Analyse von oxidativem Stress in murinen Darmorganoiden mit reaktiver Sauerstoffspezies-sensitiver fluorogener Sonde

Zusammenfassung

Das vorliegende Protokoll beschreibt eine Methode zum Nachweis reaktiver Sauerstoffspezies (ROS) in den intestinalen murinen Organoiden unter Verwendung qualitativer Bildgebung und quantitativer Zytometrie-Assays. Diese Arbeit kann möglicherweise auf andere fluoreszierende Sonden ausgedehnt werden, um die Wirkung ausgewählter Verbindungen auf ROS zu testen.

Zusammenfassung

Reaktive Sauerstoffspezies (ROS) spielen eine wesentliche Rolle bei der intestinalen Homöostase. ROS sind natürliche Nebenprodukte des Zellstoffwechsels. Sie werden als Reaktion auf Infektionen oder Verletzungen auf Schleimhautebene produziert, da sie an antimikrobiellen Reaktionen und Wundheilung beteiligt sind. Sie sind auch kritische sekundäre Botenstoffe, die mehrere Wege regulieren, einschließlich Zellwachstum und -differenzierung. Auf der anderen Seite führen übermäßige ROS-Spiegel zu oxidativem Stress, der für Zellen schädlich sein kann und Darmerkrankungen wie chronische Entzündungen oder Krebs begünstigt. Diese Arbeit bietet eine einfache Methode zum Nachweis von ROS in den murinen Organoiden des Darms durch Live-Bildgebung und Durchflusszytometrie unter Verwendung einer kommerziell erhältlichen fluorogenen Sonde. Hier beschreibt das Protokoll die Untersuchung der Wirkung von Verbindungen, die das Redoxgleichgewicht in Darmorganoiden modulieren und ROS-Spiegel in bestimmten Darmzelltypen nachweisen, veranschaulicht hier durch die Analyse der mit GFP genetisch markierten Darmstammzellen. Dieses Protokoll kann mit anderen Fluoreszenzsonden verwendet werden.

Einleitung

Reaktive Sauerstoffspezies (ROS) sind natürliche Nebenprodukte des Zellstoffwechsels. Sie können auch aktiv durch spezialisierte enzymatische Komplexe wie die membrangebundenen NADPH-Oxidasen (NOX) und Dual-Oxidasen (DUOX) hergestellt werden, die Superoxidanion und Wasserstoffperoxid1 ^erzeugen. Durch die Expression von antioxidativen Enzymen und ROS-Aasfressern können Zellen ihr Redoxgleichgewicht fein abstimmen und so die Gewebehomöostase ^schützen2. Obwohl ROS für die Zellen hochgiftig sein und DNA, Proteine und Lipide schädigen kann, sind sie entscheidende ^{Signalmoleküle2}. Im Darmepithel sind moderate ROS-Spiegel für die Proliferation von Stamm- und Vorläuferzellen ^{erforderlich3}; hohe ROS-Werte führen zu ihrer Apoptose4. Chronischer oxidativer Stress ist mit vielen Magen-Darm-Erkrankungen wie entzündlichen Darmerkrankungen oder Krebs verbunden. In einem Mausmodell für Wnt-getriebenen Darmkrebs wurde beispielsweise festgestellt, dass eine erhöhte ROS-Produktion durch Aktivierung von NADPH-Oxidasen für die Hyperproliferation von Krebszellen erforderlich ^ist5,6. Zu definieren, wie Darmzellen, insbesondere Stammzellen, Stammzellen mit oxidativem Stress umgehen und wie die zelluläre Umgebung diese Kapazität beeinflussen kann, ist wichtig, um die Ätiologie dieser Krankheit besser zu ^verstehen7.

In einem Gewebe weisen verschiedene Zelltypen einen basalen oxidativen Zustand auf, der je nach ihrer Funktion und ihrem Stoffwechsel und der Expression unterschiedlicher Mengen an oxidativen und antioxidativen Molekülen variieren ^kann4,7. Die Überwachung von ROS in vivo ist eine große Herausforderung. Zellpermeable Farbstoffe, die Fluoreszenz entsprechend ihrem Redoxzustand emittieren, wurden entwickelt, um zelluläre ROS in lebenden Zellen und Tieren sichtbar zu machen und zu messen. Ihre Wirksamkeit hängt jedoch von ihrer Diffusion in lebenden Geweben und ihrer schnellen Auslesung ab, was ihre Verwendung in Tiermodellen ^erschwert8.

In der Vergangenheit wurde die Untersuchung der Wirkung von Verbindungen auf die ROS-Erzeugung unter Verwendung von Zelllinien durchgeführt, was jedoch möglicherweise nicht die In-vivo-Situation widerspiegelt. Das darmorganoide Modell, das von der Gruppe von ^Clevers9 entwickelt wurde, ermöglicht das Wachstum von intestinalen Primärzellen ex vivo. Die Kultur von Darmkrypten in Matrizen führt in Gegenwart definierter Wachstumsfaktoren zu dreidimensionalen Strukturen, organoiden (Mini-Darm) genannten Strukturen, die die Krypten-Zotten-Organisation reproduzieren, wobei Zellen aus den verschiedenen Epithellinien ein inneres Lumen auskleiden und die Darmstammzellen in kleinen kryptenartigen Vorsprüngen leben.

Hier wird unter Ausnutzung dieses Modells eine einfache Methode beschrieben, um oxidativen Stress in primären Darmzellen mit der Einzelzellauflösung zu untersuchen, indem ein kommerziell erhältlicher ROS-sensitiver Farbstoff in das Organoidkulturmedium gegeben wird.

Plattenleser werden häufig verwendet, um die ROS-Produktion in einer Gesamtpopulation zu erkennen. Dieses Protokoll verwendet Durchflusszytometrie oder bildgebende Assays, um ROS in einem bestimmten Zelltyp mit genetisch veränderten Zellen oder spezifischer Antikörperfärbung nachzuweisen. Diese Arbeit umfasst die intestinale Organoidkultur der Maus und die ROS-Visualisierung durch konfokale Bildgebung und Quantifizierung durch Durchflusszytometrie. Mit Lgr5-GFP-Mäuse-abgeleiteten Dünndarm-Organoiden ist es möglich, das Niveau des oxidativen Stresses in Darmstammzellen nach verschiedenen Behandlungen spezifisch zu analysieren. Dieses Protokoll kann angepasst werden, um den Einfluss exogener Moleküle, wie z. B. mikrobiota-abgeleitetes Muramyl-Dipeptid (MDP)¹⁰, auf die ROS-Waage zu testen, nachdem Organoide mit den ausgewählten Verbindungen stimuliert wurden.

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Protokoll

Alle Tierversuche wurden nach Genehmigung durch das Verwendungskomitee des Institut Pasteur und durch das französische Landwirtschaftsministerium Nr. 2016-0022 durchgeführt. Alle Schritte werden in einer Gewebekulturhaube durchgeführt.

1. Herstellung von Reagenzien und Materialien zur Kultivierung von Darmorganoiden

1. Zur Herstellung des Wachstumskulturmediums mischen Sie fortgeschrittenes DMEM/F-12, ergänzt mit 1x Glutamin, 1x Penicillin/Streptomycin (P/S)-Lösung, 10 mM HEPES, 50 ng/ml murinem EGF, 20 μg/ml murinem Noggin 500 ng/ml Maus R-Spondin1 (siehe Materialtabelle). Lassen Sie das Medium während der Extraktion der Krypta bei Raumtemperatur (RT).
   HINWEIS: Das nicht verwendete Medium in Aliquots bei -20 °C einfrieren. Einfrieren und Auftauen vermeiden.
2. Füllen Sie ein 50-ml-Rohr mit 40 ml Advanced DMEM / F-12 und halten Sie es auf Eis.
   HINWEIS: Bewahren Sie das unbenutzte Medium bei 4 °C auf. Es wird für Organoide passaging verwendet.
3. Die Zellkulturplatten (μ-Slide 8 Well Chambers und/oder 96-Well Round Bottom) im Inkubator bei 37 °C vorwärmen.
4. Auftauen der Basalmembranmatrix (BMM) (siehe Materialtabelle) aliquots auf Eis (vor Beginn des Protokolls oder mindestens 1 h vor dem Plattieren von Krypten).
   HINWEIS: Das BMM erstarrt schnell, wenn es nicht kalt gehalten wird.
5. Bereiten Sie eine Wasch-/Spüllösung vor, die DPBS (DPBS-P/S) 1% Penicillin-Streptomycin-Lösung hinzufügt.
6. Füllen Sie eine 100 mm Petrischale mit 10 mL kaltem DPBS-P/S. Füllen Sie sechs 15 mL Röhrchen mit 10 mL DPBS und beschriften Sie sie von F1 bis F6.
7. 30 ml 10 mM EDTA-Lösung durch Verdünnung von 0,5 M EDTA in DPBS herstellen. Füllen Sie zwei 15-ml-Röhrchen mit 10 mL 10 mM EDTA und beschriften Sie sie mit E1 und E2.
8. Halten Sie alle Lösungen bei 4 ° C vorgekühlt und halten Sie sie während des Eingriffs auf dem Eis.

2. Intestinale Organoidkultur

1. Opfern Sie eine 8-10 Wochen alte Lgr5-EGFP-IRES-creERT2 (Lgr5-GFP) Maus gemäß den nationalen Regeln und Vorschriften.
2. Sammeln Sie 5-8 cm des Jejunums, das den Bereich zwischen dem Zwölffingerdarm (5 cm vom Magen) und dem Ileum (10 cm vom Blinddarm entfernt) umfasst, und bewahren Sie DPBS-P / S in kaltem DPBS-P / S auf Eis auf.
3. Reinigen Sie den Darminhalt durch Spülen mit 5-10 ml kaltem DPBS-P / S.
   HINWEIS: Hausgemachte Spülspritzen können erhalten werden, indem eine 200-μL-Spitze auf eine 10-ml-Spritzendüse gesteckt wird.
4. Öffnen Sie den Darm längs mit einer Kugelspitzenschere (siehe Materialtabelle) (um eine Schädigung des Gewebes zu vermeiden).
5. Mit einer Pinzette das Gewebe in eine Petrischale mit kaltem DPBS-P/S bei Raumtemperatur überführen und zum Spülen schütteln.
6. Greifen Sie mit einer Pasteur-Pipette aus Kunststoff den Darm durch Aspiration und übertragen Sie ihn in ein 15-ml-Röhrchen mit der Aufschrift E1 , das 10 ml kalte 10 mM EDTA enthält.
7. 3-mal umkehren und 10 min auf Eis inkubieren.
8. Übertragen Sie das Gewebe mit einer Pasteur-Pipette aus Kunststoff in das Röhrchen F1 , das 10 ml DPBS enthält. Wirbel für 2 min (bei normalem Wirbel, die Röhre von Hand halten und sicherstellen, dass der Darm schön wirbelt).
9. Geben Sie 10 μL der Fraktion in eine Petrischale und beurteilen Sie die Qualität der Fraktion unter einem Mikroskop.
   HINWEIS: Alle Wirbelschritte werden mit maximaler Geschwindigkeit durchgeführt, und die Qualität jeder Fraktion sollte unter dem Mikroskop beurteilt werden (Abbildung 1).
10. Mit einer Kunststoff-Pasteurpipette den Darm durch Aspiration greifen und in Röhrchen F2 mit 10 ml DPBS und Wirbel für 2 min übertragen.
11. Wiederholen Sie Schritt 2.10 und übertragen Sie das Gewebe in Röhrchen F3 mit 10 ml DPBS und Wirbel für 2 min.
12. Wiederholen Sie die EDTA-Inkubation wie in Schritt 2.6 und übertragen Sie das Gewebe in das Röhrchen E2 , das 10 mM EDTA enthält.
13. 3 Mal die Röhre umkehren und 5 min auf Eis inkubieren.
14. Wiederholen Sie Schritt 2.10 und übertragen Sie das Gewebe in Röhrchen F4 mit 10 ml DPBS und Wirbel für 3 min.
15. Wiederholen Sie Schritt 2.14 und übertragen Sie das Gewebe in Röhrchen F5 mit 10 ml DPBS und Wirbel für 3 min.
16. Wiederholen Sie Schritt 2.15 und übertragen Sie das Gewebe in Röhrchen F6 mit 10 ml DPBS und Wirbel für 3 min.
17. Kombinieren Sie die besten Fraktionen, die durch schwerkraftgefiltert werden, durch ein 70 μm-Zellsieb in einem 50-ml-Röhrchen (auf Eis), um Zotten und erhebliche Ablagerungen zu beseitigen.
    HINWEIS: Normalerweise sind F5 und F6 die Fraktionen, die zahlreiche Krypten und weniger Trümmer enthalten.
18. Drehen Sie die Krypten bei 150 x g bei 4 °C für 3 min.
19. Entleeren Sie das Rohr, zerlegen Sie das Pellet mechanisch und fügen Sie 5 ml kaltes DMEM/F12 hinzu.
20. Geben Sie 10 μL der Suspension in eine Petrischale und zählen Sie die Anzahl der im Aliquot vorhandenen Krypten manuell unter einem Mikroskop.
    HINWEIS: Zählen Sie keine einzelnen Zellen oder kleinen Ablagerungen.
21. Berechnen Sie das Volumen (V) der benötigten Kryptensuspension in μL, wobei zu berücksichtigen ist, dass 300 Krypten pro Vertiefung plattiert sind, W die Anzahl der Vertiefungen und N die Anzahl der Krypten, die von 10 μL der Suspension gezählt werden. Übertragen Sie die Krypten in eine neue 15-ml-Röhre.
    HINWEIS: V = 300 x B x 10/N. Wird im geplanten Experiment ein kleines Volumen verwendet, kann ein 1,5 mL Zentrifugenröhrchen verwendet werden.
22. Drehen Sie die Krypten bei 200 x g bei 4 °C für 3 min.
23. Entfernen Sie den Überstand vorsichtig mit einer Pipette.
24. Zerlegen Sie das Pellet mechanisch und fügen Sie vorsichtig Wachstumskulturmedium hinzu, um eine Konzentration von 90 Krypten / μL zu erhalten.
25. Fügen Sie 2 Volumina unverdünntes BMM hinzu, um eine Endkonzentration von 30 Krypten / μL zu erhalten.
    HINWEIS: Bewahren Sie das Rohr immer auf Eis auf, um eine BMM-Erstarrung zu vermeiden.
26. Platte 10 μL der Krypten/BMM mischen in jede Vertiefung. Verwenden Sie für die Durchflusszytometrie-Analyse runde 96-Well-Platten. Verteilen Sie 10 μL in der Mitte jeder Vertiefung als Kuppel. Für die Bildgebung verwenden Sie μ-Slide 8 Well (siehe Materialtabelle) und legen Sie die 10 μL als dünne Schicht ab.
    HINWEIS: Platten Sie die Organoide als dünne Schicht für den Bildgebungstest, um ihre eingehende Bildgebung zu ermöglichen.
27. Lassen Sie die Platte 5 Minuten bei RT stehen, damit das BMM erstarren kann. Legen Sie die Platte bei 37 °C und 5% _CO2 für 15 min in den Inkubator.
28. Fügen Sie 250 μL Wachstumsmedium in jede Vertiefung hinzu und achten Sie darauf, das BMM nicht zu lösen.
29. Legen Sie die Platten bei 37 °C und 5% _CO2 in den Inkubator.
30. Führen Sie die ROS-Analyse zwischen den Tagen 4 und 6 der Kultur durch. Andernfalls wechseln Sie das Medium und spalten die Organoide nach dem Auftreten mehrerer und langer knospender Strukturen und wenn sich abgestorbene Zellen in den Organoidlumen ansammeln.

3. Organoide passieren

1. Beginnen Sie ab dem 6^. Tag der Kultur mit der Übertragung von Dünndarmorganoiden, wenn sich signifikante knospende Strukturen gebildet haben und die Organoidlumen dunkel geworden sind.
   HINWEIS: Das Lumen des Organoids wird aufgrund der Ansammlung von toten Zellen, Trümmern und Schleim dunkel. Vermeiden Sie es, die Organoide vor dem Spalten überwachsen zu lassen. Das Spaltverhältnis hängt vom Wachstum der Organoide ab. Es wird empfohlen, die Organoide mit einem Verhältnis von 1:2 an Tag 6 und 1:3 an Tag 10 zu übergeben.
2. Füllen Sie ein 15-ml-Röhrchen mit 4 ml kaltem Advanced DMEM/F-12 und bewahren Sie es auf Eis auf.
   HINWEIS: Hier werden Bände für eine 96-Well-Kulturplatte bereitgestellt. Wenn ein anderes Format verwendet wird, passen Sie die Lautstärke entsprechend an.
3. Saugen Sie das Medium vorsichtig mit einer Pipette oder einer Vakuumpumpe aus den Vertiefungen ab, ohne die BMM-Kuppeln zu berühren, und entsorgen Sie es.
4. Fügen Sie 100 μL kaltes Advanced DMEM/F-12 pro Vertiefung hinzu. Pipettieren Sie auf und ab, um das BMM zu brechen und den Inhalt des Bohrlochs in das 15-ml-Rohr zu übertragen.
5. Waschen Sie den Brunnen mit 200 μL kaltem Advanced DMEM/F-12 und sammeln Sie ihn im selben Röhrchen.
   HINWEIS: Wenn mehrere Vertiefungen aus derselben Versuchsbedingung bestehen, kann der Inhalt der Vertiefungen im selben 15-ml-Sammelrohr gepoolt werden.
6. Das 15 mL Auffangröhrchen bei 100 x g für 5 min bei 4°C drehen.
7. Verwerfen Sie den Überstand und geben Sie 1 ml kaltes Advanced DMEM/ F-12 in das Pellet. Nehmen Sie mit einer P1000-Spitze eine P10-Spitze (ohne Filter) auf und pipettieren Sie mindestens 20 Mal nach oben und unten.
8. Geben Sie 4 ml kaltes Advanced DMEM/F-12 in die Röhre. Bei 300 x g 5 min bei 4°C drehen.
9. Saugen Sie den Überstand mit einer Pipette oder einer Vakuumpumpe ab, ohne das Pellet zu stören. Dann stören Sie das Pellet mechanisch.
10. BMM verdünnt in Wachstumskulturmedium (Verhältnis 2:1) hinzufügen. Vorsichtig auf und ab pipettieren, ohne Luftblasen in die Mischung einzuführen.
11. Platte 10 μL der Krypten/BMM mischen in jede Vertiefung.
12. Halten Sie die Platte 5 Minuten bei RT, damit das BMM erstarren kann. Legen Sie die Platte bei 37 °C und 5% _CO2 für 15 min in den Inkubator.
13. Fügen Sie 250 μL Wachstumsmedium in jede Vertiefung hinzu.
    HINWEIS: Achten Sie darauf, das BMM nicht zu lösen.
14. Legen Sie die Platten bei 37 °C und 5% _CO2 in den Inkubator.

4. Herstellung von Reagenzien und Materialien zur Beurteilung von oxidativem Stress in Darmorganoiden

1. Bereiten Sie eine 250 mM Stammlösung des Inhibitors N-Acetylcystein (NAC) vor (siehe Materialtabelle), resuspendieren Sie 10 mg mit 245 μL DPBS. Verwendung bei einer Endkonzentration von 1 mM.
2. Bereiten Sie eine 50 mM Stammlösung von Induktor Tert-Butylhydroperoxid (tBHP), 70% in Wasser, verdünnen Sie 3,22 μL mit 496,8 μL DPBS. Verwendung bei einer Endkonzentration von 200 μM.
3. Für die Durchflusszytometrie-Studie wird eine 250 μM Arbeitslösung einer fluorogenen Sonde (siehe Materialtabelle) durch Verdünnen der Stammlösung 1/10 in DMSO hergestellt. Verwendung bei 1 μM Endkonzentration.
   HINWEIS: Wie in den Anweisungen des Herstellers angegeben, ist die fluorogene Sonde licht- und sauerstoffempfindlich. Aktien und Aliquots sollten nicht zu oft geöffnet und geschlossen werden.
4. Bereiten Sie für die bildgebende Untersuchung eine 1,25 mM Arbeitslösung der fluorogenen Sonde vor, indem Sie die Stammlösung 1/2 in DMSO verdünnen. Verwendung bei einer Endkonzentration von 5 μM.
5. Bereiten Sie eine endgültige Lösung von 0,1 μg/ml DAPI in DPBS vor, die für die Unterscheidung toter Zellen im Durchflusszytometrie-Assay verwendet werden soll.
6. Hoechst 33342 auf 1,25 mg/ml in DPBS verdünnen. Verwendung bei einer Endkonzentration von 5 μg/ml für die Kernfärbung im bildgebenden Assay.
7. DmEM ohne Phenolrot bei 37 °C erwärmen.
   ANMERKUNG: Diese Schritte beschreiben die Verwendung von Negativ- und Positivkontrollen, die in alle Assays einbezogen werden müssen, unter Verwendung der in Abbildung 2A angegebenen Bedingungen. Der Assay kann verwendet werden, um anti- oder prooxidative Verbindungen zu testen. Die Schritte sind die gleichen, und der einzige Unterschied besteht darin, dass die Verbindungen vor der Verwendung des fluorogenen Farbstoffs hinzugefügt werden.

5. Visualisierung von oxidativem Stress in 3D-Organoiden mittels konfokaler Mikroskopie

1. Nehmen Sie die in den μ-Slide 8 Well-Kammern plattierten Organoide und geben Sie 1 μL NAC-Stammlösung in die entsprechenden Wells, um eine Endkonzentration von 1 mM zu erhalten.
2. 1 h bei 37 °C und 5% _{CO2 inkubieren}.
3. 1 μL tBHP-Stammlösung in die entsprechenden Vertiefungen geben, um eine Endkonzentration von 200 μM zu erhalten.
4. 30 min bei 37 °C und 5% _{CO2 inkubieren}.
5. Fügen Sie 1 μL pro Vertiefung der 1,25 mM Verdünnung der fluorogenen Sonde hinzu, um eine Endkonzentration von 5 μM zu erhalten.
6. 1 μL pro Vertiefung der 1,25 mg/ml Verdünnung von Hoescht wird zugegeben, um eine Endkonzentration von 5 μg/ml zu erhalten.
7. 30 min bei 37 °C und 5% _{CO2 inkubieren}.
8. Entfernen Sie das Medium, ohne das BMM zu stören. Fügen Sie vorsichtig 250 μL warmes DMEM ohne Phenolrot hinzu.
   HINWEIS: Wenn eine langfristige Akquisition geplant ist, fügen Sie DMEM Wachstumsfaktoren ohne Phenolrot hinzu.
9. Stellen Sie die Organoide mit einem konfokalen Mikroskop vor, das mit einer Thermischen Kammer und einer Gasversorgung ausgestattet ist, die die fluorogene Sonde (ROS) erkennt.
   ANMERKUNG: Die Anregung/Emission (ex/em) für die fluorogene Sonde beträgt 644/665, ex/em für Hoechst (Kerne) ist 361/486 und ex/em für GFP (intestinale Stammzelle aus den Lgr5-GFP-Mäusen) ist 488/510. Ein 63-faches Ölimmersionsobjektiv wird verwendet, um Signale in Stammzellen nachzuweisen. Ändern Sie die Lasereinstellungen nicht zwischen den Proben. Ein 20-faches Objektiv könnte verwendet werden, um einen Überblick über die ROS-Produktion zu erhalten.
10. Verwenden Sie die Positivkontrolle, um die Laserintensität und die Zeitbelichtung für das ROS-Signal einzurichten, und überprüfen Sie, ob dieses Signal in der Negativkontrolle niedriger ist.
11. Verwenden Sie den Okularschirm, um die GFP-Organoide zu identifizieren, die die Laserintensität ausdrücken, und anzupassen.
    HINWEIS: Dieser Schritt wird manuell ausgeführt.
12. Definieren Sie Positionen, um ein zusammengefügtes Bild des gesamten Organoids zu erhalten. Richten Sie einen Z-Stack von 25 μm (Schrittweite 5 μm) ein, um einen Abschnitt der Organoide zu erhalten, der eine Zellschicht zeigt.
    HINWEIS: Informationen zum Optimieren des Setups finden Sie im Benutzerhandbuch des Mikroskops. Unter Verwendung lebender Zellen sollte der Erwerb innerhalb von 1 h nach dem Ende der Inkubation erfolgen.
13. Öffnen Sie die Bilder in einer Open-Source-Bildverarbeitungssoftware (siehe Materialverzeichnis).
14. Gehen Sie durch den Z-Stapel und wählen Sie den Abschnitt, in dem die Mitte der Organoide gut dargestellt ist, und erstellen Sie ein neues Bild mit dem ausgewählten Bereich.
15. Quantifizieren Sie die Bilder gemäß den Schritten 5.15.1 - 5.15.5.
    1. Wählen Sie das Freihandlinienwerkzeug aus.
    2. Zeichne eine Linie nach den Kernen.
       HINWEIS: Wählen Sie nur Regionen mit GFP-positiven Zellen aus, wenn nur Stammzellen analysiert werden.
    3. Erhöhen Sie die Linienbreite, um die Zellebene mit der Linie zu bedecken, ohne die luminalen Ablagerungen einzubeziehen.
    4. Wählen Sie den Kanal für das ROS-Signal und messen Sie die Fluoreszenzintensität im ausgewählten Bereich und kommentieren Sie die Werte.
    5. Zeichnen Sie eine Linie, in der kein Signal vorhanden ist, und messen Sie die Fluoreszenzintensität des Hintergrunds, die auf den vorherigen Wert subtrahiert wird, um die endgültige Intensität zu erhalten.

6. Quantifizierung des oxidativen Stresses auf die dissoziierten Organoide mittels Durchflusszytometer

1. 1 μL NAC-Stammlösung in die Vertiefungen für Negativkontrollen geben, um eine Endkonzentration von 1 mM zu erhalten.
   HINWEIS: Verwenden Sie die Organoide, die in den 96-Well-Rundbodenplatten plattiert sind.
2. 1 h bei 37 °C und 5% _{CO2 inkubieren}.
3. 1 μL tBHP-Stammlösung in die entsprechenden Vertiefungen geben, um eine Endkonzentration von 200 μM zu erhalten.
4. 30 min bei 37 °C und 5% _{CO2 inkubieren}.
5. Entfernen Sie mit einer Mehrkanalpipette das Medium, ohne das angebrachte BMM zu stören, und übertragen Sie es auf eine weitere runde 96-Well-Bodenplatte. Halten Sie diesen Teller beiseite.
6. Fügen Sie 100 μL Trypsin hinzu und pipettieren Sie mit einer Mehrkanalpipette mindestens fünfmal auf und ab, um das BMM zu zerstören.
7. Nicht mehr als 5 min bei 37 °C und 5% _{CO2 inkubieren}.
8. Mit einer Mehrkanalpipette mindestens fünfmal auf und ab pipettieren, um die Organoide zu dissoziieren.
9. Drehen Sie bei 300 x g für 5 min bei RT.
10. Verwerfen Sie den Überstand, indem Sie die Platte umkehren. Fügen Sie das in Schritt 6.3 gesammelte Medium zu den entsprechenden Vertiefungen zurück und resuspendieren Sie die Zellen, indem Sie 5 Mal nach oben und unten pipettieren.
11. Die fluorogene Sonde in der Endkonzentration von 1 μM zugeben. 1 μL pro Vertiefung aus der 250 μM Verdünnung zugeben und 30 min bei 37 °C und 5% _CO2 inkubieren.
    HINWEIS: Fügen Sie die fluorogene Sonde nicht zu den Vertiefungen hinzu, die für die Einstellungen des Geräts erforderlich sind (Abbildung 2B).
12. Drehen Sie bei 300 x g für 5 min bei RT.
13. Resuspendieren Sie die Zellen mit 250 μL 0,1 μg/mL DAPI-Lösung. Übertragen Sie die Proben in die richtigen Durchflusszytometrieröhrchen, halten Sie die Röhrchen auf Eis und fahren Sie mit der Analyse fort.
    HINWEIS: Fügen Sie PBS anstelle von DAPI zu den Vertiefungen hinzu, die für die Einstellungen des Instruments erforderlich sind (Abbildung 2B).
14. Optimieren Sie die Vorwärts- und Seitenstreuspannungseinstellungen für nicht gebeizte Steuer- und Laserspannungen für jeden Fluorophor mit monogefärbten Proben.
15. Sammeln Sie mit einer geeigneten Gating-Strategie (Abbildung 4A) mindestens 20.000 Ereignisse.
    HINWEIS: 50.000 Veranstaltungen werden bevorzugt. Detaillierte Erfassungseinstellungen variieren je nach verwendetem Gerät.

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Ergebnisse

Als Proof of Concept des beschriebenen Protokolls wurden die aus der Lgr5-eGFP-IRES-CreERT2 Mauslinie gewonnenen Krypten verwendet, in denen Darmstammzellen eine von Barker et al. etablierte Mosaik-GFP-Expression aufweisen, um ^{Darmstammzellen10} zunächst zu charakterisieren und diese Zellen anhand ihrer GFP-Expression abzubilden. Dabei wird ein Modell bereitgestellt, um die ROS-Spiegel in einer bestimmten Zelltyppopulation bei verschiedenen Behandlungen zu vergleichen. Ein ROS-Inhibitor (NAC) wurd...

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Diskussion

Diese Arbeit bietet ein Schritt-für-Schritt-Protokoll zur Isolierung muriner Jejunalkrypten, zur Kultivierung zu 3D-Organoiden und zur Analyse von ROS in Organoiden durch Kombination einer ROS-empfindlichen fluorogenen Sonde mit qualitativer Mikroskopiebildgebung ganzer Organoide und quantitativer ROS-Messung mittels Durchflusszytometrie an einzelnen Zellen nach Organoiddissoziation.

Der erste kritische Schritt in dieser Methode ist das Extraktionsverfahren für Krypten. In der Tat ist die Qu...

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Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
Mice
Lgr5-EGFP-IRES-creERT2 (Lgr5-GFP)	The Jackson Laboratory
Growth culture medium
Advanced DMEM F12 (DMEM/F12)	ThermoFisher	12634010
B-27 Supplement, minus vitamin A	ThermoFisher	12587010	Stock Concentration: 50x
GlutaMAX (glutamine)	ThermoFisher	35050038	Stock Concentration: 100x
Hepes	ThermoFisher	15630056	Stock Concentration: 1 M
Murine EGF	R&D	2028-EG-200	Stock Concentration: 500 µg/mL in PBS
murine Noggin	R&D	1967-NG/CF	Stock Concentration: 100 µg/mL in PBS
Murine R-spondin1	R&D	3474-RS-050	Stock Concentration: 50 µg/mL in PBS
N-2 Supplement	ThermoFisher	17502048	Stock Concentration: 100x
Penicillin-Streptomycin (P/S)	ThermoFisher	15140122	Stock Concentration: 100x (10,000 units/mL of penicillin and 10,000 µg/mL of streptomycin)
Material
70 µm cell strainer	Corning	352350
96-well round bottom	Corning	3799
ball tip scissor	Fine Science Tools GMBH	14086-09
CellROX® Deep Red Reagent	ThermoFisher	C10422
DAPI (4’,6-diamidino-2-phénylindole, dichlorhydrate) (fluorgenic probe)	ThermoFisher	D1306	stock at 10 mg/mL
DPBS 1x no calcium no magnesium (DPBS)	ThermoFisher	14190144
FLuoroBrite DMEM (DMEM no phenol red)	ThermoFisher	A1896701
Hoechst 33342	ThermoFisher	H3570	stock at 10 mg/mL
Matrigel Growth Factor Reduced, Phenol Red Free (Basement Membrane Matrix)	Corning	356231	once received thaw o/n in the fridge, keep for 1h on ice and, make 500 mL aliquots and store at -20 °C
µ-Slide 8 Well chambers	Ibidi	80826
N-acetylcysteine (NAC)	Sigma	A9165
tert-Butyl hydroperoxide (tBCHP)solution (70%wt. In H2O2)	Sigma	458139
TrypLE Express Enzyme (1X), no phenol red (trypsin)	ThermoFisher	12604013
UltraPure 0.5 M EDTA, pH8.0	ThermoFisher	15575020
Y-27632	Sigma	Y0503	Rock-inhibitor to be used to minimize cell death upon tissue dissociation
Programs and Equipment
Attune NxT (Flow Cytometer)	ThermoFischer		Flow cytometer analyzer
Fiji/ImageJ	https://imagej.net/software/fiji/downloads		images generation
FlowJo	BD Bioscience		FACS analysis
Observer.Z1	Zeiss		confocal system
Opterra (swept-field confocal)	Bruker		confocal system
high speed EMCCD Camera Evolve Delta 512	Photometrics		confocal system
Prism	GraphPad Software		statistical analysis