phénylindole, dichlorhydrate) (fluorgenic probe)	ThermoFisher	D1306	stock at 10 mg/mL
DPBS 1x no calcium no magnesium (DPBS)	ThermoFisher	14190144
FLuoroBrite DMEM (DMEM no phenol red)	ThermoFisher	A1896701
Hoechst 33342	ThermoFisher	H3570	stock at 10 mg/mL
Matrigel Growth Factor Reduced, Phenol Red Free (Basement Membrane Matrix)	Corning	356231	once received thaw o/n in the fridge, keep for 1h on ice and, make 500 mL aliquots and store at -20 °C
µ-Slide 8 Well chambers	Ibidi	80826
N-acetylcysteine (NAC)	Sigma	A9165
tert-Butyl hydroperoxide (tBCHP)solution (70%wt. In H2O2)	Sigma	458139
TrypLE Express Enzyme (1X), no phenol red (trypsin)	ThermoFisher	12604013
UltraPure 0.5 M EDTA, pH8.0	ThermoFisher	15575020
Y-27632	Sigma	Y0503	Rock-inhibitor to be used to minimize cell death upon tissue dissociation
Programs and Equipment
Attune NxT (Flow Cytometer)	ThermoFischer		Flow cytometer analyzer
Fiji/ImageJ	https://imagej.net/software/fiji/downloads		images generation
FlowJo	BD Bioscience		FACS analysis
Observer.Z1	Zeiss		confocal system
Opterra (swept-field confocal)	Bruker		confocal system
high speed EMCCD Camera Evolve Delta 512	Photometrics		confocal system
Prism	GraphPad Software		statistical analysis