반응성 산소 종 에 민감한 불소 성 프로브를 사용하여 뮤린 장 오르가노이드의 산화 스트레스 분석

요약

본 프로토콜은 질적 이미징 및 정량적 세포 분석 분석법을 사용하여 장 내 뮤뇨 오르노이드에서 반응성 산소 종(ROS)을 검출하는 방법을 설명합니다. 이 작업은 잠재적으로 ROS에 선택된 화합물의 효력을 시험하기 위하여 그밖 형광 탐사선으로 확장될 수 있습니다.

초록

반응성 산소 종 (ROS)은 장 집상성에서 필수적인 역할을합니다. ROS는 세포 대사의 천연 부산물입니다. 그들은 항균 반응 및 상처 치유에 관여로 점막 수준에서 감염 또는 부상에 대 한 응답으로 생산 됩니다. 그(것)들은 또한 세포 성장 및 분화를 포함하여 몇몇 통로를 통제하는 중요한 이차 메신저입니다. 다른 한편으로는, 과도한 ROS 수준은 산화 스트레스로 이끌어 내고, 이는 세포에 대한 해로운 일 수 있고 만성 염증 또는 암 같이 장 질병을 선호할 수 있습니다. 이 작품은 상업적으로 이용 가능한 불소 성 프로브를 사용하여 살아있는 화상 진찰 및 유동 세포측정에 의하여 장 내 뮤뇨 오르가노이드에서 ROS를 검출하는 간단한 방법을 제공합니다. 여기서 프로토콜은 장 가구형에서 레독스 균형을 조절하고 특정 장 세포 유형에서 ROS 수준을 검출하는 화합물의 효과를 분석하며, 여기에 GFP로 유전적으로 표지된 장 줄기 세포의 분석에 의해 예시된다. 이 프로토콜은 다른 형광 프로브와 함께 사용될 수 있다.

서문

반응성 산소 종 (ROS) 세포 대사의 자연 부산물. 또한 초산화화물 음이온 ^{및 과산화}수소를 생성하는 멤브레인 바인딩 NADPH-Oxidases (NOX) 및 듀얼 옥시다제 (DUOX)와 같은 특수 효소 복합체에 의해 적극적으로 생성 될 수 있습니다. 항산화 효소와 ROS 청소부를 발현함으로써 세포는 레독스 균형을 미세조정하여 조직 항상성을 보호할 수 ^{있습니다2.} ROS는 세포에 매우 독성이 있고 DNA, 단백질 및 지질을 손상시킬 수 있지만 중요한 신호 분자²입니다. 장 상피에서, 중간 정도의 ROS 수준은 줄기 및 전구 세포 증식에 필요합니다³; 높은 ROS 수준은 그들의 apoptosis4로 이끌어 내는^. 만성 산화 스트레스는 염증성 장 질환이나 암과 같은 많은 위장 질환과 관련이 있습니다. 예를 들어, Wnt 구동 장암의 마우스 모델에서 NADPH-산화제의 활성화를 통한 ROS 생산이 상승하여 암세포 과확산^5,6에 요구되는 것으로 나타났다. 장 세포, 특히 줄기 세포가 산화 스트레스를 관리하는 방법과 세포 환경이이 용량에 미치는 영향을 정의하는 것은이 질병의 병인을 더 잘 이해하는 데 필수적입니다⁷.

조직에서, 다른 세포 모형은 그들의 기능 및 물질 대사 및 산화제 와 항 산화 분자의 다양한 수준의 표현에 따라 다를 수 있는 기저 산화 상태를 제시^4,7. 생체 내에서 ROS를 모니터링하는 것은 매우 어렵습니다. 그들의 redox 상태에 따라 형광을 방출하는 세포 투과성 염료는 살아있는 세포 및 동물에 있는 세포 ROS를 구상하고 측정하기 위하여 개발되었습니다. 그러나, 그들의 효능은 살아있는 조직 내부의 확산과 그들의 급속한 판독에 따라 달라 집니다., 동물 모델에서 사용 하기 어려운 만들기⁸.

과거에는, ROS 생성에 화합물의 효과의 연구는 세포주를 사용하여 수행되었지만, 이것은 생체 내 상황을 반영하지 않을 수 있다. ^Clevers9의 그룹에 의해 개발된 장 기관지성 모델은 장 1차 세포의 성장을 가능하게 합니다. 행렬에서 장 토굴의 문화, 정의 된 성장 인자의 존재, 3 차원 구조로 이어질, 라는 오가노이드 (미니 창자), 이는 내부 루멘을 안감 다른 상피 혈통에서 세포와, 그리고 소장 줄기 세포는 작은 crypts 같은 돌출에 거주.

여기서, 본 모델을 활용하면, 단세포 배양 배지에 상업적으로 이용 가능한 ROS 에 민감한 염료를 첨가함으로써 단세포 분해능에서 1차 장 세포에서 산화적 스트레스를 연구하는 간단한 방법이 기재된다.

플레이트 판독기는 종종 총 인구에서 ROS 생산을 감지하는 데 사용됩니다. 이 프로토콜은 유동 세포 분석 또는 이미징 분석체를 사용하여 유전자 변형 세포 또는 특정 항체 염색을 가진 특정 세포 유형에서 ROS를 검출합니다. 이 작품은 유동 세포측정에 의한 공초점 화상 진찰 및 정량화에 의한 마우스 장 기관가성 배양 및 ROS 시각화를 포함합니다. Lgr5-GFP 마우스 유래 소장 오르가노이드를 사용하여, 상이한 치료법에 따라 장 줄기 세포에서 산화 스트레스의 수준을 구체적으로 분석할 수 있다. 이러한 프로토콜은 선택된 화합물로 오르가노이드를 자극한 후 ROS 균형에 미생물-유래 무라밀-디펩티드(MDP)¹⁰과 같은 외인성 분자의 영향을 테스트하도록 조정할 수 있다.

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프로토콜

모든 동물 실험은 2016-0022년 프랑스 농무부의 승인 후 수행되었다. 모든 단계는 조직 배양 후드 내부에서 수행됩니다.

1. 장 내장을 배양하기 위한 시약 및 재료 준비

1. 성장 배양 배지를 준비하려면 1x 글루타민, 1배 페니실린/스트렙토마이신(P/S) 용액, HEPES 10mMM, 뮤린 EGF 50ng/mL, 뮤린 노긴 500 ng/mL(R-Spond)의 20 μg/mL(R-Spond1)를 혼합하여 R-Spond 1의 암조를 준비 한다. 지하실을 추출하는 동안 심열(RT)을 실온(RT)에 둡니다.
   참고: -20°C에서 알리쿼트에서 사용하지 않은 배지를 동결합니다. 동결 및 해동을 피하십시오.
2. 고급 DMEM/F-12의 40mL로 50mL 튜브를 채우고 얼음 위에 보관하십시오.
   참고: 사용하지 않은 배지를 4°C로 유지합니다. 그것은 유기 체 패시징에 사용 됩니다.
3. 37°C에서 인큐베이터에서 세포 배양 플레이트(μ-슬라이드 8 웰 챔버 및/또는 96웰 원형 바닥)를 미리 데워십시오.
4. 해동 지하 멤브레인 매트릭스 (BMM) ( 재료의 표 참조) 얼음에 알리쿼트 (프로토콜을 시작하기 전에 또는 적어도 1 h 도금 토굴 전에 h).
   참고: BMM은 차갑게 유지되지 않으면 빠르게 굳어집니다.
5. DPBS(DPBS-P/S)에 1% 페니실린-연쇄절제술 용액을 추가하는 세척/플러싱 솔루션을 준비합니다.
6. 100mm 페트리 접시에 10mL의 차가운 DPBS-P/S. 10mL의 DPBS로 6개의 15mL 튜브를 채우고 F1에서 F6로 라벨을 붙입니다.
7. DPBS에서 0.5M EDTA에서 희석하여 10mM EDTA 용액 30mL를 준비합니다. 10mM EDTA의 10mL로 15mL 튜브 2개를 채우고 E1 및 E2로 레이블을 지정합니다.
8. 모든 솔루션을 4°C에서 미리 냉각하고 시술 중에 얼음 위에 보관하십시오.

2. 장 내장 배양

1. 국가 규칙 및 규정에 따라 8-10 주 된 Lgr5-EGFP-IRES-creERT2 (Lgr5-GFP) 마우스를 희생하십시오.
2. 십이지장(위장에서 5cm)과 일레움(10cm)을 아우르는 제주5-8cm를 모아 차가운 DPBS-P/S를 얼음 위에 보관한다.
3. 차가운 DPBS-P/S의 5-10 mL로 플러시하여 장 함량을 청소하십시오.
   참고: 200 μL 팁을 10mL 주사기 노즐에 연결하여 집에서 만든 플러싱 주사기를 얻을 수 있습니다.
4. 공 팁 가위를 사용하여 세로로 장들을 엽니다( 재료표 참조) (조직을 손상시키지 않도록).
5. 집게를 사용하여, 실온에서 차가운 DPBS-P/S를 포함하는 페트리 접시에 조직을 옮기고 헹구기 위하여 흔들어.
6. 플라스틱 파스퇴르 파이펫으로, 포부로 내장을 잡고 10mL 콜드 10mMM EDTA가 들어있는 15mL 튜브 로 전송합니다.
7. 튜브를 3번 반전시키고 얼음에 10분 동안 배양합니다.
8. 플라스틱 파스퇴르 파이펫을 사용하여 10mL DPBS를 함유한 튜브 F1 에서 조직을 이송합니다. 2 분 동안 소용돌이 (정상적인 소용돌이에서 튜브를 손으로 잡고 창자가 잘 소용돌이지 확인).
9. 페트리 접시에 분획의 10 μL을 넣고 현미경으로 분수의 품질을 평가합니다.
   참고: 모든 소용돌이 단계는 최대 속도로 수행되며, 각 분획의 품질은 현미경(그림 1)에서 평가되어야 합니다.
10. 플라스틱 파스퇴르 파이펫으로, 포부로 내장을 잡고 2 분 동안 10 mL DPBS와 소용돌이가 들어있는 튜브 F2 로 전송하십시오.
11. 반복 단계 2.10, 튜브 F3 에서 조직을 전송하여 10mL DPBS 및 소용돌이를 2 분 동안 함유한다.
12. 10mM EDTA를 포함하는 튜브 E2 에서 조직을 이송하는 단계 2.6에서와 같이 EDTA 인큐베이션을 반복한다.
13. 튜브를 3번 반전시키고 얼음에 5분 동안 배양합니다.
14. 반복 단계 2.10, 튜브 F4 에서 조직을 전송하여 10mL DPBS 및 소용돌이를 3 분 동안 함유한다.
15. 반복 단계 2.14, 튜브 F5 에서 조직을 전송하여 10mL DPBS 및 소용돌이를 3 분 동안 함유한다.
16. 반복 단계 2.15, 튜브 F6 에서 조직을 전송하여 10mL DPBS 및 소용돌이를 3 분 동안 함유한다.
17. 70 μm 셀 스트레이너를 통해 중력에 의해 필터링되는 최고의 분수를 50mL 튜브(얼음 위)에 결합하여 사악하고 중요한 이물질을 제거합니다.
    참고 : 일반적으로 F5와 F6는 수많은 토굴과 적은 파편을 포함하는 분수입니다.
18. 4°C에서 150xg 에서 3분 동안 토굴을 회전시합니다.
19. 튜브를 비우고 펠릿을 기계적으로 방해하고 차가운 DMEM /F12 5 mL을 추가하십시오.
20. 페트리 접시에 서스펜션의 10 μL을 넣고 현미경으로 수동으로 알리쿼트에 존재하는 토굴의 수를 계산합니다.
    참고: 단일 셀이나 작은 파편을 계산하지 마십시오.
21. 300개의 토굴이 우물당 도금되고, W는 우물의 수이고, N은 서스펜션의 10μL 중계산된 토굴의 수입니다. 새로운 15mL 튜브로 토굴을 전송합니다.
    참고: V = 300 x W x 10/N. 계획된 실험에서 소량의 부피를 사용하는 경우 1.5mL 원심분리기 튜브를 사용할 수 있습니다.
22. 4°C에서 200 x g 에서 3분 동안 토굴을 회전시합니다.
23. 파이펫을 사용하여 상체를 조심스럽게 제거합니다.
24. 기계적으로 펠릿을 방해하고 부드럽게 90 지하실 / μL의 농도를 얻기 위해 성장 배양 매체를 추가합니다.
25. 2부량의 희석되지 않은 BMM을 추가하여 30개의 지하실/μL의 최종 농도를 갖습니다.
    참고: BMM 응고를 피하기 위해 항상 튜브를 얼음 위에 보관하십시오.
26. 소굴의 10 μL/BMM 믹스를 각 우물에 넣습니다. 유동 세포 측정 해석의 경우 라운드 하단 96웰 플레이트를 사용합니다. 각각의 중앙에 10 μL과 돔을 분배합니다. 이미징의 경우 μ 슬라이드 8을 잘 사용하고( 재료 표 참조)를 사용하여 10 μL을 얇은 층으로 증착합니다.
    참고: 내장 분석의 얇은 층으로 오르가노이드를 플레이트하여 심층 이미징을 가능하게 합니다.
27. BMM이 고화될 수 있도록 RT에 5분 동안 플레이트를 둡니다. 플레이트를 인큐베이터에 37°C, _CO25 %에 15분 동안 놓습니다.
28. BMM을 분리하지 않도록 주의하여 각 우물에 250 μL의 성장 매체를 추가합니다.
29. 인큐베이터에 플레이트를 37°C 및 5% _CO2로 놓습니다.
30. 문화의 4일과 6일 사이에 ROS 분석을 수행합니다. 그렇지 않으면, 배지를 변경하고 여러 긴 신진 구조의 출현 후 및 죽은 세포가 오르가노이드 루멘에 축적 될 때 오르가노이드를 분할.

3. 오르가노이드 패시징

1. 중요한 신진 구조가 형성되고 오르가노이드 루멘이 어두워진 문화 6^일째 부터 소장 오르가노이드를 전달하기 시작합니다.
   참고: 유기체의 루멘은 죽은 세포, 파편 및 점액의 축적으로 인해 어두워집니다. 분할하기 전에 오르가노이드가 과도하게 자라지 않도록 하십시오. 분할 비율은 오르가노이드의 성장에 따라 달라집니다. 10일째에 1:2, 1:3의 비율로 오르가노이드를 전달하는 것이 좋습니다.
2. 차가운 고급 DMEM / F-12의 4 mL로 15 mL 튜브를 채우고 얼음에 보관하십시오.
   참고 : 여기에 96 웰 문화 판에 대한 볼륨이 제공됩니다. 다른 형식을 사용하는 경우 볼륨을 적절하게 조정합니다.
3. BMM 돔을 건드리지 않고 우물에서 파이펫이나 진공 펌프로 매체를 조심스럽게 흡인하고 폐기하십시오.
4. 100 μL의 콜드 어드밴스드 DMEM/F-12를 잘 넣습니다. 파이펫은 BMM을 분해하고 우물의 함량을 15mL 튜브로 전송합니다.
5. 200 μL 콜드 어드밴스드 DMEM/F-12로 우물을 씻고 동일한 튜브로 수집합니다.
   참고: 동일한 실험 조건에서 여러 우물을 전달하는 경우, 우물의 내용물도 동일한 15mL 수집 튜브로 풀릴 수 있습니다.
6. 15mL 수집 튜브를 100 x g 에서 4°C에서 5분 동안 회전합니다.
7. 상체를 버리고 1mL의 콜드 어드밴스드 DMEM/F-12를 펠릿에 넣습니다. P1000 팁을 사용하여 P10 팁(필터 제외)과 파이펫을 20회 이상 위아래로 차지합니다.
8. 튜브에 차가운 고급 DMEM / F-12의 4 mL을 추가합니다. 4°C에서 5분 동안 300 x g 에서 회전합니다.
9. 펠릿을 방해하지 않고 파이펫이나 진공 펌프로 슈퍼너티드를 흡인합니다. 그런 다음 펠릿을 기계적으로 방해합니다.
10. 성장 배양 배지에 희석된 BMM을 추가합니다(2:1 비율). 거품을 믹스에 도입하지 않고 조심스럽게 위아래로 피펫.
11. 소굴의 10 μL/BMM 믹스를 각 우물에 넣습니다.
12. BMM이 고화될 수 있도록 RT에서 5분 동안 플레이트를 유지합니다. 플레이트를 인큐베이터에 37°C, _CO25 %에 15분 동안 놓습니다.
13. 각 우물에 250 μL의 성장 매체를 추가합니다.
    참고: BMM을 분리하지 않도록 주의하십시오.
14. 인큐베이터에 플레이트를 37°C 및 5% _CO2로 놓습니다.

4. 장 내장 에서 산화 스트레스를 평가하기 위해 시약 및 재료의 준비

1. 억제제 N-아세틸시스테인(NAC)의 250mM 스톡 용액을 준비하여( 재료표 참조), DPBS 245 μL로 10 mg을 재차판시합니다. 1 mM 최종 농도에서 사용하십시오.
2. 유도자 테르트 부틸 하이드로퍼산화물(tBHP)의 50mM 스톡 솔루션을 준비하여 물 속 70%를, DPBS의 496.8 μL로 3.22 μL을 희석시다. 200 μM 최종 농도에서 사용하십시오.
3. 유동 세포측정 연구의 경우, DMSO에서 주식 용액 1/10을 희석하여 불소 물질 프로브의 250 μM 작업 용액( 재료 표 참조)을 준비하십시오. 1 μM 최종 농도에서 사용하십시오.
   참고: 제조업체의 지침에 명시된 바와 같이, 불소 성 프로브는 빛과 산소에 민감합니다. 주식과 알리쿼트가 열리고 너무 여러 번 닫아서는 안됩니다.
4. 이미징 연구를 위해, DMSO에서 스톡 용액 1/2를 희석시킴으로써 불소 성 프로브의 1.25 mM 작업 용액을 준비하십시오. 5 μM 최종 농도에서 사용하십시오.
5. DPBS에서 0.1 μg/mL DAPI의 최종 솔루션을 준비하여 유동 세포 분석에서 사세포 차별에 사용할 수 있습니다.
6. 희석 Hoechst 33342 받는 방법 1.25 DPBS에서 mg/mL. 5 μg/mL 최종 농도에서 사용하여 이미징 분석에서 핵 염색에 사용하십시오.
7. 37 °C에서 페놀 레드없이 따뜻한 DMEM.
   참고: 이러한 단계는 그림 2A에 표시된 조건을 사용하여 모든 분석서에 포함해야 하는 음수 및 양수 컨트롤을 사용하여 설명합니다. 분석은 항 산화 화합물 또는 프로 산화 화합물을 테스트 하는 데 사용할 수 있습니다. 단계는 동일하며, 유일한 차이점은 불소염염을 사용하기 전에 화합물을 첨가할 때입니다.

5. 공초점 현미경검사법에 의한 3D 오르가노이드의 산화 스트레스 시각화

1. μ-슬라이드 8 웰 챔버에서 도금된 오르가노이드를 가져와 해당 우물에 1 μL NAC 스톡 용액을 추가하여 최종 농도를 1mM로 얻습니다.
2. 37°C에서 1h 및 5% _CO2에 대한 배양.
3. 해당 우물에 1 μL tBHP 스톡 솔루션을 추가하여 200 μM의 최종 농도를 얻습니다.
4. 37°C에서 30분, _CO2 5% 배양합니다.
5. 불소형 프로브의 1.25 mM 희석의 우물 당 1 μL을 추가하여 5 μM의 최종 농도를 얻습니다.
6. Hoescht의 1.25 mg/mL 희석의 우물 당 1 μL을 추가하여 5 μg/mL의 최종 농도를 얻습니다.
7. 37°C에서 30분, _CO2 5% 배양합니다.
8. BMM을 방해하지 않고 매체를 제거합니다. 페놀 레드 없이 따뜻한 DMEM 250μL을 부드럽게 넣으세요.
   참고: 장기 인수를 계획하는 경우 페놀 레드 없이 DMEM에 성장 인자 화합물을 추가합니다.
9. 불소 질(ROS)을 검출하는 저혈챔버 및 가스 공급이 장착된 공초점 현미경을 사용하여 유기체를 이미지합니다.
   참고: 불소 발생 프로브에 대한 흥분/방출(ex/em)은 644/665, Hoechst(nuclei)에 대한 ex/em은 361/486이며, GFP에 대한 전/em(Lgr5-GFP 마우스의 장 줄기 세포)은 488/510이다. 63배 오일 침수 목표는 줄기 세포의 신호를 감지하는 데 사용됩니다. 샘플 간에 레이저 설정을 변경하지 마십시오. ROS 프로덕션에 대한 개요를 허용하는 데 20배 목표를 사용할 수 있습니다.
10. 양수 제어를 사용하여 ROS 신호에 대한 레이저 강도 및 시간 노출을 설정하고 이 신호가 음수 제어에서 더 낮은지 확인합니다.
11. 안면 화면을 사용하여 슬라이드를 사용하여 레이저 강도를 표현하는 GFP 오르가노이드를 식별하고 조정합니다.
    참고: 이 단계는 수동으로 수행됩니다.
12. 위치를 정의하여 전체 오르가노이드의 스티치 이미지를 얻습니다. 25 μm (단계 크기 5 μm)의 z 스택을 설정하여 세포의 한 층을 보여주는 오르가노이드의 단면을 얻습니다.
    참고: 현미경 사용자 설명서를 참조하여 설정을 최적화합니다. 살아있는 세포를 사용하여, 취득은 인큐베이션의 끝 후에 1 시간 안에 행해져야 합니다.
13. 오픈 소스 이미지 처리 소프트웨어에서 이미지를 엽니 다(재료 표 참조).
14. z 스택을 살펴보고 오르가노이드의 중간이 잘 표현되는 섹션을 선택하고 선택한 영역을 사용하여 새 이미지를 만듭니다.
15. 단계 당 이미지를 정량화 5.15.1 - 5.15.5.
    1. 프리핸드 라인 도구를 선택합니다.
    2. 핵 다음에 선을 그립니다.
       참고: 줄기 세포만 분석하는 경우 GFP 양성 세포를 나타내는 영역만 선택합니다.
    3. 선 폭을 늘려 발광 파편을 포함하지 않고 선으로 세포층을 덮습니다.
    4. ROS 신호에 대한 채널을 선택하고 선택한 영역의 형광 강도를 측정하고 값에 인음을 추가합니다.
    5. 신호가 없는 선을 그리고 최종 강도를 얻기 위해 이전 값으로 빼는 배경의 형광 강도를 측정합니다.

6. 유동 세포계를 사용하여 해리된 오르가노이드에 산화 스트레스의 정량화

1. 음수 컨트롤을 위해 우물에 1 μL NAC 스톡 솔루션을 추가하여 최종 농도가 1mM입니다.
   참고: 96웰의 라운드 하단 플레이트에 도금된 오르가노이드를 사용합니다.
2. 37°C에서 1h 및 5% _CO2에 대한 배양.
3. 해당 우물에 1 μL tBHP 스톡 솔루션을 추가하여 200 μM의 최종 농도를 얻습니다.
4. 37°C에서 30분, _CO2 5% 배양합니다.
5. 멀티채널 파이펫을 사용하면 연결된 BMM을 방해하지 않고 매체를 제거하고 다른 96웰 라운드 하단 플레이트로 전송합니다. 이 접시를 따로 두십시오.
6. 트립신 100 μL을 추가하고 멀티 채널 파이펫으로 피펫을 5회 이상 위아래로 추가하여 BMM을 파괴합니다.
7. 37°C 및 5% _CO2에서 5분 이상 인큐베이션을 합니다.
8. 멀티채널 파이펫을 사용하면 오가노이드를 해리하기 위해 피펫을 적어도 5배 이상 위아래로 제거합니다.
9. RT에서 5 분 동안 300 x g 에서 회전하십시오.
10. 플레이트를 반전시켜 상체를 폐기합니다. 해당 우물에 6.3 단계에서 수집된 배지를 다시 추가하고 5회 위아래로 피펫팅하여 세포를 다시 중단합니다.
11. 1 μM의 최종 농도에서 불소 발생 프로브를 추가합니다. 250 μM 희석에서 우물당 1 μL을 추가하고 37°C에서 30분 동안 배양하고 5% _CO2로 배양한다.
    참고: 악기 설정에 필요한 우물에 형광 프로브를 추가하지 마십시오(그림 2B).
12. RT에서 5 분 동안 300 x g 에서 회전하십시오.
13. 0.1 μg/mL DAPI 용액의 250 μL로 셀을 다시 일시 중지합니다. 적절한 유동 세포측정관에서 샘플을 옮기고, 튜브를 얼음 위에 보관하고, 분석을 진행한다.
    참고: 기기 설정에 필요한 웰에 DAPI 대신 PBS를 추가합니다(그림 2B).
14. 모노 스테인드 샘플을 사용하여 각 불소에 대한 스테인드 컨트롤 및 레이저 전압에서 전방 및 측면 산란 전압 설정을 최적화합니다.
15. 적절한 게이팅 전략(그림 4A)을 사용하여 최소 20,000개의 이벤트를 수집합니다.
    참고: 50,000개의 이벤트가 선호됩니다. 자세한 획득 설정은 사용되는 계측기에 따라 다릅니다.

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결과

설명된 프로토콜의 개념 증명으로서, 장줄기 세포가 바커 등에서 확립한 모자이크 GFP 발현을 표시하는 Lgr5-eGFP-IRES-CreERT2 마우스 라인에서 얻은 토굴^{은 처음에 장} 줄기 세포를 특성화하고 GFP 발현에 기초하여 이러한 세포를 매핑할 수 있도록 사용되었다. 모델은 상이한 처리시 특정 세포 유형 집단에서 ROS 수준을 비교하기 위하여 제공됩니다. ROS 억제제(NAC)가 사용되었고, 유도제(...

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토론

이 작품은 뮤직 제주네아네아의 토굴을 분리하고, 3D 오르간노이드로 배양하고, ROS에 민감한 플루오로겐성 프로브를 전체 오르가노이드의 질적 현미경 영상과 결합하여 오르가노이드 변화 후 단일 세포에 대한 유동 세포측정을 사용하여 분석하는 단계별 프로토콜을 제공한다.

이 방법의 첫 번째 중요한 단계는 암호화 추출 프로시저입니다. 실제로, 토굴 준비의 품질은 성공?...

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자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
Mice
Lgr5-EGFP-IRES-creERT2 (Lgr5-GFP)	The Jackson Laboratory
Growth culture medium
Advanced DMEM F12 (DMEM/F12)	ThermoFisher	12634010
B-27 Supplement, minus vitamin A	ThermoFisher	12587010	Stock Concentration: 50x
GlutaMAX (glutamine)	ThermoFisher	35050038	Stock Concentration: 100x
Hepes	ThermoFisher	15630056	Stock Concentration: 1 M
Murine EGF	R&D	2028-EG-200	Stock Concentration: 500 µg/mL in PBS
murine Noggin	R&D	1967-NG/CF	Stock Concentration: 100 µg/mL in PBS
Murine R-spondin1	R&D	3474-RS-050	Stock Concentration: 50 µg/mL in PBS
N-2 Supplement	ThermoFisher	17502048	Stock Concentration: 100x
Penicillin-Streptomycin (P/S)	ThermoFisher	15140122	Stock Concentration: 100x (10,000 units/mL of penicillin and 10,000 µg/mL of streptomycin)
Material
70 µm cell strainer	Corning	352350
96-well round bottom	Corning	3799
ball tip scissor	Fine Science Tools GMBH	14086-09
CellROX® Deep Red Reagent	ThermoFisher	C10422
DAPI (4’,6-diamidino-2-phénylindole, dichlorhydrate) (fluorgenic probe)	ThermoFisher	D1306	stock at 10 mg/mL
DPBS 1x no calcium no magnesium (DPBS)	ThermoFisher	14190144
FLuoroBrite DMEM (DMEM no phenol red)	ThermoFisher	A1896701
Hoechst 33342	ThermoFisher	H3570	stock at 10 mg/mL
Matrigel Growth Factor Reduced, Phenol Red Free (Basement Membrane Matrix)	Corning	356231	once received thaw o/n in the fridge, keep for 1h on ice and, make 500 mL aliquots and store at -20 °C
µ-Slide 8 Well chambers	Ibidi	80826
N-acetylcysteine (NAC)	Sigma	A9165
tert-Butyl hydroperoxide (tBCHP)solution (70%wt. In H2O2)	Sigma	458139
TrypLE Express Enzyme (1X), no phenol red (trypsin)	ThermoFisher	12604013
UltraPure 0.5 M EDTA, pH8.0	ThermoFisher	15575020
Y-27632	Sigma	Y0503	Rock-inhibitor to be used to minimize cell death upon tissue dissociation
Programs and Equipment
Attune NxT (Flow Cytometer)	ThermoFischer		Flow cytometer analyzer
Fiji/ImageJ	https://imagej.net/software/fiji/downloads		images generation
FlowJo	BD Bioscience		FACS analysis
Observer.Z1	Zeiss		confocal system
Opterra (swept-field confocal)	Bruker		confocal system
high speed EMCCD Camera Evolve Delta 512	Photometrics		confocal system
Prism	GraphPad Software		statistical analysis