Analisando o estresse oxidativo em organoides intestinais murinos usando sonda fluorogênica sensível à espécie de oxigênio reativa

Resumo

O presente protocolo descreve um método para detectar espécies reativas de oxigênio (ROS) nos organoides murinas intestinais utilizando imagens qualitativas e ensaios quantitativos de citometria. Este trabalho pode ser potencialmente estendido a outras sondas fluorescentes para testar o efeito de compostos selecionados em ROS.

Resumo

As espécies reativas de oxigênio (ROS) desempenham papéis essenciais na homeostase intestinal. Ros são subprodutos naturais do metabolismo celular. Eles são produzidos em resposta à infecção ou lesão no nível mucosa, pois estão envolvidos em respostas antimicrobianas e cicatrização de feridas. Eles também são mensageiros secundários críticos, regulando vários caminhos, incluindo crescimento celular e diferenciação. Por outro lado, os níveis excessivos de ROS levam ao estresse oxidativo, que pode ser deletério para as células e favorecer doenças intestinais como inflamação crônica ou câncer. Este trabalho fornece um método simples para detectar ROS nos organoides murina intestinais por imagem viva e citometria de fluxo, usando uma sonda fluorogênica comercialmente disponível. Aqui o protocolo descreve o ensaio do efeito de compostos que modulam o equilíbrio redox em organoides intestinais e detectam níveis de ROS em tipos específicos de células intestinais, exemplificados aqui pela análise das células-tronco intestinais geneticamente rotuladas com GFP. Este protocolo pode ser usado com outras sondas fluorescentes.

Introdução

Espécies reativas de oxigênio (ROS) são subprodutos naturais do metabolismo celular. Eles também podem ser produzidos ativamente por complexos enzimáticos especializados, como os NADPH-Oxidases (NOX) e Dual Oxidases (DUOX), que geram ânion de superóxido e peróxido de ^hidrogênio1. Ao expressar enzimas antioxidantes e catadores ros, as células podem ajustar finamente seu equilíbrio redox, protegendo assim a homeostase ^tecidual2. Embora o ROS possa ser altamente tóxico para as células e danificar DNA, proteínas e lipídios, eles são moléculas de sinalização ^cruciais2. No epitélio intestinal, são necessários níveis de ROS moderados para a proliferação de células-tronco e ^{progenitoras3}; altos níveis de ROS levam à sua apoptose4. O estresse oxidativo crônico está ligado a muitas doenças gastrointestinais, como doenças inflamatórias intestinais ou câncer. Como exemplo, em um modelo de camundongo de câncer intestinal orientado por Wnt, a produção elevada de ROS através da ativação de NADPH-oxidases foi considerada necessária para as células cancerosas hiperproliferation5,6. Definir como as células intestinais, em particular as células-tronco, as células-tronco gerenciam o estresse oxidativo e como o ambiente celular pode impactar essa capacidade é essencial para entender melhor a etiologia dessa ^doença7.

Em um tecido, diferentes tipos celulares apresentam um estado oxidativo basal que pode variar de acordo com sua função e metabolismo e a expressão de diferentes níveis de moléculas oxidantes e ^{antioxidantes4,7}. Monitorar a ROS in vivo é muito desafiador. Corantes permeáveis celulares que emitem fluorescência de acordo com seu estado redox foram desenvolvidos para visualizar e medir ros celular em células vivas e animais. No entanto, sua eficácia depende de sua difusão dentro de tecidos vivos e sua leitura rápida, tornando-os difíceis de usar em modelos ^animais8.

No passado, o estudo do efeito dos compostos na geração ROS foi feito utilizando linhas celulares, mas isso pode não refletir a situação in vivo . O modelo organoide intestinal, desenvolvido pelo grupo de ^Clevers9, permite o crescimento de células primárias intestinais ex vivo. A cultura de criptas intestinais em matrizes, na presença de fatores de crescimento definidos, leva a estruturas tridimensionais, chamadas organoides (mini-intestino), que reproduzem a organização cript-villus, com células das diferentes linhagens epiteliais que revestem um lúmen interno, e as células-tronco intestinais residentes em pequenas saliências como criptas.

Aqui, aproveitando este modelo, um método simples é descrito para estudar o estresse oxidativo em células intestinais primárias na resolução unicelular, adicionando um corante sensível a ROS comercialmente disponível no meio da cultura organoide.

Leitores de placas são frequentemente usados para detectar a produção de ROS em uma população total. Este protocolo usa citometria de fluxo ou ensaio de imagem para detectar ROS em um determinado tipo de célula com células geneticamente modificadas ou coloração específica de anticorpos. Este trabalho envolve a cultura organoide intestinal do camundongo e a visualização ros por imagem confocal e quantificação por citometria de fluxo. Usando organoides intestinais pequenos derivados de camundongos LGR5-GFP, é possível analisar especificamente o nível de estresse oxidativo em células-tronco intestinais em diferentes tratamentos. Este protocolo pode ser adaptado para testar a influência de moléculas exógenas, como o muramyl-dipeptida derivado da microbiota (MDP)¹⁰, no equilíbrio ROS, após estimular organoides com os compostos selecionados.

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Protocolo

Todos os experimentos em animais foram realizados após aprovação do Comitê de Uso do Institut Pasteur e do Ministério da Agricultura francês nº 2016-0022. Todas as etapas são realizadas dentro de uma capa de cultura de tecido.

1. Preparação de reagentes e materiais para cultivo de organoides intestinais

1. Para preparar o meio de cultura de crescimento, misturar solução avançada DMEM/F-12 suplementada com 1x glutamina, 1x penicilina/estreptomicina (P/S), 10 mM de HEPES, 50 ng/mL de murina EGF, 20 μg/mL de murine Noggin 500 ng/mL de mouse R-Sdin1 (ver Tabela de Materiais). Deixe o meio em temperatura ambiente (RT) durante a extração da cripta.
   NOTA: Congele o meio nãoutado em alíquotas a -20 °C. Evite congelar e descongelar.
2. Encha um tubo de 50 mL com 40 mL de DMEM/F-12 avançado e mantenha-o no gelo.
   NOTA: Mantenha o meio nãouscado a 4 °C. Será usado para a passagem de organoides.
3. Pré-aqueça as placas de cultura celular (μ-Slide 8 câmaras de poço e/ou fundo redondo de 96 poços) na incubadora a 37 °C.
4. Descongelar a matriz da membrana do porão (BMM) (ver Tabela de Materiais) alíquotas no gelo (antes de iniciar o protocolo ou pelo menos 1h antes de emplaar as criptas).
   NOTA: O BMM solidificará rapidamente se não for mantido frio.
5. Prepare a solução de lavagem/lavagem adicionando 1% de solução de penicilina-estreptomicina ao DPBS (DPBS-P/S).
6. Encha uma placa de petri de 100 mm com 10 mL de DPBS-P/S. Encha seis tubos de 15 mL com 10 mL de DPBS e rotule-os de F1 a F6.
7. Prepare 30 mL de solução EDTA de 10 mM por diluição a partir de 0,5 M EDTA em DPBS. Encha dois tubos de 15 mL com 10 mL de 10 mM EDTA, e rotule-os como E1 e E2.
8. Mantenha todas as soluções pré-resfriadas a 4°C e mantenha-as no gelo durante o procedimento.

2. Cultura de organoides intestinais

1. Sacrifique um mouse Lgr5-EGFP-IRES-creERT2 (Lgr5-GFP) de 8 a 10 semanas de idade de acordo com as regras e regulamentos nacionais.
2. Coletar 5-8 cm do jejunum que abrange a região entre o duodeno (5 cm do estômago) e o íleo (10 cm do ceco) e manter em dpbs-P/S frio no gelo.
3. Limpe o conteúdo intestinal lavando com 5-10 mL de DPBS-P/S frio.
   NOTA: As seringas de descarga caseiras podem ser obtidas conectando uma ponta de 200 μL em um bocal de seringa de 10 mL.
4. Abra o intestino longitudinalmente usando uma tesoura de ponta de bola (ver Tabela de Materiais) (para evitar danificar o tecido).
5. Usando fórceps, transfira o tecido para uma placa de petri contendo DPBS-P/S frio à temperatura ambiente e agite-o para enxaguar.
6. Com uma pipeta Pasteur de plástico, pegue o intestino por aspiração e transfira-o para um tubo de 15 mL rotulado E1 contendo 10 mL frio 10 mM EDTA.
7. Inverta o tubo 3 vezes e incuba no gelo por 10 minutos.
8. Usando uma pipeta pasteur de plástico, transfira o tecido no tubo F1 contendo 10 mL DPBS. Vórtice por 2 min (no vórtice normal, segurando o tubo à mão e garantindo que o intestino gire bem).
9. Coloque 10 μL da fração em uma placa de petri e avalie a qualidade da fração sob um microscópio.
   NOTA: Todas as etapas do vórtice são executadas em velocidade máxima, e a qualidade de cada fração deve ser avaliada sob o microscópio (Figura 1).
10. Com uma pipeta Pasteur de plástico, pegue o intestino por aspiração e transfira-o no tubo F2 contendo 10 mL DPBS e vórtice por 2 min.
11. Repita o passo 2.10, transferindo o tecido no tubo F3 contendo DPBS de 10 mL e vórtice por 2 min.
12. Repita a incubação de EDTA como na etapa 2.6, transferindo o tecido no tubo E2 contendo 10 mM EDTA.
13. Inverta o tubo 3 vezes e incuba no gelo por 5 minutos.
14. Repita o passo 2.10, transferindo o tecido no tubo F4 contendo 10 mL DPBS e vórtice por 3 min.
15. Repita o passo 2.14, transferindo o tecido no tubo F5 contendo DPBS de 10 mL e vórtice por 3 min.
16. Repita o passo 2.15, transferindo o tecido no tubo F6 contendo DPBS de 10 mL e vórtice por 3 min.
17. Combine as melhores frações filtrando por gravidade através de um coador de células de 70 μm em um tubo de 50 mL (no gelo) para eliminar villi e detritos significativos.
    NOTA: Normalmente, F5 e F6 são as frações que contêm numerosas criptas e menos detritos.
18. Gire as criptas a 150 x g a 4 °C por 3 min.
19. Esvazie o tubo, interrompa a pelota mecanicamente e adicione 5 mL de DMEM/F12 frio.
20. Coloque 10 μL da suspensão em uma placa de petri e conte o número de criptas presentes na alíquota manualmente sob um microscópio.
    NOTA: Não conte células únicas ou pequenos detritos.
21. Calcule o volume (V) de suspensão de criptas exigida em μL, considerando que 300 criptas são emplacar por poço, W é o número de poços, e N é o número de criptas contadas a partir de 10 μL da suspensão. Transfira as criptas para um novo tubo de 15 mL.
    NOTA: V = 300 x W x 10/N. Se um pequeno volume for usado no experimento planejado, um tubo de centrífuga de 1,5 mL pode ser usado.
22. Gire as criptas a 200 x g a 4 °C por 3 min.
23. Remova cuidadosamente o supernatante usando uma pipeta.
24. Interrompa mecanicamente a pelota e adicione suavemente o meio de cultura de crescimento para obter uma concentração de 90 criptas/μL.
25. Adicione 2 volumes de BMM não diluídos para ter uma concentração final de 30 criptas/μL. Cuidadosamente pipeta para cima e para baixo sem introduzir bolhas de ar na mistura.
    NOTA: Mantenha sempre o tubo no gelo para evitar a solidificação do BMM.
26. Placa 10 μL da mistura criptas/BMM em cada poço. Para análise de citometria flow, use placas de fundo redondo de 96 poços. Distribua 10 μL no centro de cada um, bem como uma cúpula. Para imagem, use μ-slide 8 bem (ver Tabela de Materiais) e deposite os 10 μL como uma camada fina.
    NOTA: Coloque os organoides como uma camada fina para o ensaio de imagem para permitir sua imagem aprofundada.
27. Deixe a placa por 5 minutos no RT para permitir que o BMM se solidifique. Coloque a placa na incubadora a 37 °C e 5% de _CO2 por 15 min.
28. Adicione 250 μL de meio de crescimento em cada poço, tomando cuidado para não desacoplar o BMM.
29. Coloque as placas na incubadora a 37 °C e 5% de _CO2.
30. Realizar a análise ROS entre os dias 4 e 6 da cultura. Caso contrário, mude o meio e divida os organoides após o aparecimento de várias e longas estruturas de brotamento e quando as células mortas se acumulam nos lúmens organoides.

3. Passagem de organoides

1. Comece a passar pequenos organoides intestinais a partir do ^6º dia de cultura, quando estruturas significativas se formaram, e os lúmens organoides se tornaram escuros.
   NOTA: O lúmen organoide fica escuro devido ao acúmulo de células mortas, detritos e muco. Evite deixar os organoides crescerem demais antes de se separarem. A razão de divisão depende do crescimento dos organoides. Recomenda-se a passagem dos organoides com uma razão de 1:2 no dia 6 e 1:3 no dia 10.
2. Encha um tubo de 15 mL com 4 mL de DMEM avançado frio/F-12 e mantenha-o no gelo.
   NOTA: Aqui, são fornecidos volumes para uma placa de cultura de 96 poços. Se um formato diferente for usado, ajuste o volume de acordo.
3. Aspire cuidadosamente o meio com uma pipeta ou uma bomba de vácuo dos poços sem tocar nas cúpulas BMM e descarte-o.
4. Adicione 100 μL de DMEM avançado frio/F-12 por poço. Pipeta para cima e para baixo para quebrar o BMM e transferir o conteúdo do poço para o tubo de 15 mL.
5. Lave o poço com 200 μL frio Avançado DMEM/F-12 e colete-o no mesmo tubo.
   NOTA: Se passar vários poços da mesma condição experimental, o conteúdo dos poços pode ser agrupado no mesmo tubo coletor de 15 mL.
6. Gire o tubo coletor de 15 mL a 100 x g por 5 min a 4°C.
7. Descarte o supernatante e adicione 1mL de DMEM avançado frio/F-12 à pelota. Usando uma ponta P1000, pegue uma ponta P10 (sem filtro) e pipeta para cima e para baixo pelo menos 20 vezes.
8. Adicione 4 mL de DMEM avançado frio/F-12 ao tubo. Gire a 300 x g por 5 min a 4°C.
9. Aspire o supernatante com uma pipeta ou uma bomba de vácuo sem perturbar a pelota. Em seguida, interrompa a pelota mecanicamente.
10. Adicionar BMM diluído em meio de cultura de crescimento (proporção 2:1). Pipeta cuidadosamente para cima e para baixo sem introduzir bolhas de ar na mistura.
11. Placa 10 μL da mistura criptas/BMM em cada poço.
12. Mantenha a placa por 5 minutos no RT para permitir que o BMM se solidifique. Coloque a placa na incubadora a 37 °C e 5% de _CO2 por 15 min.
13. Adicione 250 μL de meio de crescimento em cada poço.
    NOTA: Tenha cuidado para não desprender o BMM.
14. Coloque as placas na incubadora a 37 °C e 5% de _CO2.

4. Preparação de reagentes e materiais para avaliar o estresse oxidativo em organoides intestinais

1. Prepare uma solução de estoque de 250 mM do inibidor N-acetilcisteína (NAC) (ver Tabela de Materiais), resuspend 10 mgs com 245 μL de DPBS. Use em 1 mM de concentração final.
2. Prepare uma solução de estoque de 50 mM de hidroperóxido tert-butyl (tBHP), 70% em água, diluir 3,22 μL com 496,8 μL de DPBS. Use a 200 μM concentração final.
3. Para o estudo de citometria Flow, prepare uma solução de trabalho de 250 μM de uma sonda fluorogênica (ver Tabela de Materiais) diluindo a solução de estoque 1/10 em DMSO. Use em 1 μM de concentração final.
   NOTA: Conforme indicado nas instruções do fabricante, a sonda fluorogênica é sensível à luz e ao oxigênio. Ações e alíquotas não devem estar abertas e fechar muitas vezes.
4. Para o estudo de imagem, prepare uma solução de trabalho de 1,25 mM da sonda fluorogênica diluindo a solução de estoque 1/2 no DMSO. Use em 5 μM de concentração final.
5. Prepare uma solução final de 0,1 μg/mL DAPI em DPBS, a ser usada para discriminação de células mortas no ensaio de citometria de fluxo.
6. Diluir Hoechst 33342 a 1,25 mg/mL em DPBS. Use a 5 μg/mL de concentração final para ser usado para coloração nuclear no ensaio de imagem.
7. DMEM quente sem fenol vermelho a 37 °C.
   NOTA: Estas etapas descrevem o uso de controles negativos e positivos que devem ser incluídos em quaisquer ensaios, utilizando as condições indicadas na Figura 2A. O ensaio pode ser usado para testar compostos anti ou pró-oxidantes. Os passos são os mesmos, e a única diferença é quando os compostos são adicionados antes de usar o corante fluorogênico.

5. Visualização do estresse oxidativo em organoides 3D por microscopia confocal

1. Pegue os organoides banhados nas câmaras de poços μ-Slide 8 e adicione 1 μL solução de estoque NAC nos poços correspondentes para obter uma concentração final de 1 mM.
2. Incubar por 1h a 37 °C e 5% de _CO2.
3. Adicione 1 solução de estoque tBHP de 1 μL nos poços correspondentes para obter uma concentração final de 200 μM.
4. Incubar por 30 min a 37 °C e 5% de _CO2.
5. Adicione 1 μL por poço da diluição de 1,25 mM da sonda fluorogênica para obter uma concentração final de 5 μM.
6. Adicione 1 μL por poço da diluição de 1,25 mg/mL de Hoescht para obter uma concentração final de 5 μg/mL.
7. Incubar por 30 min a 37 °C e 5% de _CO2.
8. Remova o meio sem perturbar o BMM. Suavemente, adicione 250μL de DMEM quente sem vermelho fenol.
   NOTA: Se uma aquisição de longo prazo for planejada, adicione compostos de fatores de crescimento ao DMEM sem vermelho fenol.
9. Imagem dos organoides usando um microscópio confocal equipado com uma câmara e fornecimento de gás que detecta a sonda fluorogênica (ROS).
   NOTA: A excitação/emissão (ex/em) para a sonda fluorogênica é 644/665, ex/em para Hoechst (núcleos) é 361/486, e ex/em para GFP (célula-tronco intestinal dos camundongos Lgr5-GFP) é 488/510. Um objetivo de imersão em óleo de 63x é usado para detectar sinais em células-tronco. Não altere as configurações de laser entre as amostras. Um objetivo de 20x pode ser usado para permitir uma visão geral da produção ros.
10. Use o controle positivo para configurar a intensidade do laser e a exposição ao tempo para o sinal ROS e verificar se este sinal é menor no controle negativo.
11. Usando a tela da ocular, o slide para identificar os organoides GFP expressando e ajustar a intensidade do laser.
    NOTA: Esta etapa é realizada manualmente.
12. Defina posições para obter uma imagem costurada de todo o organoide. Configure uma pilha z de 25 μm (tamanho de etapa 5 μm) para obter uma seção dos organoides mostrando uma camada de células.
    NOTA: Consulte o manual do usuário do microscópio para otimizar a configuração. Utilizando células vivas, a aquisição deve ser feita dentro de 1h após o término da incubação.
13. Abra as imagens em um software de processamento de imagem de código aberto (ver Tabela de Materiais).
14. Passe pela pilha z e escolha a seção em que o meio dos organoides está bem representado e crie uma nova imagem com a área selecionada.
15. Quantifique as imagens conforme as etapas 5.15.1 - 5.15.5.
    1. Selecione a ferramenta de linha à mão livre.
    2. Desenhe uma linha seguindo os núcleos.
       NOTA: Selecione apenas regiões com células positivas de GFP se apenas forem analisadas células-tronco.
    3. Aumente a largura da linha para cobrir a camada celular com a linha sem incluir os detritos luminosos.
    4. Selecione o canal para o sinal ROS e meça a intensidade da fluorescência na região selecionada e anote os valores.
    5. Desenhe uma linha onde não haja sinal e meça a intensidade fluorescente do fundo que será subtraída ao valor anterior para obter a intensidade final.

6. Quantificação do estresse oxidativo nos organoides dissociados usando citômetro de fluxo

1. Adicione 1 solução de estoque NAC de 1 μL nos poços para controles negativos para obter uma concentração final de 1 mM.
   NOTA: Use os organoides emplacados nas placas de fundo redondo de 96 poços.
2. Incubar por 1h a 37 °C e 5% de _CO2.
3. Adicione 1 solução de estoque tBHP de 1 μL nos poços correspondentes para obter uma concentração final de 200 μM.
4. Incubar por 30 min a 37 °C e 5% de _CO2.
5. Com uma pipeta multicanal, remova o meio sem perturbar o BMM anexado e transfira-o para outra placa inferior redonda de 96 poços. Mantenha este prato de lado.
6. Adicione 100 μL de trippsina, e com uma pipeta multicanal, pipeta para cima e para baixo pelo menos cinco vezes para destruir o BMM.
7. Incubar por no mínimo 5 min a 37 °C e 5% de _CO2.
8. Com uma pipeta multicanal, pipeta para cima e para baixo pelo menos cinco vezes para dissociar os organoides.
9. Gire a 300 x g por 5 min no RT.
10. Descarte o supernatante invertendo a placa. Adicione de volta o meio coletado na etapa 6.3 aos poços correspondentes e resuspense as células ao tubular para cima e para baixo 5 vezes.
11. Adicione a sonda fluorogênica na concentração final de 1 μM. Adicione 1 μL por poço a partir da diluição de 250 μM e incubar por 30 min a 37 °C e 5% de _CO2.
    NOTA: Não adicione a sonda fluorogênica aos poços necessários para as configurações do instrumento (Figura 2B).
12. Gire a 300 x g por 5 min no RT.
13. Resuspenja as células com 250 μL de solução DAPI de 0,1 μg/mL. Transfira as amostras nos tubos de citometria de fluxo adequados, mantenha os tubos no gelo e prossiga com a análise.
    NOTA: Adicione PBS em vez de DAPI aos poços necessários para as configurações do instrumento (Figura 2B).
14. Otimize as configurações de tensão de dispersão dianteira e lateral em tensões de controle e laser não manchadas para cada fluoróforo usando amostras mono-manchadas.
15. Utilizando uma estratégia de gating apropriada (Figura 4A), colete um mínimo de 20.000 eventos.
    NOTA: 50.000 eventos são preferidos. As configurações detalhadas de aquisição variam de acordo com o instrumento utilizado.

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Resultados

Como prova do conceito do protocolo descrito, foram utilizadas as criptas obtidas da linha de camundongos Lgr5-eGFP-IRES-CreERT2, na qual as células-tronco intestinais exibem a expressão GFP do mosaico, que foi estabelecida por Barker et al., para caracterizar células-tronco intestinais10 inicialmente e permitir mapear essas células com base em sua expressão GFP. Assim, é fornecido um modelo para comparar os níveis de ROS em uma população específica do tipo celular em diferentes tratamen...

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Discussão

Este trabalho fornece um protocolo passo-a-passo para isolar criptas jejunal murinas, cultuá-las em organoides 3D e analisar ROS em organoides, combinando uma sonda fluorogênica sensível à ROS com imagens de microscopia qualitativa de organoides inteiros e medição quantitativa de ROS usando citometria de fluxo em células únicas após a dissooididade organoidativa.

O primeiro passo crítico neste método é o procedimento de extração de criptas. De fato, a qualidade da preparação da...

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Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Mice
Lgr5-EGFP-IRES-creERT2 (Lgr5-GFP)	The Jackson Laboratory
Growth culture medium
Advanced DMEM F12 (DMEM/F12)	ThermoFisher	12634010
B-27 Supplement, minus vitamin A	ThermoFisher	12587010	Stock Concentration: 50x
GlutaMAX (glutamine)	ThermoFisher	35050038	Stock Concentration: 100x
Hepes	ThermoFisher	15630056	Stock Concentration: 1 M
Murine EGF	R&D	2028-EG-200	Stock Concentration: 500 µg/mL in PBS
murine Noggin	R&D	1967-NG/CF	Stock Concentration: 100 µg/mL in PBS
Murine R-spondin1	R&D	3474-RS-050	Stock Concentration: 50 µg/mL in PBS
N-2 Supplement	ThermoFisher	17502048	Stock Concentration: 100x
Penicillin-Streptomycin (P/S)	ThermoFisher	15140122	Stock Concentration: 100x (10,000 units/mL of penicillin and 10,000 µg/mL of streptomycin)
Material
70 µm cell strainer	Corning	352350
96-well round bottom	Corning	3799
ball tip scissor	Fine Science Tools GMBH	14086-09
CellROX® Deep Red Reagent	ThermoFisher	C10422
DAPI (4’,6-diamidino-2-phénylindole, dichlorhydrate) (fluorgenic probe)	ThermoFisher	D1306	stock at 10 mg/mL
DPBS 1x no calcium no magnesium (DPBS)	ThermoFisher	14190144
FLuoroBrite DMEM (DMEM no phenol red)	ThermoFisher	A1896701
Hoechst 33342	ThermoFisher	H3570	stock at 10 mg/mL
Matrigel Growth Factor Reduced, Phenol Red Free (Basement Membrane Matrix)	Corning	356231	once received thaw o/n in the fridge, keep for 1h on ice and, make 500 mL aliquots and store at -20 °C
µ-Slide 8 Well chambers	Ibidi	80826
N-acetylcysteine (NAC)	Sigma	A9165
tert-Butyl hydroperoxide (tBCHP)solution (70%wt. In H2O2)	Sigma	458139
TrypLE Express Enzyme (1X), no phenol red (trypsin)	ThermoFisher	12604013
UltraPure 0.5 M EDTA, pH8.0	ThermoFisher	15575020
Y-27632	Sigma	Y0503	Rock-inhibitor to be used to minimize cell death upon tissue dissociation
Programs and Equipment
Attune NxT (Flow Cytometer)	ThermoFischer		Flow cytometer analyzer
Fiji/ImageJ	https://imagej.net/software/fiji/downloads		images generation
FlowJo	BD Bioscience		FACS analysis
Observer.Z1	Zeiss		confocal system
Opterra (swept-field confocal)	Bruker		confocal system
high speed EMCCD Camera Evolve Delta 512	Photometrics		confocal system
Prism	GraphPad Software		statistical analysis