体内 猪后肢背屈等距扭矩的测量

摘要

本方案描述了通过电刺激麻醉猪的腓骨共同神经获得的体内扭矩数据的评估和解释的简明实验细节。

摘要

骨骼肌力量的可靠评估可以说是神经肌肉和肌肉骨骼疾病和损伤研究中最重要的结局指标，特别是在评估再生疗法的疗效时。此外，翻译许多再生疗法的一个关键方面是在大型动物模型中展示可扩展性和有效性。已经建立了各种生理制剂来评估基础科学研究中的内在肌肉功能特性，主要是在小动物模型中。这些实践可以分为: 体外 （孤立的纤维，纤维束或整个肌肉）， 原位 （具有完整的血管形成和神经支配但远端肌腱附着在力传感器上的肌肉）和 体内 （肌肉或肌肉单元的结构保持完整）。这些准备工作各有长处，也有短处。然而， 体内 强度测试的一个明显优点是能够在同一动物中进行重复测量。本文介绍了可靠地评估体内后肢背屈肌响应于麻醉猪 中 标准腓神经电刺激而产生的等距扭矩的材料和方法。

引言

骨骼肌的主要功能是产生力量，这最终使呼吸，进食和行走等活动成为可能。降低骨骼肌功能能力的疾病可导致表现下降（职业或运动），残疾或死亡。例如，老年人群肌肉质量和功能的维持与生活质量以及进行日常生活的基本和工具性活动的能力呈正相关^1，2。而且，杜氏肌营养不良症患者的肌肉力量下降导致无法行走和呼吸衰竭，最终导致过早死亡^3，4，5。因此，肌肉力量测量是涉及神经肌肉疾病或损伤的研究的关键结局测量。

在临床研究中，最大自愿等距或等速扭矩（和/或疲劳指数）通常用作功能能力的指标⁶.在动物研究中，可以在麻醉下使用电神经刺激在体内进行类似的测量。值得注意的是，体内制剂是微创的，肌肉组织，肌腱，脉管系统和神经支配保持完整，因此允许重复的功能评估^{7，8，9，10，11}。该制剂通常用于小型啮齿动物模型，并在较小程度上用于较大的动物模型，例如兔子¹²，狗^13，14，绵羊¹⁵和猪^16，17。这种方法的一般使用可能对许多转化研究产生影响，例如在脊髓性肌萎缩（SMA）的基因工程猪（猪）模型中¹⁸。本文介绍了评估神经刺激诱导的猪背屈肌群在体内的最大等距扭矩的方法。所提出的技术最初是从最初开发的用于评估小鼠前部肌肉扭矩^19，20的技术中改编而来的，随后通过研究损伤后扭矩产生能力的经验进行了改进^{17，21，22，23，24，25，26，27，28}在开发过程中¹⁶在各种猪模型中。

该协议强调使用需要与称重传感器和电刺激器集成的计算机的方法进行 体内 等距扭矩测量。这里介绍的方法使用市售的集成猪等距脚踏板测试设备，平台设备和相应的软件（参见 材料表）。但是，该方法可以适应使用其他市售或定制的软件，数据采集设备和刺激器。这些方法旨在用于专用的大型动物手术室，该套件中充满了标准设备，例如:锁定手术台，用于测试平台，呼吸机和监测设备的第二个等高锁定台，以及加热垫或其他设备以保持体温。

需要以下团队成员进行这些方法:一名熟练的麻醉技师和两名研究人员进行功能测试。这些人将共同努力，在平台设备上进行肢体的初始稳定。然后，两名人员中的一名将负责电极放置/定位，另一名负责测试期间的计算机应用。

研究方案

所有动物实验均按照《动物福利法》、实施中的《动物福利条例》以及《实验动物护理和使用指南》的原则进行。先前的测试已经证明，这些方法是可靠的²⁶ ，并且对猪的健康或肢体功能没有不利影响。检测频率高达每周一次，无任何不良事件²³.此外，可以在同一天进行手术前和手术后的干预测试，而不会对动物施加不良压力或诱导神经肌肉功能障碍。

1. 电脑设置

1. 确保设备和组件的初始设置和校准按照制造规范进行（参见 材料表）。建议使用0.2-2.5 kg的砝码范围进行校准。
   注:扭矩由连接到具有50牛顿米（N·m）容量的线性扭矩传感器的140 mm脚踏板（0.14 m）测量。默认情况下，仪器的增益设置为缩放至25 N·m容量，以更好地匹配预期的扭矩产生。校准是通过在已知距离（例如，距旋转轴100 mm）处将已知质量（例如，1 kg）施加到脚踏板上并计算扭矩来执行的。例如，1 kg 等于 9.806 N 施加在 0.1 m 处的扭矩为 0.9806 N·m。然后，可以在施加到扭矩传感器的扭矩与扭矩传感器输出的相应电压之间建立关系。作者的扭矩传感器已经证实了这种关系的线性，从0.2-20 kg应用于特定的40 cm校准板。由于标准踏板的长度，建议校准范围为0.2-2.5 kg。这会产生足够的信号来通过线性回归计算比例因子。
2. 在测试前约30分钟打开计算机，刺激器，传感器系统和模拟 - 数字接口，以稳定可能影响电气性能的热相关材料变化。选择 适当 且 连接 的 数据 采集 （DAQ） 设备。
3. 根据需要在软件中设置实验参数;该软件允许保存的研究模板。准备设置实验（即研究模板）以使用"创建新研究工作簿"选项 创建新研究 。
   注意:可以在开始研究之前预先加载实验参数，这将导致提示包括其他特定实验信息，例如性别，体重，出生日期，测试时间点，治疗组或所需的类似变量。可以保存研究设置参数并在整个实验中使用。
4. 选择之前在每次评估开始时创建的算例。如果这是要测试的猪的第一个测试，请添加 一个新动物 ，并按照提示将变量输入到研究中。
5. 准备好开始研究后，单击" 准备实验 "，这将需要优化电极放置。将重复抽搐传递到神经，同时确定放置电极后的最佳位置（参见步骤3.6）。
6. 首先单击" 配置即时刺激 "，然后调整脉冲频率、脉冲宽度、脉冲数、训练频率和运行时间。
7. 然后，单击 即时SIM卡 以提供重复抽搐。或者，按下刺激器装置上的 手动触发 按钮以手动发出一次抽搐。
8. 在研究方案期间打开 实时数据监视器 ，当准备开始整个实验时，允许收缩的实时调查/可视化。准备开始实验时单击 "运行 实验"（在动物准备之后，请参阅步骤2）。

2. 麻醉准备与维持

1. 快速雄性或雌性猪，40-90公斤，麻醉前过夜事件， 随意用水。在手术当天获取并记录猪的正确体重。
2. 肌内注射瓦他敏/唑并泮（特拉唑，4-6 mg/kg）、甲苯噻嗪（1-3 mg/kg）和丙泊酚（2.6 mg/kg）诱导麻醉。最初 通过 口罩用5%异氟醚维持。
3. 用气管插管给猪插管，并将其放在自动呼吸机上。将猪的峰值压力维持在20 cm H₂O，初始潮气容积为10 mL / kg，呼吸速率为8-12次呼吸/min。
4. 调整呼吸机设置，将潮气末 PCO₂ 保持在 40 ± 5 mmHg。用1%-3%异氟醚在30%-37%O₂中维持麻醉。
5. 在方案期间将猪的体温保持在37°C。根据需要插入耳静脉和 Foley 导管，以进行液体输送和尿液收集。
   注意:使用手术平面麻醉可以防止测试期间的继发性宫缩，特别是来自臀部肌肉的宫缩。
6. 通过眼反射和位置、缺乏下颌张力、心率（范围 80-150 bpm）、收缩压（范围 120-70 mmHg）或所有这些体征的组合来监测麻醉深度。
7. 一旦猪完全麻醉和稳定，准备左右后肢，首先用肥皂和水清洁四肢以清除任何碎屑，然后剃掉皮肤上的头发。密切注意膝关节外侧区域，稍后将用于电极放置。
8. 将猪运送到手术台上，并将其牢固地放在仰卧位。将猪朝向桌子的脚，臀部肌肉位于或略微高于桌子的末端。
   注意:这将允许手术台和容纳测试仪器的手术台与手术台相邻。
9. 测试后拔管猪，让它们恢复。一旦猪完全恢复，应更换标准猪的食物和水，并且可以在笼子内自由行走。
   注意:对于单独的 体内 测试，术后镇痛是不必要的;然而，可以根据兽医建议提供卡洛芬和/或丁丙诺啡SR。鼓励咨询当地兽医。此处列出的麻醉和药物仅供参考，目前已获得明尼苏达大学的批准。用异氟醚维持麻醉的选择基于其快速起效和偏移及其对 体内 神经刺激的最小影响诱发扭矩²⁹。注意在研究中麻醉参数的一致性。在方案期间，以15分钟的间隔进行麻醉评估和记录;记录是根据当地机构动物护理和使用委员会（IACUC）和美国农业部（USDA）的指导方针和要求进行的。

3. 体内 等距扭矩的评估

1. 将脚放在力传感器的脚板上。使用柔性粘性绷带将脚固定在脚板上。
   注意:每只脚的整个角色是必要的;理想情况下，4英寸x 5码的作用就足够了。
2. 将脚固定在脚板上，脚踝位于中性（A）处，并通过将粘性绷带缠绕在脚和脚板上，以封闭篮子编织脚踝胶带（B）的风格将脚固定在板上。
   注意:两名研究人员将被要求同时执行个人（A）和（B）任务。
3. 将脚固定在脚板上后，将脚踝定位为直角，定义为0°或中性，以参考足底或背屈的程度。

图1:来自不同有利位置的图片显示猪连接到脚踏板上，并在框架上进行解剖学对齐。 注意前室肌、腓骨头、膝关节、胫骨平台和股骨的解剖学特征。请注意皮下电极对在腿部外侧的位置。 请点击此处查看此图的放大版本。

4. 以直角稳定膝盖和脚踝。
5. 首先，将肢体夹紧杆放置在靠近所需位置的位置。准备就绪后，从肢体的内侧开始，将肢体夹紧杆对准胫骨平台附近。
6. 然后，将外侧肢体夹紧杆对准股骨头远端。
   注意:在每个肢体的末端之间，夹紧杆使用折叠的4 x 4纱布垫来保护与杆相邻的皮肤。
7. 使用锁定指旋螺钉紧紧稳定杆。
   注意:肢体夹紧杆不会彼此对齐，但会与猪的解剖结构对齐。
8. 通过同心圆的清洁纱布应用70%的酒精，从预期的电极放置中心开始并向外移动，清洁腓骨头周围的皮肤。将无菌经皮针（50 mm，26 G 单极）和肌电图 （EMG） 式电极（参见材料表）放在腓神经上。皮下植入电极，约5-10毫米。
9. 使用增加的电流幅度（在刺激器上调整）优化电极放置。从 100 mA 开始，并根据需要增加。
   注:峰值抽搐扭矩通常需要300-500 mA。
10. 在实时数据视图和猪的前舱上可视化抽搐扭矩大小;蹄子也可以向上伸展和移动。
11. 确保后室或胫神经在刺激期间未被激活。在刺激过程中目视检查并触诊后室收缩和蹄子向下运动。
12. 在以下步骤中，从实时扭矩时间追踪中检查颚骨收缩的平台区域，以发现缺乏拮抗剂肌肉募集（即，该方案的足底屈曲）。
13. 使用以下刺激参数引出最大等距泰坦扭矩:100 Hz，脉冲宽度为 0.1 ms，在 800 ms 列车¹⁷ 上，一旦电极放置和刺激幅度得到优化。
    注意:这些参数可用于各种收缩评估。

4. 扭矩-接头角度分析方案

1. 测量踝关节位置的最大等距扭矩，范围从中性到足底屈曲的近端范围，或足底屈曲的0-50°。
   注意:使用10°增量将需要六次收缩，并且可以针对特定的实验问题调整增量变化。
2. 开始松开测角仪载物台的两个锁定螺钉，以在关节角度之间移动。确保在下次收缩之前拧紧两个锁定螺钉。
   注意:测角仪刻有度数标记，以实现精确对准。它可能是跖屈0°，在测角仪上偏移180°。请小心确保预定位置。
3. 通过实验确定收缩之间的时间;然而，2分钟足以避免疲劳。
   注意:随着踝关节角度的增量变化，针电极可能会移动。如上所述，可能需要确认具有抽搐收缩的电极的位置（参见步骤3.8）。

5. 转矩-频率分析方案

1. 将脚踝定位在所需的关节角度。通过实验，注意每次都以相同的关节角度进行测试。
   注:通常，扭矩-频率分析在单个关节角度下执行，该角度与从扭矩-关节角度分析得出的峰值等轴测扭矩相对应。峰值扭矩在足底屈曲的~30-35°时产生。
2. 在一系列刺激频率上测量最大等距扭矩，这些频率诱导未融合的抽搐序列，直至超过诱导完全融合的tetani的抽搐。
   注意:这可以通过在10，20，40，60和100 Hz（0.1 ms脉冲宽度;800 ms列车）下刺激来实现，每次收缩之间间隔2分钟以避免疲劳。根据确切的实验问题和特定的猪模型，可以调整频率。在800 ms收缩期间最有可能用于维持细胞内ATP的生物能量底物是磷酸肌酸³⁰，磷酸肌酸的再合成依赖于磷酸肌酸穿梭^线31。磷酸肌酸恢复动力学表明，在收缩结束³⁰后90-120秒之间，90%或更显着的恢复。因此，宫缩之间的推荐休息间隔为90-120秒。虽然，这可能受到实验设计的影响，包括肌肉疾病，损伤和/或衰老。

6. 数据分析

1. 单击分析 结果 （如果仍在软件中）以打开"分析"窗口。或者，直接打开分析程序。
2. 无论是使用自动数据平台还是手动分析，都可以在分析单个等轴测波形时计算不同的变量。
   注意:这些变量包括:最大抽搐扭矩、最大抽搐扭矩以及与抽搐和 tetani 相关的收缩特性，例如达到峰值和半弛豫的时间。许多实验变量可以使力正常化，例如，体重，通过MRI（磁共振成像）或CT（计算机断层扫描）确定的肌肉体积或末端肌肉重量。给出了绝对扭矩（N·m）和归一化为身体质量（N·m/kg）的扭矩。放置在脚板上的静止扭矩在实验中会有所不同。应应用静息转矩的基线校正，以确保记录真正的最大抽搐和胎内转矩。记录每个关节角处的基线扭矩，并可以指示被动扭矩的变化。

结果

猪前室的可靠性和 体内 测试参数的优化先前已有^报道26。啮齿动物和猪的扭矩频率比较数据也报告了²⁷。

在 体内 评估期间，需要实时可视化扭矩波形，以确保适当的前室室激活。波形应仅反映背屈。波形应具有平滑、圆润的外观和明显的胎面平台（图2A）。波形的不一致或扰动表明各种实验局限性，例如刺激不足，电极放置不当或麻醉深度不足（图2B）。

图3A 是抽搐转矩时间跟踪，箭头表示50%的最大转矩。时间到峰值收缩应从刺激器开始时开始，并在达到最大抽搐扭矩时结束（代表性时间条显示在跟踪下方）。抽搐的半松弛应从最大抽搐扭矩开始，到最大抽搐扭矩的50%结束（代表性时间条显示在跟踪下方）。 图3B 是一个泰坦尼克扭矩时间跟踪，箭头表示50%的最大扭矩。与在确定和及时的最大扭矩方面是理想的抽搐不同，颚骨收缩在最大扭矩的时间上具有更大的可变性，涉及刺激器何时开始和结束，需要更细致入微的收缩属性分析方法。时间到峰值收缩应从刺激器的启动开始开始，并在最大扭矩的90%-100%之间停止。 图3B 中的时间条显示最大扭矩为95%的截止值。这在诸如所选代表性数据之类的情况下很有用，因为直到平台阶段的后期才达到最大扭矩。对峰值时间的补充分析是平均收缩率。扭矩时间跟踪的上升边缘上的虚线条表示最大扭矩范围为30%-70%。平均收缩率应在刺激开始时开始，并捕获30%-70%最大扭矩之间的平均收缩率变化。这些是推荐的范围，各个研究小组可以确定50%左右的理想范围（例如，±10%）。重要的部分是在研究内和研究之间保持一致。与抽搐相反，由于上述与峰值时间相同的原因，tetanic收缩半松弛应从刺激结束时开始，而不是最大扭矩。 图3B 中的时间条表示刺激结束和达到50%松弛之间的时间。对半松弛的补充分析是平均松弛率。扭矩跟踪下行肢体上的虚线条表示与上升肢体相同的30%-70%最大扭矩范围。平均松弛率应从刺激结束时开始，并捕获30%-70%最大扭矩之间的平均变化率。同样，这些是建议的范围。一个关键的注意事项:不要将平均收缩/松弛率与最大收缩/松弛率混淆。最大速率表示两个相邻数据点之间最显著的速率变化，并且可以变化很大。

可以分析几种抽搐和收缩特性，以深入了解骨骼肌的纤维类型和激发 - 收缩耦合属性^10，32。警告过度解释抽搐和收缩特性;它们代表了进一步细胞水平询问的建议和理由，并不一定是指示性的。一般来说，收缩率可以反映肌质网钙释放和肌球蛋白重链同种型酶促率。相反，松弛率可以反映肌节（内）质网钙ATP酶的速率和亚型。这些特性可能受到疲劳、肌肉损伤、运动训练和许多病理（例如，废用萎缩）的影响。

图4描绘了未受伤肢体的扭矩-频率和扭矩-关节角度关系的代表性值。这些数据代表了各种猪的大小。

在体内肌肉分析期间对表面肌电图进行了具有代表性的实验分析（图5），以证明速率编码和总肌肉活动的实验控制。将粘性肌电图电极放置在peroneus tertius的腹部中部。将研磨电极放置在膝关节上以尽量减少刺激伪影，并将刺激电极针放置在腓神经近端肌肉位置周围。在20，60和100 Hz的刺激频率下同时进行扭矩和肌电图记录。刺激器脉冲的数量（图5中的红色条）反映了刺激持续时间和脉冲之间的时间商。例如，20 Hz的刺激频率意味着每50毫秒一个脉冲;因此，400 ms刺激持续时间除以脉冲之间的50 ms等于8个脉冲的传递（图5A）。刺激器脉冲通过经皮针电极放置传递到神经轴突，并产生相似数量的电肌肉脉冲（即，20 Hz等于8个肌电图记录），证明了对目标肌肉群的作用电位频率的实验控制。原始肌电图记录可以通过均方根分析（EMG RMS）进行转换，以可视化刺激频率增加的总肌肉活动。曲线下面积（AUC）分析是量化肌电图RMS以确定整个肌肉活动变化的一种方法。为每个肌电图RMS刺激频率提供代表性的AUC（图5A-C）。

图 2:具有代表性的高质量和低质量波形。 （A） 等轴测波形以方波外观存在，具有明显的流体平台。（B）低质量波形可能是由于刺激不足或电极放置不当造成的。在这些情况下，需要重新定位电极。对于 A 和 B，都指示刺激器脉冲（红条）。 请点击此处查看此图的大图。

图 3:抽搐和泰坦酸收缩性分析。 （A） 修改了代表性抽搐 （1 Hz） 和 （B） tetanic （100 Hz） 扭矩-时间跟踪，以详细说明收缩特性。每张图表上的红色箭头显示 50% 的最大扭矩。描摹下方的蓝色和黑色条分别显示达到峰值的时间和半弛豫时间持续时间。在 tetanic 扭矩-时间跟踪的上升和下降肢体上的虚线条表示 30%-70% 的最大扭矩范围，可用于确定平均收缩或松弛速率。 请点击此处查看此图的大图。

图 4:扭矩-接头角度和扭矩-频率的示例数据。 提供的数据来自一系列2.9-6.3个月的约克郡十字猪;39.4-75.4公斤体重;在评估时，所有人都认为控制正常。（A）在足底屈曲0-50°的踝关节处评估归一化为体重的扭矩;请注意，峰值扭矩在30°处确定。（B）在10-100 Hz的各种刺激频率下评估归一化为体重的扭矩;请注意，这些评估是用踝关节在足底屈曲的30°处进行的。（C） 评估了每个刺激频率的单独扭矩跟踪。 请点击此处查看此图的大图。

图 5:同时 进行的体内 等轴测扭矩和肌电图测量。 在从雌性约克郡猪（约90公斤体重）收集的（A）20，（B）60和（C）100 Hz的代表性刺激频率下同时进行肌电图和扭矩记录。根据设定的刺激频率传递刺激器脉冲（红条）。将原始肌电图记录转换为均方根（EMG RMS），以可视化刺激频率增加的总肌肉活动。针对曲线下面积（AUC）分析了代表性的EMG RMS曲线，并为每个刺激频率提供了AUCs。 请点击此处查看此图的大图。

讨论

关键步骤、修改和故障排除
为了最大限度地减少数据可变性并最大限度地提高方法的成功率，突出显示了以下关键步骤。

最佳神经刺激
这种实验方法从神经轴突去极化开始，依赖于正确的电极放置和优化的电刺激。对与骨特征点相关的神经解剖结构进行尸检分析有助于在测试期间可视化适当的电极放置。获得最大抽搐转矩有助于确定输送到神经轴突的适当电流（以毫安为单位;mA）。在测试开始时优化神经刺激时，要记住两个值:（1）抽搐与泰坦尼克的比率约为1:5，例如，〜2 N·m抽搐扭矩对应于10 N·m的泰坦尼克扭矩（图3）;（2）对身体质量的典型扭矩为每公斤体重〜0.3 N·m（图4）。如果峰值抽搐扭矩看起来很低，请取下电极并尝试再次放置。请务必检查刺激器设置、BNC 连接和电极连接。如上所述，如果在关节角之间定位肢体期间移动过多，则可能需要在收缩之间重新放置电极（图2）。请注意，实验性和介入性方法可能会影响这些值。

正确的生物力学对齐
起始肌肉长度会影响肌肉收缩力（长度-张力关系），肌肉长度可以根据髋关节、膝关节和踝关节对齐而变化。四肢之间和猪之间的关节角度必须标准化。强烈建议髋关节和膝关节角度为 90°。稍微足底屈曲的踝关节位置（距中性 0° 踝关节角度约 30°）是峰值强度的最佳选择。它反映了猪和狗站立时踝关节的自然解剖位置。所有接头还应与脚踏板和扭矩传感器平行，以避免由于垂直扭矩矢量的贡献而损失可测量的扭矩。强烈建议在将脚固定在脚踏板上并用肢体夹紧杆固定膝关节后，检查髋关节-膝关节角度和脚踏板-关节对齐情况（图1）。如果存在不对中，请解锁并取下杆，并将猪重新定位在手术台上。虽然标准化研究中的关节角对于最小化数据差异至关重要，但生物力学对齐存在显着的局限性，如下所述。

关于现有或替代方法的重要性
可用于猪模型的临床相关和非侵入性肌肉功能评估的替代示例包括跑步机步行距离，肌电图和主动肌肉横波电图。作为人类6分钟步行测试，跑步机步行测试可以评估大型动物的疾病进展和干预成功率^33，34，35。通常，在适应期后，动物在不同的跑步机速度和/或倾斜水平下行走直到顺应性结束。食物奖励通常对于实现最大的动机是必要的。然而，跑步机行走结果仅提供肌肉收缩功能的间接解释，这是由于受试者动机，非最大运动单位募集以及对其他身体系统（如心血管，骨骼和呼吸系统）的固有共同依赖等局限性。

另一方面，肌电图提供了对骨骼肌系统的稍微更好的直接评估，因为肌电图电极直接放置在感兴趣的肌肉群^36，37，38上。然后EMG电极测量集体肌肉活动（去极化肌肉纤维）。这种肌肉活动基于运动单位募集和速率编码（发送到招募的运动单位的行动电位的频率）。然而，使用表面肌电图无法分离运动单位募集与速率编码的相对贡献。此外，肌电图依赖于受试者产生最大收缩的意愿，这种程度的合作在大型动物模型中不太可能。虽然评估步态周期内肌电图的变化可能会有所帮助，但这些数据并不代表目标骨骼肌群的最大功能能力。利用 B 模式和横波弹性成像的超声成像是另一种用于评估肌肉功能的非侵入性方法。通过弹性成像测量的杨氏模量与增加的肌肉负荷^39，40之间存在良好的相关性。横波弹性成像已被验证并用作被动组织僵硬度^{41，42，43，44，45}的定量测量，包括在猪体积肌损失损伤模型²³中。它也可以用作间接测量主动肌肉力量^产生39。然而，与肌电图相似的受试者意愿和合作进行宫缩的限制仍然存在。

与跑步机步行距离和肌电图相比，此处描述的 体内 方案提供了可靠，可重复和最大的肌肉功能评估。该协议以受控的，可量化的方式唤起肌肉收缩，与动机无关。具体而言，经皮电极用于刺激绕过中枢神经系统的神经轴突。神经轴突的去极化使所有运动单元都参与进来，消除了与运动单元募集相关的变异性。此外，研究者控制速率编码（刺激频率）。由此产生的适用于这种方法的神经肌肉生理学始于Ranvier节点处的电压门控钠通道激活。所有后续（或下游）生理学都参与其中，包括激发- 收缩耦合和跨桥循环。 体内 非侵入性肌肉分析的一个显着优点是可以重复测量收缩肌功能，例如每周，以监测损伤，干预或疾病进展后的肌肉力量。

方法的局限性
该协议中描述的 体内 设备允许被动和主动等距扭矩作为关节角和刺激频率的函数。所使用的测试装置不支持动态收缩的测量（例如，等速偏心或同心收缩）。该装置允许105°运动范围来表征扭矩 - 关节角度关系，并使用最大扭矩范围为〜50 N·m的称重传感器。特定的实验问题可能需要这些规格之外的性能特征。值得注意的是，如果需要，该所描述的设备上的称重传感器可以交换为更大的扭矩范围。

本文中描述的测量体内最大神经肌肉强度 的 方案具有显著的局限性。首先，这种方法需要麻醉，根据动物设施协议和资源，麻醉可能以不同的方式进行。已知麻醉剂对神经肌肉功能具有不同的影响，并且已被证明以麻醉剂型和剂量依赖性方式改变小鼠 体内 背屈肌扭矩的产生²⁹。麻醉剂对大型动物 体内 扭矩的差异效应尚不清楚;因此，对照组和实验组必须具有相同的麻醉剂（例如，所有组施用氯胺酮）来控制这种变异性。其次，对 体内 扩散模式的依赖限制了对收缩功能障碍和急性药物毒性的细胞机制的探索。例如，咖啡因可以在分离肌肉的 体外 器官浴测试期间使用，以刺激肌质网钙释放，直接绕过激发 - 收缩偶联⁴⁶ 。诱导这种效应（mM）的咖啡因量 在体内 环境中是致命的。如果将药物用于急性肌肉力量的药物筛查，则需要考虑药物对全身的影响（例如，肾脏/肝脏应激）以及随后分泌到循环中的因素²³.第三，如上所述，使用最大电神经刺激偏离了自愿招募策略，因此不能反映可能由于神经肌肉募集适应引起的力量变化。

在 建立用于实验观察的特定机制方面，体内扭矩测量也可能受到限制。例如，踝关节的扭矩不仅取决于肌肉的力产生，还取决于肌腱和关节以及结缔组织的特性。此外，力是由肌肉群产生的，特别是猪的跖屈肌（腓肠肌，比目鱼肌和足底肌）和背屈肌（腓肠肌，胫骨和手指肌）。因此，对最大 体内 扭矩数据的解释需要考虑潜在的肌肉结构和解剖学变化，并且仅限于肌肉群，而不是单个肌肉。相关地，肌肉群通常由主要快速和慢肌肉纤维的混合物组成，例如分别位于跖屈肌的腓肠肌和比目鱼肌。收缩性质例如收缩和松弛速率（或达到峰值的收缩时间和半松弛时间）不是使用 体内 与孤立的肌肉制剂（例如 体外 或 原位 测试方案）的纤维型生理学的可靠指标⁴⁷。孤立的肌肉制剂在了解生物力学参数对肌肉功能的影响方面也更胜一筹，因为可以精确控制肌肉长度等特性;重要的是要强调关节角度 - 扭矩关系并不直接等同于肌肉长度 - 力的关系，因为肌腱（例如，松弛），肌肉（例如，摆动角，肌节重叠）和关节（例如，力矩臂）属性有助于扭矩产生取决于关节角。为此，大型动物 原位 功能测试⁴⁸ 可能是 体内 测试的宝贵补充，请记住， 原位 测试是一个终端实验。目前方案的其他进展，将来可以探索以改善实验发现的机械洞察力包括使用超声B模式成像来测量肌肉和肌腱的结构特性，以及植入肌腱力传感器来测量自愿和电刺激收缩期间的肌肉力⁴⁹。

该方法的重要性和潜在应用
该协议评估猪背屈肌群的 体内 扭矩产生能力，展示了一种在生理环境中评估肌肉功能增加或丧失的非侵入性方法。由于该方法对猪来说是非终端的，因此它也可用于在疾病进展期间，或在治疗策略之前，期间和之后纵向评估同一受试者的肌肉功能。因此，与独立测量相比，重复测量实验设计可以允许以更大的功率和更少的动物进行稳健的统计比较。此外，骨骼肌功能障碍是各种疾病过程和病症的显着组成部分，例如慢性疾病相关的肌肉萎缩（例如，心力衰竭，肾衰竭，艾滋病，癌症等），肌肉萎缩症，神经退行性疾病（例如，SMA或肌萎缩性侧索硬化症;ALS）、衰老（即肌肉减少症）和药物毒性。骨骼肌功能能力是运动、营养、药物和再生医学治疗等干预措施的关键主要结局指标。因此，本文中描述的可靠地评估猪体内扭矩产生能力 的 方案可用于许多研究应用。它可能有助于获取广泛的动物数据，以翻译开发中的疗法。

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
615A Dynamic Muscle Control LabBook and Analysis Software Suite	Aurora Scientific Inc.	615A	Compatible Win Vista/7/10
892A Swine Isometric Footplate Test Apparatus	Aurora Scientific Inc.	892A	Includes Isometric Load Cell, Pig Footplate, Goniometer stage and positioners
Calibration Weights	Ohaus or similar	80850116
Computer	Aurora Scientific or any vendor	601A	Computer must include data acquisition card and interface for software
Gauze pad	Various vendors		4 by 4 squares or similar
Monopolar Needle Electrodes	Chalgren, Electrode Store,  or similar vendor	242-550-24TP, or DTM-2.00SAF
Non-adhesive Flexiable Tape	3M, Coflex, or similar		4 inch by 5 yard role
Stimulator	Aurora Scientific or comparable	701C	Must include constant current stimulation mode