ניתוח עקה חמצונית באורגנוידים מעיים מורין באמצעות גשושית פלואורוגנית רגישה למינים של חמצן תגובתי

Summary

הפרוטוקול הנוכחי מתאר שיטה לזיהוי מינים של חמצן תגובתי (ROS) באורגנוידים של מורין במעיים באמצעות הדמיה איכותית ובדיקות ציטומטריה כמותית. עבודה זו יכולה להיות מורחבת באופן פוטנציאלי לבדיקות פלואורסצנטיות אחרות כדי לבדוק את ההשפעה של תרכובות נבחרות על ROS.

Abstract

מינים חמצן תגובתי (ROS) לשחק תפקידים חיוניים הומאוסטזיס מעיים. ROS הם תוצרי לוואי טבעיים של חילוף החומרים של התא. הם מיוצרים בתגובה לזיהום או פציעה ברמה הרירית כפי שהם מעורבים בתגובות מיקרוביאלית וריפוי פצעים. הם גם שליחים משניים קריטיים, ויסות מספר מסלולים, כולל צמיחת תאים ובידול. מצד שני, רמות ROS מוגזמות להוביל עקה חמצונית, אשר יכול להיות מזיק לתאים לטובת מחלות מעיים כמו דלקת כרונית או סרטן. עבודה זו מספקת שיטה פשוטה כדי לזהות ROS באורגנוידים מורין מעיים על ידי הדמיה חיה וציטומטריית זרימה, באמצעות בדיקה פלואורוגנית זמינה מסחרית. כאן הפרוטוקול מתאר את ההשפעה של תרכובות המווסתות את איזון redox באורגנוידים במעיים ולזהות רמות ROS בסוגי תאי מעיים ספציפיים, המודגמים כאן על ידי ניתוח של תאי גזע מעיים המסומנים גנטית עם GFP. ניתן להשתמש בפרוטוקול זה עם בדיקות פלואורסצנטיות אחרות.

Introduction

מינים חמצן תגובתי (ROS) הם תוצרי לוואי טבעיים של חילוף החומרים התאי. הם יכולים גם להיות מיוצרים באופן פעיל על ידי קומפלקסים אנזימטיים מיוחדים כגון NADPH-Oxidases הקשורים לממברנה (NOX) ו Oxidases כפול (DUOX), אשר מייצרים אניון סופראוקסיד ומי ^חמצן1. על ידי הבעת אנזימים נוגדי חמצון ואוכלי נבלות ROS, תאים יכולים לכוונן דק את איזון ה- redox שלהם, ובכך להגן על הומאוסטזיס ^רקמות2. למרות ROS יכול להיות רעיל מאוד לתאים ולפגוע DNA, חלבונים, שומנים, שומנים, הם מולקולות איתות ^חיוני2. באפיתל המעיים, רמות ROS מתונות נדרשות להתפשטות תאי גזע ואבות ^אבות3; רמות ROS גבוהות להוביל אפופטוזיס ^שלהם4. עקה חמצונית כרונית קשורה למחלות רבות במערכת העיכול, כגון מחלות מעי דלקתיות או סרטן. כדוגמה, במודל עכבר של סרטן מעיים מונחה Wnt, ייצור ROS מוגבר באמצעות הפעלה של NADPH-oxidases נמצאה כנדרשת עבור תאים סרטניים hyperproliferation5,6. הגדרת האופן שבו תאי מעיים, בפרט תאי גזע, תאי גזע מנהלים עקה חמצונית וכיצד הסביבה התאית יכולה להשפיע על יכולת זו חיונית כדי להבין את האטיולוגיה של מחלה זו טוב ^יותר7.

ברקמה, סוגי תאים שונים מציגים מצב חמצוני בסיסי שעשוי להשתנות בהתאם לתפקודם ולחילוף החומרים שלהם ולביטוי של רמות משתנות של מולקולות חמצון ונוגדי ^{חמצון4,7}. ניטור ROS ב vivo הוא מאתגר מאוד. צבעים חדירים לתאים הפולטים פלואורסצנטיות בהתאם למצבם האדום פותחו כדי לדמיין ולמדוד ROS תאי בתאים חיים ובבעלי חיים. עם זאת, היעילות שלהם תלויה בפיזור שלהם בתוך רקמות חיות ואת הקריאה המהירה שלהם, מה שהופך אותם קשים לשימוש במודלים של בעלי ^חיים8.

בעבר, המחקר של ההשפעה של תרכובות על דור ROS נעשה באמצעות קווי תאים, אבל זה לא יכול לשקף את המצב in vivo . מודל האורגנויד במעיים, שפותח על ידי קבוצת ^Clevers9, מאפשר את הצמיחה של תאים ראשוניים במעיים ex vivo. תרבות של קריפטות מעיים במטריצות, בנוכחות גורמי גדילה מוגדרים, מובילה למבנים תלת-ממדיים, הנקראים אורגנוידים (מיני-מעיים), אשר משחזרים את ארגון הקריפטה-וילון, עם תאים משושלות האפיתל השונות המצפות לומן פנימי, ותאי הגזע במעיים המתגוררים בבליטה קטנה דמוית קריפטה.

כאן, תוך ניצול מודל זה, מתוארת שיטה פשוטה לחקר עקה חמצונית בתאי מעיים ראשוניים ברזולוציה של תא יחיד על ידי הוספת צבע רגיש ל- ROS זמין מסחרית למדיום התרבות האורגנויד.

קוראי לוחות משמשים לעתים קרובות כדי לזהות ייצור ROS באוכלוסייה הכוללת. פרוטוקול זה משתמש בציטומטריית זרימה או בבדיקת הדמיה כדי לזהות ROS בסוג תא מסוים עם תאים מהונדסים גנטית או כתמי נוגדנים ספציפיים. עבודה זו כוללת תרבות אורגנויד מעיים של עכבר והדמיה ROS על ידי הדמיה קונפוקלית וכימות על ידי ציטומטריית זרימה. באמצעות Lgr5-GFP עכברים נגזרים אורגנוידים מעיים קטנים, ניתן לנתח באופן ספציפי את רמת הלחץ החמצוני בתאי גזע מעיים על טיפולים שונים. פרוטוקול זה יכול להיות מותאם כדי לבדוק את ההשפעה של מולקולות אקסוגניות, כגון מראמיל-dipeptide נגזר מיקרוביוטה (MDP)¹⁰, על מאזן ROS, לאחר גירוי organoids עם התרכובות שנבחרו.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

כל הניסויים בבעלי חיים בוצעו לאחר אישור ועדת השימוש בפסטר במכון ועל ידי משרד החקלאות הצרפתי מס ' 2016-0022. כל השלבים מבוצעים בתוך מכסה המנוע של תרבית הרקמות.

1. הכנת ריאגנטים וחומרים לפולחן אורגנוידים במעיים

1. כדי להכין מדיום תרבות גדילה, לערבב מתקדם DMEM / F-12 בתוספת 1x גלוטמין, 1x פניצילין / סטרפטומיצין (P / S) פתרון, 10 מ"מ של HEPES, 50 ng / mL של EGF מורין, 20 מיקרוגרם / מ"ל של מורין Noggin 500 ng / mL של עכבר R-Spondin1 (ראה טבלת חומרים). השאירו את המדיום בטמפרטורת החדר (RT) במהלך החילוץ של הקריפטה.
   הערה: הקפאת המדיום שאינו בשימוש ב- aliquots ב- -20 °C (60 °F). יש להימנע מהקפאה והפשרה.
2. מלא צינור 50 מ"ל עם 40 מ"ל של DMEM / F-12 מתקדם ולשמור אותו על קרח.
   הערה: שמור על המדיום שאינו בשימוש בטמפרטורה של 4 °C (60 °F). זה ישמש עבור organoids עובר.
3. מחממים מראש את לוחות תרבית התאים (μ-Slide 8 היטב ו/או 96-well round bottom) באינקובטור בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס.
4. להפשיר מטריצת ממברנה מרתף (BMM) (ראה טבלת חומרים) aliquots על קרח (לפני תחילת הפרוטוקול או לפחות 1 שעה לפני ציפוי קריפטות).
   הערה: ה-BMM יתמצק במהירות אם לא יישמר קר.
5. הכן פתרון כביסה/שטיפה הוספת תמיסת פניצילין-סטרפטומיצין 1% ל- DPBS (DPBS-P/S).
6. מלאו צלחת פטרי 100 מ"מ עם 10 מ"ל של DPBS-P/S קר. מלאו שישה צינורות 15 מ"ל עם 10 מ"ל של DPBS ותייגו אותם מ-F1 עד F6.
7. הכן 30 מ"ל של פתרון EDTA של 10 מ"מ על ידי דילול מ 0.5 M EDTA ב- DPBS. מלאו שני צינורות 15 מ"ל ב-10 מ"ל של 10 מ"מ EDTA, ותייגו אותם כ-E1 ו-E2.
8. יש לשמור את כל הפתרונות מקוררים מראש ב-4°C ולשמור אותם על הקרח במהלך ההליך.

2. תרבות האורגנוידים במעיים

1. להקריב עכבר Lgr5-10 שבועות בן 8-10 שבועות Lgr5-EGFP-IRES-creERT2 (Lgr5-GFP) על פי הכללים והתקנות הלאומיים.
2. לאסוף 5-8 ס"מ של jejunum המקיף את האזור בין התריסריון (5 ס"מ מהקיבה) ואת ileum (10 ס"מ מן cecum) ולשמור על DPBS-P/S קר על קרח.
3. נקו את תכולת המעיים על ידי שטיפה עם 5-10 מ"ל של DPBS-P/S קר.
   הערה: ניתן להשיג מזרקי שטיפה תוצרת בית על ידי חיבור קצה μL 200 לזרבובית מזרק של 10 מ"ל.
4. פתח את המעי לאורך באמצעות מספריים קצה כדור (ראה טבלת חומרים) (כדי למנוע נזק לרקמה).
5. בעזרת מלקחיים, מעבירים את הרקמה לצלחת פטרי המכילה DPBS-P/S קר בטמפרטורת החדר ומנערים אותה לשטיפה.
6. עם פיפטה פסטר פלסטיק, לתפוס את המעי על ידי שאיפה ולהעביר אותו לתוך צינור 15 מ"ל שכותרתו E1 המכיל 10 מ"ל קר 10 מ"ל 10 מ"מ EDTA.
7. הפוך את הצינור 3 פעמים ודגור על קרח במשך 10 דקות.
8. באמצעות פיפטה פסטר פלסטיק, להעביר את הרקמה בצינור F1 המכיל 10 מ"ל DPBS. מערבולת במשך 2 דקות (על מערבולת רגילה, מחזיק את הצינור ביד ומבטיח כי המעי מסתחרר יפה).
9. שים 10 μL של השבר בצלחת פטרי ולהעריך את איכות השבר תחת מיקרוסקופ.
   הערה: כל שלבי המערבולת מבוצעים במהירות המרבית, ויש להעריך את האיכות של כל שבר תחת המיקרוסקופ (איור 1).
10. עם פיפטה פסטר פלסטיק, לתפוס את המעי על ידי שאיפה ולהעביר אותו צינור F2 המכיל 10 מ"ל DPBS ומערבולת במשך 2 דקות.
11. חזור על שלב 2.10, העברת הרקמה בצינור F3 המכיל 10 מ"ל DPBS ומערבולת במשך 2 דקות.
12. חזור על דגירה EDTA כמו בשלב 2.6, העברת הרקמה בצינור E2 המכיל 10 מ"מ EDTA.
13. הפוך את הצינור 3 פעמים ודגר על קרח במשך 5 דקות.
14. חזור על שלב 2.10, העברת הרקמה בצינור F4 המכיל 10 מ"ל DPBS ומערבולת במשך 3 דקות.
15. חזור על שלב 2.14, העברת הרקמה בצינור F5 המכיל 10 מ"ל DPBS ומערבולת במשך 3 דקות.
16. חזור על שלב 2.15, העברת הרקמה בצינור F6 המכיל 10 מ"ל DPBS ומערבולת במשך 3 דקות.
17. שלב את החלקים הטובים ביותר סינון על ידי כוח הכבידה באמצעות מסננת תא 70 מיקרומטר לתוך צינור 50 מ"ל (על קרח) כדי לחסל villi ופסולת משמעותית.
    הערה: בדרך כלל, F5 ו- F6 הם השברים המכילים קריפטות רבות ופחות פסולת.
18. לסובב את הקריפטות ב 150 x g ב 4 °C (50 °F) במשך 3 דקות.
19. לרוקן את הצינור, לשבש את הכדור באופן מכני, ולהוסיף 5 מ"ל של DMEM / F12 קר.
20. שים 10 μL של ההשעיה בצלחת פטרי ולספור את מספר הקריפטות הקיימות aliquot באופן ידני תחת מיקרוסקופ.
    הערה: אין לספור תאים בודדים או פסולת קטנה.
21. חשב את הנפח (V) של השעיית קריפטות הנדרשת ב- μL, בהתחשב בכך ש - 300 קריפטות מצופות לבאר, W הוא מספר הבארות, ו- N הוא מספר הקריפטות הנספרות מתוך 10 μL של ההשעיה. מעבירים את הקריפטות לצינור חדש של 15 מ"ל.
    הערה: V = 300 x W x 10/N. אם נעשה שימוש בנפח קטן בניסוי המתוכנן, ניתן להשתמש בצינור צנטריפוגה של 1.5 מ"ל.
22. לסובב את הקריפטות ב 200 x g ב 4 °C (65 °F) במשך 3 דקות.
23. הסר בזהירות את supernatant באמצעות פיפטה.
24. באופן מכני לשבש את הכדור בעדינות להוסיף מדיום תרבות צמיחה כדי לקבל ריכוז של 90 קריפטות / μL.
25. הוסף 2 כרכים של BMM לא מדולל כדי לקבל ריכוז סופי של 30 קריפטות / μL. בזהירות פיפטה למעלה ולמטה מבלי להכניס בועות אוויר לתערובת.
    הערה: תמיד לשמור את הצינור על קרח כדי למנוע התגבשות BMM.
26. צלחת 10 μL של קריפטות / BMM לערבב לתוך כל באר. לניתוח ציטומטריית זרימה, השתמשו בלוחות עגולים עם 96 בארות. להפיץ 10 μL במרכז כל גם כמו כיפה. להדמיה, השתמש μ שקופית 8 היטב (ראה טבלת חומרים) ולהפקיד את 10 μL כשכבה דקה.
    הערה: צלחת organoids כשכבה דקה עבור בדיקת הדמיה כדי לאפשר הדמיה מעמיקה שלהם.
27. השאירו את הצלחת במשך 5 דקות ב RT כדי לאפשר את BMM להתמצק. מניחים את הצלחת באינקובטור ב 37 °C (5° פרנהייט) ו 5% _CO2 במשך 15 דקות.
28. הוסף 250 μL של מדיום צמיחה לתוך כל באר, הקפדה לא לנתק את BMM.
29. מניחים את הצלחות באינקובטור ב 37 °C (5° פרנהייט) ו 5% _CO2.
30. בצע את ניתוח ROS בין ימים 4 ו 6 של תרבות. אחרת, לשנות את המדיום ולפצל את organoids לאחר הופעתם של כמה מבנים ניצנים ארוכים וכאשר תאים מתים מצטברים לתוך לומן organoids.

3. אורגנוידים חולפים

1. התחל להעביר אורגנוידים מעיים קטנים מהיום ^השישי של התרבות, כאשר נוצרו מבנים ניצנים משמעותיים, ואת לומן organoids הפכו כהים.
   הערה: לומן האורגנויד הופך כהה עקב הצטברות של תאים מתים, פסולת, ריר. הימנע לתת לאורגנוידים לגדול יתר על המידה לפני הפיצול. יחס הפיצול תלוי בצמיחה של האורגנוידים. מומלץ להעביר את האורגנוידים ביחס של 1:2 ביום 6 ו-1:3 ביום 10.
2. מלא שפופרת 15 מ"ל עם 4 מ"ל של DMEM / F-12 מתקדם קר ולשמור אותו על קרח.
   הערה: כאן מסופקים כרכים עבור צלחת תרבות של 96 בארות. אם נעשה שימוש בתבנית אחרת, התאם את עוצמת הקול בהתאם.
3. בזהירות לשאוף את המדיום עם פיפטה או משאבת ואקום מן הבארות מבלי לגעת כיפות BMM, ולהשליך אותו.
4. הוסף 100 μL של DMEM מתקדם קר / F-12 לבאר. פיפטה למעלה ולמטה כדי לשבור את BMM ולהעביר את התוכן של הבאר לתוך צינור 15 מ"ל.
5. לשטוף את הבאר עם 200 μL קר מתקדם DMEM / F-12 ולאסוף אותו באותו צינור.
   הערה: אם עובר בארות מרובות מאותו מצב ניסיוני, התוכן של הבארות יכול להיות משולב באותו צינור איסוף 15 מ"ל.
6. לסובב את צינור איסוף 15 מ"ל ב 100 x g במשך 5 דקות ב 4 ° C.
7. להשליך את supernatant ולהוסיף 1mL של DMEM / F-12 מתקדם קר לכדור. בעזרת טיפ P1000, קחו טיפ P10 (ללא מסנן) ופיפטה למעלה ולמטה לפחות 20 פעמים.
8. הוסיפו לצינור 4 מ"ל של DMEM/F-12 קר ומתקדם. ספין ב 300 x g במשך 5 דקות ב 4 °C.
9. שאפו את הסופר-נרטיב עם פיפטה או משאבת ואקום מבלי להפריע לכדור. לאחר מכן, לשבש את הכדור באופן מכני.
10. הוסף BMM מדולל במדיום תרבות הצמיחה (יחס 2:1). בזהירות פיפטה למעלה ולמטה מבלי להכניס בועות אוויר לתערובת.
11. צלחת 10 μL של קריפטות / BMM לערבב לתוך כל באר.
12. שמור את הצלחת במשך 5 דקות ב RT כדי לאפשר BMM להתמצק. מניחים את הצלחת באינקובטור ב 37 °C (5° פרנהייט) ו 5% _CO2 במשך 15 דקות.
13. הוסף 250 μL של מדיום צמיחה לתוך כל באר.
    הערה: היזהרו לא לנתק את ה- BMM.
14. מניחים את הצלחות באינקובטור ב 37 °C (5° פרנהייט) ו 5% _CO2.

4. הכנת ריאגנטים וחומרים להערכת עקה חמצונית באורגנוידים במעיים

1. הכן פתרון מלאי 250 mM של מעכב N-אצטילציסטאין (NAC) (ראה טבלת חומרים), resuspend 10 מ"ג עם 245 μL של DPBS. יש להשתמש בריכוז סופי של 1 מ"מ.
2. הכן פתרון מלאי 50 mM של ממריץ Tert-butyl hydroperoxide (tBHP), 70% במים, לדלל 3.22 μL עם 496.8 μL של DPBS. יש להשתמש בריכוז הסופי של 200 מיקרומטר.
3. עבור המחקר cytometry זרימה, להכין פתרון עבודה 250 μM של בדיקה פלואורוגנית (ראה טבלת חומרים) על ידי דילול פתרון המלאי 1/10 ב- DMSO. יש להשתמש בריכוז הסופי של μM 1.
   הערה: כפי שצוין בהוראות היצרן, הבדיקה הפלואורוגנית רגישה לאור ולחמצן. מניות ו aliquots לא צריך להיות פתוח וסגור יותר מדי פעמים.
4. למחקר ההדמיה, הכן פתרון עבודה של 1.25 mM של הבדיקה הפלואורוגנית על ידי דילול פתרון המניה 1/2 ב- DMSO. יש להשתמש בריכוז הסופי של 5 מיקרומטר.
5. הכן פתרון סופי של 0.1 מיקרוגרם / mL DAPI ב- DPBS, שישמש לאפליה של תאים מתים בבדיקת הציטומיה של Flow.
6. לדלל Hoechst 33342 כדי 1.25 מ"ג / מ"ל ב- DPBS. יש להשתמש בריכוז סופי של 5 מיקרוגרם/מ"ל כדי לשמש להכתמה גרעינית בבדיקת ההדמיה.
7. חם DMEM ללא אדום פנול ב 37 °C (50 °F).
   הערה: שלבים אלה מתארים שימוש בפקדים שליליים וחיוביים שיש לכלול בכל בדיקה, תוך שימוש בתנאים המצוינים באיור 2A. הבדיקה יכולה לשמש לבדיקת תרכובות נוגדות או פרו-חמצון. השלבים זהים, וההבדל היחיד הוא כאשר התרכובות מתווספות לפני השימוש בצבע פלואורוגני.

5. הדמיה של עקה חמצונית באורגנוידים תלת-ממדיים על ידי מיקרוסקופיה קונפוקלית

1. קח את organoids מצופה μ-שקופית 8 היטב תאים ולהוסיף 1 μL NAC מלאי פתרון בבארות המתאימות כדי לקבל ריכוז סופי של 1 מ"מ.
2. דגירה למשך שעה אחת בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס ו-5% _CO2.
3. הוסף 1 μL tBHP פתרון מלאי בבארות המתאימות כדי לקבל ריכוז סופי של 200 מיקרומטר.
4. דגירה במשך 30 דקות ב 37 °C (5° פרנהייט) ו 5% _CO2.
5. הוסף 1 μL לכל באר של דילול 1.25 מ"מ של בדיקה פלואורוגנית כדי לקבל ריכוז סופי של 5 מיקרומטר.
6. הוסף 1 μL לכל באר של 1.25 מ"ג / מ"ל דילול של Hoescht כדי לקבל ריכוז סופי של 5 מיקרוגרם / מ"ל.
7. דגירה במשך 30 דקות ב 37 °C (5° פרנהייט) ו 5% _CO2.
8. הסר את המדיום מבלי להפריע ל- BMM. בעדינות, להוסיף 250μL של DMEM חם ללא אדום פנול.
   הערה: אם מתוכננת רכישה ארוכת טווח, הוסף תרכובות גורמי גדילה ל- DMEM ללא אדום פנול.
9. דמיינו את האורגנוידים באמצעות מיקרוסקופ קונפוקלי המצויד בתא תרמי ובאספקת גז המזהה את הגשוש הפלואורוגני (ROS).
   הערה: עירור / פליטה (ex /em) עבור בדיקה פלואורוגנית הוא 644/665, ex /em עבור Hoechst (גרעינים) הוא 361/486, ו ex /em עבור GFP (תא גזע מעיים מעכברי Lgr5-GFP) הוא 488/510. מטרת טבילת שמן 63x משמשת לזיהוי אותות בתאי גזע. אל תשנה הגדרות לייזר בין דגימות. ניתן להשתמש במטרה של 20x כדי לאפשר מבט כולל על ייצור ROS.
10. השתמש בפקד החיובי כדי להגדיר את עוצמת הלייזר ואת חשיפת הזמן עבור אות ROS ולבדוק כי אות זה נמוך יותר בפקד השלילי.
11. באמצעות מסך העיניים השקופית כדי לזהות את האורגנוידים GFP המבטאים ולהתאים את עוצמת הלייזר.
    הערה: שלב זה מבוצע באופן ידני.
12. הגדר עמדות כדי לקבל תמונה תפורה של האורגנויד כולו. הגדר z-stack של 25 מיקרומטר (גודל שלב 5 מיקרומטר) כדי לקבל קטע של organoids מראה שכבה אחת של תאים.
    הערה: עיין במדריך למשתמש של המיקרוסקופ כדי למטב את ההתקנה. באמצעות תאים חיים, הרכישה צריכה להיעשות בתוך 1 שעות לאחר סיום הדגירה.
13. פתח את התמונות בתוכנת עיבוד תמונה בקוד פתוח (ראה טבלת חומרים).
14. עבור דרך z-stack ובחר את המקטע שבו אמצע organoids מיוצג היטב וליצור תמונה חדשה עם האזור שנבחר.
15. כימת את התמונות לפי שלבים 5.15.1 - 5.15.5.
    1. בחרו בכלי קו חופשי.
    2. צייר קו בעקבות הגרעינים.
       הערה: בחר רק אזורים המציגים תאים חיוביים ל- GFP אם רק תאי גזע מנותחים.
    3. הגדל את רוחב הקו כדי לכסות את שכבת התא בקו מבלי לכלול את הפסולת הזוהרת.
    4. בחר את הערוץ עבור אות ROS ומדוד את עוצמת הפלואורסצנטיות באזור שנבחר וביאור הערכים.
    5. צייר קו שבו אין אות ומדוד את עוצמת הפלואורסצנט של הרקע שיופחת לערך הקודם כדי לקבל את העוצמה הסופית.

6. כימות הלחץ החמצוני על האורגנוידים המנותקים באמצעות ציטומטר זרימה

1. הוסף 1 μL NAC פתרון מניות בבארות עבור פקדים שליליים כדי לקבל ריכוז סופי של 1 מ"מM.
   הערה: השתמשו באורגנוידים מצופים בלוחות העגולים עם 96 הבאר.
2. דגירה למשך שעה אחת בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס ו-5% _CO2.
3. הוסף 1 μL tBHP פתרון מלאי בבארות המתאימות כדי לקבל ריכוז סופי של 200 מיקרומטר.
4. דגירה במשך 30 דקות ב 37 °C (5° פרנהייט) ו 5% _CO2.
5. בעזרת פיפטה רב-ערוצית, הסירו את המדיום מבלי להפריע ל-BMM המצורף והעבירו אותו לצלחת תחתונה עגולה נוספת של 96 בארות. שמור את הצלחת הזאת בצד.
6. הוסף 100 μL של טריפסין, ועם פיפטה רב ערוצית, פיפטה למעלה ולמטה לפחות חמש פעמים כדי להרוס את BMM.
7. דגירה במשך לא יותר מ 5 דקות ב 37 °C (5° פרנהייט) ו 5% _CO2.
8. עם פיפטה רב ערוצית, פיפטה למעלה ולמטה לפחות חמש פעמים כדי לנתק את האורגנוידים.
9. ספין ב 300 x g במשך 5 דקות ב RT.
10. להשליך את supernatant על ידי היפוך הצלחת. הוסף בחזרה את המדיום שנאסף בשלב 6.3 לבארות המתאימות והחזר את התאים על ידי צנרת למעלה ולמטה 5 פעמים.
11. מוסיפים את הבדיקה הפלואורוגנית בריכוז הסופי של 1 מיקרומטר. מוסיפים 1 μL לבאר מדילול 250 מיקרומטר ודגרה במשך 30 דקות ב 37 °C (37 °F) ו 5% _CO2.
    הערה: אל תוסיפו את הבדיקה הפלואורוגנית לבארות הדרושות להגדרות המכשיר (איור 2B).
12. ספין ב 300 x g במשך 5 דקות ב RT.
13. Resuspend התאים עם 250 μL של 0.1 מיקרוגרם / mL פתרון DAPI. העבר את הדגימות בצינורות הציטומטריה הנכונים של Flow, שמור את הצינורות על הקרח, והמשיך בניתוח.
    הערה: הוסף/י PBS במקום DAPI לבארות הדרושות להגדרות המכשיר (איור 2B).
14. מטב את הגדרות מתח הפיזור קדימה וצד על שליטה לא מוכתמת ומתחי לייזר עבור כל פלואורופור באמצעות דגימות מוכתמות מונו.
15. באמצעות אסטרטגיית gating מתאימה (איור 4A), לאסוף מינימום של 20,000 אירועים.
    הערה: 50,000 אירועים עדיפים. הגדרות רכישה מפורטות משתנות בהתאם למכשיר שבו נעשה שימוש.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

תוצאות

כהוכחה לרעיון של הפרוטוקול המתואר, הקריפטות שהתקבלו מקו העכבר Lgr5-eGFP-IRES-CreERT2 שימשו שבו תאי גזע מעיים מציגים ביטוי GFP פסיפס, אשר הוקם על ידי בארקר ואח ', כדי לאפיין תאי גזע ^מעיים10 בתחילה ולאפשר למפות תאים אלה בהתבסס על ביטוי GFP שלהם. מודל מסופק ובכך להשוות את רמות ROS באוכלוסיית סוג ת...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

עבודה זו מספקת פרוטוקול שלב אחר שלב כדי לבודד קריפטות jejunal murine, תרבית אותם לתוך organoids 3D, ולנתח ROS organoids על ידי שילוב בדיקה פלואורוגנית רגישה ROS עם הדמיה מיקרוסקופית איכותית של organoids שלמים ומדידת ROS כמותית באמצעות cytometry זרימה על תאים בודדים בעקבות דיסוציאציה organoid.

הצעד הקריטי הר?...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Mice
Lgr5-EGFP-IRES-creERT2 (Lgr5-GFP)	The Jackson Laboratory
Growth culture medium
Advanced DMEM F12 (DMEM/F12)	ThermoFisher	12634010
B-27 Supplement, minus vitamin A	ThermoFisher	12587010	Stock Concentration: 50x
GlutaMAX (glutamine)	ThermoFisher	35050038	Stock Concentration: 100x
Hepes	ThermoFisher	15630056	Stock Concentration: 1 M
Murine EGF	R&D	2028-EG-200	Stock Concentration: 500 µg/mL in PBS
murine Noggin	R&D	1967-NG/CF	Stock Concentration: 100 µg/mL in PBS
Murine R-spondin1	R&D	3474-RS-050	Stock Concentration: 50 µg/mL in PBS
N-2 Supplement	ThermoFisher	17502048	Stock Concentration: 100x
Penicillin-Streptomycin (P/S)	ThermoFisher	15140122	Stock Concentration: 100x (10,000 units/mL of penicillin and 10,000 µg/mL of streptomycin)
Material
70 µm cell strainer	Corning	352350
96-well round bottom	Corning	3799
ball tip scissor	Fine Science Tools GMBH	14086-09
CellROX® Deep Red Reagent	ThermoFisher	C10422
DAPI (4’,6-diamidino-2-phénylindole, dichlorhydrate) (fluorgenic probe)	ThermoFisher	D1306	stock at 10 mg/mL
DPBS 1x no calcium no magnesium (DPBS)	ThermoFisher	14190144
FLuoroBrite DMEM (DMEM no phenol red)	ThermoFisher	A1896701
Hoechst 33342	ThermoFisher	H3570	stock at 10 mg/mL
Matrigel Growth Factor Reduced, Phenol Red Free (Basement Membrane Matrix)	Corning	356231	once received thaw o/n in the fridge, keep for 1h on ice and, make 500 mL aliquots and store at -20 °C
µ-Slide 8 Well chambers	Ibidi	80826
N-acetylcysteine (NAC)	Sigma	A9165
tert-Butyl hydroperoxide (tBCHP)solution (70%wt. In H2O2)	Sigma	458139
TrypLE Express Enzyme (1X), no phenol red (trypsin)	ThermoFisher	12604013
UltraPure 0.5 M EDTA, pH8.0	ThermoFisher	15575020
Y-27632	Sigma	Y0503	Rock-inhibitor to be used to minimize cell death upon tissue dissociation
Programs and Equipment
Attune NxT (Flow Cytometer)	ThermoFischer		Flow cytometer analyzer
Fiji/ImageJ	https://imagej.net/software/fiji/downloads		images generation
FlowJo	BD Bioscience		FACS analysis
Observer.Z1	Zeiss		confocal system
Opterra (swept-field confocal)	Bruker		confocal system
high speed EMCCD Camera Evolve Delta 512	Photometrics		confocal system
Prism	GraphPad Software		statistical analysis